论文摘要
丝切蛋白磷酸酶Slingshot属于I型酪氨酸磷酸酶家族（Protein Tyrosine Phophotase,PTP）中的双特异性磷酸酶（Dual-specificity phosphatase,DUSP）家族,双特异性磷酸酶家族不同与经典型的蛋白酪氨酸磷酸酶家族,它们既能够去磷酸化酪氨酸（pY）,又能够去磷酸化丝/苏氨酸（pS/T）。目前被报道已知的Slingshot特异性底物是磷酸化的丝切蛋白（p-Cofilin）;Slingshot可以通过调节底物Cofilin的去磷酸化来影响肌动蛋白（F-actin）的聚合与解离,从而参与细胞骨架动力学;另一方面,F-actin会与Slingshot磷酸酶上的某些特定氨基酸或是结构域相结合,从而极大提高Slingshot磷酸酶的活力。最近的研究发现,在一些癌症,阿尔兹海默病及某些血管性疾病中都检测到了 Slingshot磷酸酶的活性异常升高;尽管Slingshot2（SSH2）催化结构域晶体结构在2006时年就被解析出,但目前关于SSH2磷酸酶更为全面深入的底物催化机制及如何被F-actin激活的相关机制并没有详细的说明。一、研究目的:1.Slingshot磷酸酶动力学催化机制研究;2.Slingshot底物选择性机制的研究;3.F-actin激活Slingshot机制研究;4.如何通过我们自己建立的方法高效筛选Slingshot的小分子抑制剂或激动剂;二、研究方法:主要研究方法简述如下:1.通过PCR方法构建一系列Slingshot截短质粒,利用大肠杆菌BL21感受态细胞体外表达Slingshot截短蛋白,用于后期酶活检测;2.选用结构不同的小分子底物及生理底物或是磷酸化短肽检测Slingshot对底物的选择性机制;3.绘制pH依赖性曲线,检测Slingshot磷酸酶的酸碱催化机制;4.绘制底物解离基团依赖性曲线,检测Slingshot对产物小分子解离基团的依赖性大小;5.利用肌肉丙酮粉制备F-actin,以pNPP和p-Cofilin作为底物检测F-actin激活Slingshot机制;6.绘制底物解离基团依赖性曲线,进一步明确F-actin激活Slingshot机制;7.体外Trypsin酶切实验验证F-actin激活Slingshot属于变构激活调节;8.在Slingshot蛋白N端特定位点引入半胱氨酸突变和小分子荧光底物mBBr标记方法,通过连续荧光光谱扫描检测F-actin激活Slingshot分子机制;9.FlAsH-BRET实验用来检测验MCF-7细胞给予NRG刺激时,细胞内Slingshot激活机制;10.利用FlAsH-BRET方法,拓展Slingshot酶活检测探针,可以用来检测不同生理条件下的Slingshot酶活或是筛选小分子抑制剂、激动剂;三、结果:1.SSH2 N端结构域具有自抑制作用通过对已构建好的一些列SSH2不同长度截短蛋白的表达纯化,最后酶活检测发现随着SSH2 N端（1-305）的不断截短,SSH2酶活逐渐增强,相反,N端结构域的存在会抑制SSH2酶活,对生理底物p-Cofilin蛋白的活性检测,同样发现SSH2 N端对生理底物有抑制作用,细胞内检测SSH2全长蛋白和截去N端1-227的截短蛋白酶活相比,同样发现SSH2的N端对酶活有自抑制的作用。对pNPP（单环）,DiFMUP（双环）,OMFP（多环）小分子底物酶活检测发现,SSH2对于多环底物相对于单环底物选择性较好;SSH2 N端233-305结构域对于生理底物的识别起着关键作用,没有233-305区域,SSH2不能识别Cofilin无法去磷酸底物。2.SSH2 N端结构域自抑制属于非竞争抑制方式将SSH2 N端1-227结构域在体外表达纯化,与SSH2 233-490和SSH2305-490两个磷酸酶共孵育,检测加入1-227后的233-490和305-490对小分子底物pNPP酶活,发现随着1-227蛋白的浓度不断增加,233-490和305-490对pNPP的亲和力Km值并无变化,而Vmax降低,属于非竞争抑制方式;由于233-305对于生理底物cofilin的识别是必须的,所以检测1-227对SSH2 233-490的Ki抑制常数,同样发现SSH2 N端的抑制是非竞争的方式,即SSH2 N端并不与底物竞争性的结合SSH2活性中心,应该是作用于活性中心外的某些关键氨基酸或是结构域。3.SSH2磷酸酶催化机制属于酸碱催化,并且N端结构域限制了通用酸对产物小分子解离基团的稳定性绘制pH依赖性曲线检测到SSH2 1-490,233-490,305-490的基本催化机理同大部分经典磷酸酶催化机理相似,都属于酸碱催化,通过通用酸和通用碱的作用调节催化;此外,pH profile中,当pH>6之后,1-490的pH曲线要明显比233-490和305-490 pH曲线浅,说明通用酸在1-490催化过程中的作用明显弱于在233-490和305-490中的作用,可能是N端结构域的存在限制了通用酸对小分子解离基团的稳定性作用。绘制Leaving group dependence曲线,发现SSH2 1-490的β1绝对值明显大于其它233-490和305-490两个蛋白,也就是说1-490在N端存在的情况下,通用酸对产物解离基团的稳定性弱于其它两个蛋白。4.F-actin通过解除N端自抑制激活SSH2酶活,增加产物解离基团稳定性将F-actin分别与 SSH2 1-490,SSH2 233-490,SSH2 305-490共孵育,检测SSH2不同截短对生理底物的酶活;结果发现加入F-actin后1-490酶活显著提高,而233-490和305-490酶活基本无变化,说明F-actin可以解除SSH2 N端1-233对酶活的抑制作用;换用pNPP小分子底物检测,同样发现加入F-actin后,1-490和1-455的酶活显著升高,而其它截短蛋白活性并无明显变化。为了验证F-actin的激活机制,我们检测加入F-actin后,SSH2对不同pKa值的小分子底物的解离基团依赖性,结果表明加入F-actin后,1-490的直线斜率变小,接近233-490的β1值,说明F-actin加入之后,通用酸开始发挥作用,底物解离基团稳定性增加,N端对通用酸的限制作用被解除,SSH2酶活升高。5.F-actin激活SSH2属于别构激活体外Trypsin酶切实验证实,加入F-actin后,SSH2 1-490酶切的蛋白片段大小与不加F-actin时蛋白酶切片段大小不同;1-490单独酶切时,酶切后片段大小在40kDa和28kDa,加入F-actin之后,酶切后片段变为44kDa。通过Adman N端降解测序法和SSH2 1-490 一级结构氨基酸序列分析,1-490单独存在时,酶切位点在R66,K291和K450;加入F-actin后,原本暴露在结构表面的K291被F-actin保护起来,免于Trypsin的酶切;而位于第2个a螺旋和第3个β折叠之间loop上的R332在没有F-actin时掩藏在里面,加入F-actin后暴露在结构表面,被Trypine识别并酶切。6.F-actin激活SSH2的分子机制在SSH2 N端特定位点（19,63,78,98,146,161）引入半胱氨酸突变,用小分子荧光底物mBBr标记上述突变的半胱氨酸,同时在此基础上将VYD-loop中的Tyr突变成Trp,通过荧光光谱连续扫面检测N端哪些氨基酸参与了SSH2的构象变化,及N端的哪个位置氨基酸与VYD-loop发生了相互作用。荧光淬灭实验证实了,当SSH2处于静息状态时,C19和C146距离VYD loop较远,而C63,C78,C98,C161 距离VYD-loop较近,当 F-actin激活 SSH2后,C63开始远离VYD-loop,C19则开始靠近VYD-loop。7.细胞内SSH2被F-actin激活的分子机制利用FlAsH-BRET实验验证我们在体外提出的F-actin激活SSH2的机制同样适用于生理条件下的激活机制,将真核表达载体SSH2全长质粒N端23位,63位插入rLuc（海肾荧光素酶）,VYD-loop中插入6个氨基酸的特定位点序列CCPGCC,根据NRG刺激前后,BRET信号强度变化判断出L63在细胞刺激后远离VYD-loop,而23位氨基酸在细胞刺激后BRET信号强度增加,说明23位氨基酸在细胞受刺激后向VYD-loop靠近。8.将SSH2-63-FlAsH拓展成可以检测SSH2酶活的分子探针FlAsH-BRET实验中,通过计算我们发现△BRET值的大小与p-Cofilin去磷酸化程度之间成正相关性,即当△BRET值增大时,SSH2磷酸酶活力增加。根据之前的文献报道,当SSH2 N端21,25,32,36位的丝氨酸被GSK激酶磷酸化之后,SSH2的磷酸酶活力降低;我们在SSH2-63-FlAsH质粒的基础之上,将N端21,25,32,36分别突变成酸性氨基酸Asp和Glu,来模仿磷酸化状态,构建成了新的SSH2-DDEE-63-FlAsH质粒。将上述质粒在细胞中过表达之后,检测ABRET信号,发现ABRET信号强度减弱,突变后SSH2的磷酸酶活力降低,可能与N端氨基酸突变之后,无法使N端结构域从VYD loop解离有关。四、结论:1.SSH2 N端结构域具有酶活自抑制作用,这种抑制方式表现为非竞争抑制。2.SSH2催化机理属于酸碱催化,N端结构域作用于VYD-loop中的通用酸D361,限制其活性,降低通用酸对产物解离基团的稳定性。3.F-actin可以激活SSH2酶活,其激活机制是解除了N端结构域对通用酸D361的限制作用,提高产物解离基团的稳定性。4.F-actin激活SSH2的同时,SSH2构型发生变化,属于变构激活机制。5.荧光淬灭实验,连续荧光光谱检测发现了SSH2 N端参与酶活调节机制中的关键氨基酸分子,63C在SSH2静息时靠近VYD-loop,激活时远离VYD-loop;19C在SSH2静息状态时,远离VYD-loop,激活状态时靠近VYD-loop。6.体外证实的F-actin激活SSH2分子机制同时适用于生理状态下SSH2激活机制。7.拓展了新的FlAsH-BRET探针,用于筛选检测SSH2不同状况下的磷酸酶活力大小,及筛选SSH2小分子抑制剂/激动剂。五、意义:我们的研究发现了SSH2 N端结构域的自抑制作用并阐明了自抑制机制及F-actin激活SSH2的变构调节机制,对于理解Slingshot功能异常导致的各种临床疾病提供理论基础,对于今后相关疾病的预防治疗有重要意义。我们的研究结果不仅揭示了人类Slingshot磷酸酶的自抑制机制和变构激活机制,为将来研究Slingshot信号通路及生理过程提供重要理论基础,有重要意义外,还拓展了新的FlAsH-BRET探针,有助于检测不同生理病理状况下的Slingshot磷酸酶活力大小。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 杨笃晓
导师: 孙金鹏,于晓
关键词: 蛋白酪氨酸磷酸酶,双底物特异性磷酸酶,磷酸化与去磷酸化修饰,非竞争性抑制,变构调节,自动抑制,肌动蛋白激活,荧光共振能量转移
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山东大学
分类号: Q55
总页数: 196
文件大小: 13288K
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