首页> 正文

苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因的发掘与活性分析

2020-12-02阅读(995)

苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因的发掘与活性分析

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）因对多种农业害虫具有特异的杀虫活性,且对非靶标生物安全、环境友好等优点,使其成为世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂。其杀虫活性主要源自于菌株本身所产生的杀虫蛋白,这些杀虫蛋白主要由cry基因和vip基因编码,其中cry基因已被应用于转基因作物20余年。因此,发掘Bt杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。目前杀虫基因发掘的主要手段是高通量测序技术,但是由于测序价格较高,且菌株资源库中的重复菌株较多,会造成较大的资金浪费,迫切需要建立大量菌株的比较分析方法,以去除重复菌株,获得用于杀虫基因发掘的菌株。当大量菌株测序完成后,后续通常花费较多时间对菌株的基因组测序数据组装和杀虫基因注释,因此提高杀虫基因发掘效率是十分必要的。现阶段对Bt杀虫基因的发掘仍然具有很大需求,由于某些害虫对现有的Bt杀虫蛋白不够敏感,缺少对某些新靶标害虫具有活性的Bt杀虫蛋白,以及害虫对转基因作物表达的Cry蛋白的抗性问题,因此发掘杀虫活性高且与转基因作物中的Cry蛋白无交互抗性的新型Bt杀虫蛋白非常重要。针对上述需求,本论文围绕Bt菌株分离技术、杀虫基因发掘方法和具有杀虫活性的Bt新基因的筛选鉴定展开研究,主要结果如下:1、Bt菌株的分离技术研究:本研究以基于PCR-RFLP技术的Bt杀虫基因指纹图谱为依据对分离的大量菌株比较分析。首先对菌株基因组提取方法改良,改用磁珠法DNA提取技术可以实现快速高通量提取菌株基因组DNA。然后对引物系统改良,增加引物用于检测更多的杀虫基因。PCR-RFLP图谱分析系统改良,利用基于毛细管电泳系统原理的核酸片段分析仪可以分析比较大量菌株的PCR-RFLP图谱,并且大量菌株的图谱信息可以以数字化的形式输出。进一步结合生物信息学方法计算菌株PCR-RFLP图谱的相似性,最终可以实现对分离的大量菌株中的重复菌株进行去除,获得可用于进一步杀虫基因发掘的菌株。2、Bt菌株混合基因组测序数据中杀虫基因发掘研究:本研究首先模拟了1个Bt菌株混合基因组原始测序数据,然后测试了不同基因组组装软件的组装效果,包括单菌基因组组装软件（IDBA、Velvet）和宏基因组组装软件（IDBA-UD、MetaVelvet）,结果显示IDBA-UD软件组装结果最佳,获得的N50及平均序列长度最长。宏基因组基因预测软件MetaGeneMark预测结果显示IDBA-UD组装结果对应预测到的编码基因N50最长。杀虫基因预测结果显示IDBA-UD对应的编码基因库中发掘到的杀虫基因数量最多,达到14个Bt菌株杀虫基因总数的78%。3、具有杀虫活性的Bt新基因筛选:本研究利用二代测序技术分析了78个Bt菌株的基因组,从中获得了大量与已有杀虫基因具有相似性的新基因。对部分（96个）新基因进行杀虫活性筛选,其中包括第一等级的新基因31个,第二等级的新基因48个,第三等级的新基因16个,第四等级的新基因1个。将这些新基因在大肠杆菌中克隆和表达,结果显示有92个新基因可在大肠杆菌Rosseta（DE3）中表达。最后对表达的蛋白进行杀虫活性分析,结果筛选获得了1个对鳞翅目害虫小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性的新型杀虫基因cry9C-like,而其余91个新基因对几种常见鳞翅目害虫和鞘翅目大猿叶甲未表现出杀虫活性。4、新型Bt杀虫蛋白Cry9Cb1的鉴定:对上面研究中筛选出的cry9C-like新型杀虫基因展开研究,首先将基因序列提交至NCBI GenBank中,获得登录号MK005301,并被Bt毒素命名委员会命名为cry9Cb1。该基因在Bt无晶体突变株HD73-中可以表达约130 kDa的蛋白,原子力显微镜观察发现该蛋白为球形晶体蛋白。生物活性测定结果表明Cry9Cb1对多种鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性,其中对小菜蛾LC50值为0.38μg/mL,对亚洲玉米螟LC50值为1.28μg/mL,对水稻二化螟LC50值为0.50μg/mL。对小地老虎和东方黏虫表现出中度的杀虫活性,LC50值分别为130.22μg/mL和244.77μg/mL。亚洲玉米螟对Cry9Cb1与Cry1Fa不产生交互抗性。Cry9Cb1对小菜蛾的最小活性区位于72T657V,对亚洲玉米螟的最小活性区位于68D655A。食用安全性评价结果表明:Cry9Cb1与已知过敏蛋白无序列同源性,并且在热处理及模拟胃肠液中快速降解和失活。总而言之,本论文从Bt杀虫基因发掘上展开研究,发掘方法的改良对提高Bt杀虫基因发掘效率具有重要作用;筛选和鉴定高毒力的新型杀虫基因将为Bt杀虫剂的改良和Bt转基因作物的研制奠定良好的基础。

论文目录

  • 摘要
  • 英文摘要
  • 1 引言
  •   1.1 苏云金芽胞杆菌
  •     1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介
  •     1.1.2 Bt的生态分布
  •     1.1.3 Bt的分离方法
  •     1.1.4 Bt的杀虫过程
  •   1.2 Bt的杀虫毒素
  •     1.2.1 Bt毒素的命名
  •     1.2.2 晶体毒素
  •     1.2.3 分泌型毒素
  •   1.3 Bt杀虫基因鉴定方法
  •   1.4 Bt的应用
  •     1.4.1 Bt制剂
  •     1.4.2 Bt转基因作物
  •     1.4.3 Bt杀虫蛋白应用中遇到的问题
  •   1.5 Bt转基因作物中Cry蛋白的食用安全性评价
  •   1.6 Cry9 类蛋白的研究进展
  •   1.7 本研究的立题依据和目的意义
  •     1.7.1 立题依据
  •     1.7.2 研究目的与意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 Bt菌株的分离技术研究
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 实验方法
  •   2.2 Bt菌株混合基因组测序数据中杀虫基因发掘研究
  •     2.2.1 实验材料
  •     2.2.2 实验方法
  •   2.3 具有杀虫活性的Bt新基因筛选
  •     2.3.1 实验材料
  •     2.3.2 实验方法
  •   2.4 新型Bt杀虫蛋白Cry9Cb1 的鉴定
  •     2.4.1 实验材料
  •     2.4.2 实验方法
  • 3 结果与分析
  •   3.1 Bt菌株的分离技术研究
  •     3.1.1 菌株基因组提取方法改良
  •     3.1.2 引物系统改良
  •     3.1.3 PCR-RFLP图谱分析系统改良
  •     3.1.4 PCR-RFLP图谱数字化
  •     3.1.5 PCR-RFLP图谱相似性分析
  •     3.1.6 PCR-RFLP图谱的系统发生树
  •   3.2 Bt菌株混合基因组测序数据中杀虫基因发掘研究
  •     3.2.1 不同基因组组装软件组装结果比较
  •     3.2.2 编码基因预测结果比较
  •     3.2.3 杀虫基因预测结果比较
  •   3.3 具有杀虫活性的Bt新基因筛选
  •     3.3.1 杀虫基因预测
  •     3.3.2 Bt新基因在大肠杆菌中的表达
  •     3.3.3 Bt新型蛋白的生物活性分析
  •   3.4 新型Bt杀虫蛋白Cry9Cb1 的鉴定
  • SP663 基因组测序、组装和注释'>    3.4.1 原始菌株BtSP663 基因组测序、组装和注释
  • SP663 特性分析'>    3.4.2 原始菌株BtSP663 特性分析
  •     3.4.3 cry9Cb1 基因的克隆和测序
  •     3.4.4 Cry9Cb1 序列同源性分析
  • HD73-无晶体突变株中的表达'>    3.4.5 cry9Cb1 基因在BtHD73-无晶体突变株中的表达
  •     3.4.6 Cry9Cb1 蛋白的生物活性分析
  •     3.4.7 Cry9Cb1 蛋白最小活性区的确定
  •     3.4.8 胰蛋白酶消化Cry9Cb1 蛋白
  •     3.4.9 Cry9Cb1 蛋白的热稳定性评价
  •     3.4.10 Cry9Cb1 蛋白在模拟胃肠液中的消化稳定性评价
  •     3.4.11 热处理和消化后的Cry9Cb1 蛋白杀虫活性分析
  •     3.4.12 Cry9Cb1 与已知过敏蛋白序列同源性分析
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 单月明

    导师: 向文胜

    关键词: 苏云金芽胞杆菌,菌株分离,杀虫基因发掘,新型杀虫基因

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

    专业: 生物学,有机化工,植物保护

    单位: 东北农业大学

    基金: 国家自然科学基金(No.31872935),国家重点研发项目(2017YFD0201204)

    分类号: Q78;TQ453

    总页数: 124

    文件大小: 6888K

    下载量: 194

    相关论文文献

    • [1].融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化[J]. 南方农业学报 2012(08)
    • [2].Bt杀虫基因研究现状与趋势[J]. 中国科学:生命科学 2016(05)
    • [3].Bt杀虫基因专利保护现状与趋势[J]. 植物保护 2011(03)
    • [4].含融合杀虫基因和VHb基因双价表达载体的构建[J]. 生物技术 2010(03)
    • [5].Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达、纯化及其在棉花中的鉴定[J]. 农业生物技术学报 2020(09)
    • [6].杀虫基因高效植物表达载体的构建[J]. 广西农业科学 2010(09)
    • [7].基于Illumina测序技术挖掘Bt杀虫基因资源[J]. 基因组学与应用生物学 2014(03)
    • [8].转基因抗虫棉凝集素的检测[J]. 河南农业科学 2012(09)
    • [9].Bt杀虫基因在桑粒肩天牛幼虫肠道内生优势菌中的转化研究[J]. 氨基酸和生物资源 2008(03)
    • [10].苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性[J]. 湖南农业科学 2020(02)
    • [11].苏云金芽胞杆菌—开放的基因组与多种功能[J]. 植物保护 2017(04)
    • [12].对草地贪夜蛾高毒力的苏云金杆菌菌株筛选[J]. 中国生物防治学报 2019(05)
    • [13].杀虫基因Cry1Ab的合成、表达及其抗虫性鉴定[J]. 华北农学报 2014(06)
    • [14].鲁棉研38号的选育及其生产管理技术[J]. 山东农业科学 2011(02)
    • [15].两株苏云金芽孢杆菌的基因鉴定及形态和杀蜱作用观察[J]. 中国病原生物学杂志 2020(04)
    • [16].天牛肠道内容物研究进展[J]. 中国植保导刊 2019(12)
    • [17].苏云金芽胞杆菌6618杀虫菌株的分离和鉴定[J]. 激光生物学报 2015(04)
    • [18].转基因作物对生态环境的利弊分析[J]. 生物技术进展 2011(04)
    • [19].一株对美国白蛾高毒力苏云金芽孢杆菌的杀虫基因鉴定[J]. 中国农学通报 2010(03)
    • [20].特异性杀虫基因Bt cry3A在桑粒肩天牛幼虫两种肠道常驻内生菌中的转化和表达[J]. 微生物学报 2008(09)
    • [21].一株对害虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌[J]. 东北林业大学学报 2014(07)
    • [22].棉花新品种:中植棉2号[J]. 农民科技培训 2010(11)
    • [23].植物转基因发明专利延及保护的范围——以双价杀虫基因发明专利侵权案为例[J]. 北京农业 2012(26)
    • [24].如何提高抗虫杂交棉的制种纯度[J]. 山西农业(致富科技) 2008(12)

    标签：;  ;  ;  ;  

    苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因的发掘与活性分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6