猪源mcr-1阳性大肠杆菌耐药性调查及mcr-1基因传播风险评估

论文摘要

上世纪50年代,为治疗革兰氏阴性菌感染的病例,多粘菌素类药物被应用于临床医学和畜牧业,但由于其神经毒性和肾毒性等原因,上世纪80年代后逐渐被新型抗生素取代。而近年来随着多药耐药革兰氏阴性菌,尤其是耐碳青霉烯肠杆菌的出现,多粘菌素作为“抵抗多药耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线”,重新引起了人们的重视。自2015年我国学者首次报道了由具有较高接合频率的流行性质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1后,该基因在动物源大肠杆菌中的检出率逐年升高,且这些耐药菌株的种属呈现多样性。mcr-1位于多种流行性质粒上,这让它能在人、动物和环境中快速、广泛地进行传播。本文将养殖环境中广泛存在的大肠杆菌选作研究对象,从江苏省的两个猪场A和B采集鼻拭子、肛拭子、粪便、土壤、灰尘和水样共六类样品,分离获得mcr-1阳性大肠杆菌83株。采用平板稀释法对这83株阳性菌进行8类共8种抗菌药的药敏试验,而多粘菌素E则采用微量肉汤法进行药敏试验。对这83株阳性菌采用PCR进行其它耐药基因的检测,其中包括:mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5,磷霉素类fosA、fosA3、fosC2,碳青霉烯类 blaNDM-1,四环素类tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（M）,酰胺醇类.floR,共14种耐药基因,以了解mcr-1阳性大肠杆菌在养殖场内的耐药现状。同时通过PCR对mcr-1传播过程中的优势质粒型进行检测,包括IncI2、IncHI2、IncX4和已经报道存在mcr-1基因的IncN、IncP、IncF质粒型共六类,并对这83株采样分离的阳性菌株是否含有环状中间体ISApl1-mcr-1-pap2进行PCR检测。结合实验室保存的56株mcr-1阳性大肠杆菌,对全部139株阳性菌株进行PFGE试验和接合转移试验以了解菌株的亲缘关系和mcr-1基因的传播机制。体外抑菌活性试验结果表明,猪场分离到的大肠杆菌耐药广泛,且存在水平传播的风险。不同样品中分离到的mcr-1阳性大肠杆菌对除美罗培南外的8类8种药物表现出不同程度的耐药性,对氟苯尼考、阿莫西林耐药率均在94%以上,而两个猪场分离的阳性菌株对链霉素和恩诺沙星的耐药性差异较大,结合多重耐药性结果,猪场A的耐药情况比猪场B更严重。耐药基因PCR检测结果表明,猪场分离菌株的耐药表型和耐药基因型基本一致。PCR检测结果发现了一株同时携带mcr-1基因和介导碳青霉烯类药物耐药的blaNDM-5基因的菌株,但是该菌株对美罗培南低敏感,MIC值仅为1μg/mL,两种基因的同时存在,表明耐碳青霉烯类药物的多药耐药革兰氏阴性菌很有可能同时对多粘菌素类药物具有耐受性。PCR检测优势质粒型结果显示,38株阳性菌具有Incl2型质粒,6株具有IncHI2型质粒,6株具有IncX4型质粒,3株具有IncN型质粒,而环状中间体ISApl1-mcr-1-pap2的PCR检测结果为阴性。阳性菌株的PFGE结果表明,mcr-1基因可以以大肠杆菌为载体进行水平传播和克隆传播,且同一猪场内的mcr-1阳性大肠杆菌呈多样性,这大大提高了mcr-的传播概率,也为mcr-1的变异与进化提供了有利条件。139株mcr-1阳性菌接合转移成功率为34.5%,证明mcr-1基因可以通过优势质粒进行水平传播。

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ABSTRACT

符号说明

第一章文献综述

1 养猪场内大肠杆菌的耐药及流行现状

2 细菌的耐药机制

2.1 产生灭活酶

2.2 抗菌药物作用靶位改变

2.3 细菌外膜通透性的改变

2.4 外排泵系统

2.5 形成生物被膜

2.6 交叉耐药性

3 多粘菌素的应用背景

4 质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr-1

4.1 mcr-1基因的发现

4.2 mcr-1基因简介

4.3 mcr-1基因的传播现状

5 研究目的

第二章猪场分离mcr-1阳性大肠杆菌耐药基因检测及耐药性分析

1 材料

1.1 样品来源

1.2 试验菌株

1.3 试验药物

1.4 主要试剂

1.5 仪器与设备

2 方法

2.1 样品采集

2.2 细菌的分离鉴定

2.3 质粒介导的多粘菌素耐药基因检测

2.4 碳青霉烯类耐药基因检测

2.5 磷霉素类耐药基因检测

2.6 四环素类耐药基因检测

2.7 酰胺醇类耐药基因检测

2.8 mcr-1阳性菌质粒型与环状中间体ISApl1-mcr-1-pap2检测

2.9 体外抑菌活性试验

3 结果与分析

3.1 采样与细菌分离鉴定结果

3.2 体外抑菌活性检测结果

3.3 质粒介导的多粘菌素耐药基因检测结果

3.4 碳青霉烯类耐药基因检测结果

3.5 磷霉素类耐药基因检测结果

3.6 四环素类耐药基因检测结果

3.7 酰胺醇类耐药基因检测结果

3.8 mcr-1阳性菌株质粒型与环状中间体ISApl1-mcr-1-pap2检测结果

3.9 耐药表型与耐药基因型分析

4 讨论

5 小结

第三章 mcr-1阳性大肠杆菌的脉冲场凝胶电泳（PFGE）及亲缘关系分析

1 材料

1.1 菌株

1.2 试剂

1.3 仪器

2 方法

2.1 缓冲液

2.2 试验步骤

3 结果与分析

3.1 mcr-1阳性大肠杆菌PFGE结果

3.2 PFGE结果分析

4 小结

第四章 mcr-1阳性大肠杆菌质粒接合试验

1 材料

1.1 菌株

1.2 试剂

1.3 仪器与设备

2 方法

2.1 接合转移试验方法

3 结果

3.1 接合转移试验结果

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 肖珈瑜

导师: 王志强,刘岳龙

关键词: 大肠杆菌,耐药性,传播机制

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD),江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

分类号: S852.61

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000750

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猪源mcr-1阳性大肠杆菌耐药性调查及mcr-1基因传播风险评估

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