论文摘要
大豆（Glycine max）是我国及世界上重要的油料作物之一。近年来,国内大豆需求量不断增加,传统育种已经不能满足日益增加的需求,从长远发展角度考虑,我国迫切需要获得具有自主知识产权的高产大豆品种。种子成功萌发生成幼苗对植物的生长发育和繁殖至关重要。在农业生产上,作物种子播种后早出苗、出全苗是获得高产的第一步。与谷类作物种子（如水稻、小麦和玉米）相比,大豆种子含有更高的油脂和脂肪酸,在贮藏过程中更易发生老化、导致种子萌发能力降低、田间出苗差,进而影响高产稳产。因此,通过基因工程技术手段与传统育种技术加快大豆育种进程,培育出更多高活力的种质资源,将有助于解决我国的大豆需求问题。种子萌发时,贮存的三酰甘油在脂肪酶的作用下水解成游离脂肪酸,然后通过各种转运蛋白被运进过氧化物酶体进行β-氧化和乙醛酸循环产生糖异生途径的前体物质琥珀酸和苹果酸,进而通过糖异生途径为种子的萌发和幼苗的建立提供能量及生长所必需的碳源。目前关于油料种子萌发的研究对象主要集中在植物激素、植物生长调节剂、光照等方面。然而,从过氧化物酶体、脂肪酸β-氧化等分子机制角度研究种子萌发的报道较少。前人研究报道,拟南芥过氧化物酶体定位的ABC转运蛋白参与细胞内脂质代谢的平衡,相关突变体如atped3的种子不能正常萌发。ABC转运蛋白是一大类重要的跨膜转运蛋白,广泛存在于生物体中,其结构和功能高度保守。目前关于大豆中是否有类似的定位在过氧化物酶体的ABC转运蛋白影响脂肪酸β-氧化和种子萌发,国内外尚未见报道。本研究基于大豆的转录组数据库,利用生物信息学方法分析转运蛋白在大豆种子发育过程中的表达,从中筛选出一个新的ABC转运蛋白基因GmABCA7,并从栽培大豆品种黑农44中克隆出该基因。该基因分子量为2865 bp,由954个氨基酸残基组成。序列分析发现,黑农44的GmABCA7蛋白质序列与数据库公布的Williams 82的Glyma17g10670序列相比,5-端的第81个氨基酸有差异（Williams82:精氨酸;黑农44:组氨酸）。通过实时定量PCR（qRT-PCR）分析发现GmABCA7在大豆的顶端分生组织、根、茎、叶、花、子叶、果荚和不同发育阶段的种子中均有表达,尤其在发育的种子中高度表达。该基因在开花后14天至22天的种子中高度表达,并且在开花后18天的种子中表达量最高。结果表明GmABCA7参与大豆种子发育的调控。大豆GmABCA7与过氧化物酶体标记蛋白在烟草叶表皮细胞中共表达时,该蛋白与标记蛋白的荧光信号完全重合。提取瞬时转化烟草叶片的原生质体,在激光共聚焦显微镜下观察到原生质体的荧光信号与烟草叶片的一致。结果表明,GmABCA7定位在过氧化物酶体。通过浸花法将GmABCA7转入野生型拟南芥植株中,筛选到三个纯合转基因植株（OE-1、OE-3和OE-4）。在体视显微镜下观察来自WT（wild type）和GmABCA7过量表达植物开花后14天的种子和成熟干燥种子的表型,发现转基因株系和WT之间的种子表型和千粒重没有显著差异。表明GmABCA7不影响种子发育相关表型。油料种子中贮藏着大量的脂质。为了验证拟南芥中GmABCA7的过量表达是否影响了种子中主要脂肪酸的水平,对GmABCA7转基因拟南芥植株干燥种子的脂肪酸含量进行检测。结果表明,GmABCA7的过量表达显著降低了OE-1中C18:1和C18:2的含量,而OE-3中C18:1和C18:2的含量显著增加。C18:3含量在三个转基因株系中均显著增加。与WT相比,OE-1和OE-4中C20:0含量显著增加。但是,三个转基因株系中种子的总油脂含量没有明显变化。结果表明过量表达GmABCA7改变了拟南芥种子脂肪酸的组成,但不改变种子中总油脂的含量。糖、蛋白质和淀粉也是种子中的主要贮藏物质。为了检测GmABCA7的过量表达是否影响种子的糖、蛋白和淀粉含量,我们测定了GmABCA7转基因植株成熟干燥种子的糖、蛋白和淀粉含量。结果表明,成熟干燥的转基因种子中糖、蛋白质和淀粉的含量均没有显著变化,仅OE-3和OE-4中果糖的含量有显著增加。表明GmABCA7的过量表达对拟南芥种子中脂质、糖、淀粉和蛋白质的积累没有显著影响。由于GmABCA7定位在过氧化物酶体,进一步验证GmABCA7是否参与脂肪酸降解代谢途径,影响种子的萌发。我们将WT和GmABCA7转基因植株的种子在1/2 MS培养基上培养,并以胚根突破种皮作为萌发标志来计算萌发率。24小时后,GmABCA7转基因植株种子的萌发率达20%以上,而WT中仅观察到10%的种子萌发;转基因植株种子的发芽率高出野生型12.96%18.52%。继续培养48小时后,野生型和转基因植株种子均全部萌发。这些结果表明GmABCA7的过量表达促进了拟南芥种子的萌发。植物激素脱落酸（ABA）和赤霉素（GA3）在种子休眠和萌发过程中起重要作用。使用0.3μM、0.5μM和1.0μM浓度梯度的外源激素ABA和GA3处理野生型和转基因植物的种子。结果表明,两种激素处理下转基因种子仍然比野生型种子提前萌发。以上结果表明,与野生型相比,ABA和GA3可能不会改变GmABCA7转基因种子提前萌发的表型。为了进一步研究GmABCA7在种子发育和萌发过程中的功能,我们检测了糖异生途径的前体物质琥珀酸和苹果酸的含量。与野生型相比,成熟干燥种子中琥珀酸和苹果酸的含量显著升高。该结果表明GmABCA7对种子发育过程中的β-氧化过程具有积极影响,从而促进琥珀酸和苹果酸在种子中的积累。然后,我们用蒸馏水将种子浸泡在37℃、72 h的条件下以启动种子萌发,并检测琥珀酸和苹果酸的含量以及种子萌发期间GmABCA7的表达水平。研究发现GmABCA7过量表达植株种子中的琥珀酸和苹果酸水平显著升高,且GmABCA7在种子萌发期间高度表达。结果表明GmABCA7的过量表达可以增强转基因拟南芥种子过氧化物酶体中脂肪酸的β-氧化。综上所述,大豆ABC转运蛋白基因GmABCA7在拟南芥中的过量表达影响了脂肪酸的β-氧化并促进种子萌发。这为研究大豆ABCA转运蛋白调控植物脂质代谢提供了理论依据,也为农业生产中加快育种进程,培育高活力种子及实现作物高产稳产提供新的研究思路。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 李健春
导师: 王邦俊
关键词: 过氧化物酶体,拟南芥,种子萌发
来源: 西南大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,生物学,农作物
单位: 西南大学
分类号: Q943.2;S565.1
DOI: 10.27684/d.cnki.gxndx.2019.000006
总页数: 77
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