猪流感病毒H1N1和H3N2亚型分离鉴定及猪流感二价灭活疫苗的研制

论文摘要

猪流感（Swineinfluenza,SI）是由SI病毒（SI virus,SIV）引起的不同日龄猪只的一种高度接触性呼吸道传染病,其临床特征为体温升高、精神沉郁、食欲减退或废绝、呼吸困难、腹式呼吸和阵发性咳嗽。SIV可损害呼吸道上皮细胞,使患病猪继发多种呼吸道疾病,死亡率增加,并在“禽—猪—人”的种间传播链中扮演着重要角色。不仅给养殖业造成损失,而且对公共卫生造成危害。SI已成为世界性发生和流行的疾病,我国主要以H1N1亚型和H3N2亚型SIV流行为主。本研究2006年和2007年从辽宁和黑龙江两省的疑似SI发病场采集鼻拭子样品进行SIV分离,经过系统鉴定获得H1N1亚型和H3N2亚型SIV各一株,以两分离株作为毒种研制了 SI二价灭活疫苗,为SIV研究和疫苗研发奠定基础。1.H1N1和H3N2亚型SIV的分离鉴定将辽宁省和黑龙江省采集的样品接种SPF鸡胚进行病毒分离培养,利用微量血凝试验、EID50测定、RT-PCR扩增HA和NA基因、测序和序列比对、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、动物回归试验,最后利用两分离株分别制备疫苗进行免疫原性试验。结果显示,两分离株的血凝价均达1:128,病毒含量均达106.5EID50/mL。LN株扩增出H1（668 bp）和N1（615 bp）基因片段,为H1N1亚型SIV。HLJ株扩增出H3（668 bp）和N2（246 bp）基因片段,为H3N2亚型SIV。两分离株均无细菌和霉菌、支原体和外源病毒污染,均使健康易感猪100%（5/5）发病,且两分离株分别制成的疫苗免疫猪对两分离毒的攻毒保护率均能达到100%（5/5）。结果表明,两株分离毒均符合原始毒种的要求。2.猪流感二价灭活疫苗（H1N1 LN株和H3N2 HLJ株）生产工艺优化采用犬肾上皮细胞系（MDCK）培养工艺生产抗原,用甲醛和BEI进行灭活抗原对比试验,然后用国产白油和进口 ISA206佐剂进行乳化工艺对比试验,最后进行健康易感猪的疫苗接种和攻毒保护试验评价。结果显示,BEI因对病毒血凝价影响小、无残留、灭活检验方法易观察和判定,确定为抗原灭活剂。ISA206佐剂因乳化工艺简单,疫苗剂型为水包油包水型、黏度低、易注射,确定为SI疫苗佐剂。ISA206佐剂疫苗接种猪在SIV-H1N1 LN株和SIV-H3N2 HLJ株强毒攻毒后保护率均达100%（5/5）,试验证明SI二价疫苗具有较好的保护效力。3.疫苗安全性试验为评价SI二价灭活疫苗的安全性,采用颈部肌肉注射的方式分别进行了单剂量接种、单剂量重复接种、超剂量接种和非使用日龄猪的超剂量接种安全性试验,疫苗接种猪体温均正常,精神状态及食欲良好,注射部位及全身未见不良反应。结果表明,3批疫苗对猪均安全。4.疫苗最小免疫剂量试验分别以0.25 mL/头、0.5 mL/头、1 mL/头、2 mL/头的剂量颈部肌肉接种各组健康易感猪10头,首次免疫14日后各组猪以相同剂量进行二免,并设立不免疫对照组,二免后14日,各组随机抽取5头猪用SIV-H1N1 LN株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,各组余下猪用SIV-H3N2 HLJ株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,攻毒剂量均为4mL/头。结果显示,对照组攻毒后发病率均达100%（5/5）,0.25 mL剂量免疫猪攻毒后保护率为0,0.5 mL剂量免疫猪攻毒后保护率均达80%（4/5）,1 mL和2 mL剂量免疫猪攻毒后保护率均达100%（5/5）,攻毒结果同时证明HI抗体效价不低于1:160时均能对强毒攻击提供较好的保护。为保证疫苗在整个保存期内均有较好的效力,将疫苗使用剂量定为2mL/头。5.3批疫苗效力试验分别将3批疫苗接种健康易感猪10头,每头猪经颈部肌肉注射2 mL疫苗,首次免疫14日后各组猪以相同剂量进行二免,并设立不免疫对照组,二免后14日,各组随机抽取5头猪用SIV-HIN1 LN株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,各组余下猪用SIV-H3N2 HLJ株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,攻毒剂量均为4 mL/头。结果显示,3批疫苗免疫猪对SIV-H1N1 LN株的攻毒保护率为100%（5/5）、80%（4/5）、100%（5/5）;3批疫苗免疫猪对SIV-H3N2 HLJ株的攻毒保护率均为100%（5/5）。结果表明,3批疫苗均有较好的保护效力。6.疫苗免疫对国内H1N1和H3N2亚型流行毒株攻毒交叉保护试验将疫苗接种4周龄健康易感猪10头,每头猪经颈部肌肉注射2 mL疫苗,首次免疫14日后以相同剂量进行二免,并设立不免疫对照组,二免后14日,各组随机抽取5头猪采用国内流行的H1N1亚型病毒SD731株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,各组余下猪用国内流行的H3N2亚型病毒JS株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,攻毒剂量均为4 mL/头。结果显示,疫苗接种猪对流行毒株SD731和JS株的攻毒保护率为80%（4/5）和100%（5/5）。结果表明,SI二价灭活疫苗接种对国内流行的H1N1亚型和H3N2亚型SIV攻毒具有较好的交叉保护力。7.疫苗免疫持续期试验将疫苗接种4周龄健康易感猪20头,每头猪经颈部肌肉注射2 mL疫苗,首次免疫14日后以相同剂量进行二免,并设立不免疫对照组,每个月采血至6个月,利用血凝抑制试验测定HI抗体效价水平。免疫后3个月,各组随机抽取5头猪采用SIV-H1N1 LN株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,各组随机抽取5头猪用SIV-H3N2 HLJ株（病毒含量106.5EID50/mL）进行攻毒,攻毒剂量均为4 mL/头。结果显示,免疫猪保护率为100%（5/5）,对照组在SIV-H3N2 HLJ株攻毒后发病率仅60%（3/5）,因此,免疫后6个月的攻毒试验未开展。免疫后6个月80%（8/10）免疫猪H1N1和H3N2 HI抗体效价不低于1:160,依据HI抗体效价与攻毒保护的关系,制定免疫持续期为6个月。

论文目录

中文摘要

Abstract

符号说明

第一篇文献综述

1 猪流感的研究进展

1.1 流感的流行历史和分类

1.2 SIV的形态、结构

1.3 SIV蛋白结构和功能

1.4 猪流感的流行情况

1.5 猪流感的诊断方法

1.6 猪流感的预防措施

2 猪流感疫苗的研究进展

2.1 常规疫苗

2.2 重组全病毒灭活苗

2.3 减毒疫苗

2.4 亚单位疫苗

2.5 DNA疫苗

2.6 活载体疫苗

2.7 广谱疫苗

2.8 新型高保护率疫苗

2.9 展望

3 参考文献

第二篇实验研究

第一章猪流感灭活疫苗候选株的筛选

1 材料与方法

1.1 样品来源及处理

1.2 主要试剂

1.3 试验动物

1.4 引物

1.5 病毒分离

1.6 血凝价测定

1.7 鸡胚半数感染量测定

1.8 RT-PCR

1.9 测序和序列比对

1.10 全基因8个节段的进化树分析

1.11 纯净性检验

1.12 分离株对猪回归试验

1.13 分离株的免疫原性试验

1.14 农业部动物流感重点开放实验室对毒种的鉴定

2 结果

2.1 血凝价测定结果

50测定结果'> 2.2 分离株的EID₅₀测定结果

2.3 分离株HA和NA的RT-PCR检测结果

2.4 分离株HA和NA序列比对结果

2.5 分离株的全基因8个节段的进化树分析

2.6 纯净性检验结果

2.7 分离株回归试验结果

2.8 分离株免疫原性试验结果

2.9 农业部动物流感重点开放实验室对毒种的鉴定结果

3 讨论

4 参考文献

第二章猪流感二价灭活疫苗生产工艺研究

1 材料与方法

1.1 毒种及细胞

1.2 主要试剂

1.3 试验动物

1.4 MDCK细胞传代

1.5 制苗用病毒液制备

1.6 血凝价测定

1.7 灭活剂对比

1.8 佐剂和乳化工艺对比

2 结果

2.1 血凝价测定结果

2.2 灭活剂对比结果

2.3 佐剂对比结果

3 讨论

4 参考文献

第三章猪流感二价灭活疫苗安全性试验研究

1 材料与方法

1.1 疫苗

1.2 试验动物

1.3 安全性试验

1.4 免疫后观察指标及处理

2 结果

2.1 单剂量接种安全性试验结果

2.2 单剂量重复接种安全性试验结果

2.3 推荐日龄猪超剂量接种安全性试验结果

2.4 非使用日龄猪超剂量接种安全性试验结果

3 讨论

4 参考文献

第四章猪流感二价灭活疫苗效力试验

1 材料与方法

1.1 疫苗

1.2 攻击用病毒

1.3 试验动物

1.4 最小免疫剂量试验

1.5 3批疫苗效力试验

1.6 疫苗接种对国内流行的H1N1亚型和H3N2亚型SIV的交叉保护试验

1.7 免疫持续期试验

1.8 疫苗接种后HI抗体监测

1.9 攻毒方法

1.10 攻毒后监测

1.11 发病猪判定标准

2 结果

2.1 最小免疫剂量试验结果

2.2 3批疫苗效力试验结果

2.3 疫苗接种对国内流行的H1N1亚型和H3N2亚型SIV的交叉保护试验结果

2.4 疫苗免疫持续期试验结果

3 讨论

4 参考文献

全文总结

附录一农业部动物流感重点开放实验室对毒种的鉴定报告

致谢

论文发表情况

文章来源

类型: 博士论文

作者: 路伟

导师: 朱国强,武华

关键词: 猪流感灭活疫苗,亚型,安全性,效力

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001826

总页数: 142

文件大小: 9695K

下载量: 59

猪流感病毒H1N1和H3N2亚型分离鉴定及猪流感二价灭活疫苗的研制

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢