一、两种方法检测猕猴B病毒抗体的初步探讨（论文文献综述）
冉伟[1]（2021）在《犬瘟热病毒对人SLAM受体适应机制及其在人SLAM转基因小鼠体内复制的研究》文中研究表明犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种多种动物共患传染病。信号淋巴细胞激活分子（Signalling lymphocyte activation molecular,SLAM）为CDV等麻疹病毒属成员感染宿主的主要受体,其在病毒跨种间传播及宿主致病性中起到重要作用。CDV H蛋白在识别病毒SLAM受体,介导病毒入侵和调节病毒毒力中发挥重要作用。近年来,随着生态环境变化和病毒变异,CDV自然宿主已由犬科、猫科和浣熊科等动物扩大到灵长目的猕猴。因此,CDV能否通过人SLAM受体突破物种屏障而传播给人类的科学问题值得我们关注。我们在前期克隆得到CDV人SLAM（hSLAM）受体适应株5804Pe/H-VHS基础上,证实CDV-H蛋白D540G氨基酸突变可介导病毒对表达hSLAM受体的Vero细胞（Vero-hSLAM）有效感染。本研究中,我们进一步通过hSLAM受体阻断试验、H/hSLAM互作三维模型、免疫印迹、H/hSLAM免疫共沉淀、人PBMC体外感染和血清抗体交叉中和保护实验等技术,研究了5804Pe/H-VHS株适应hSLAM受体的分子机制。实验结果表明:（1）D540G突变未改变CDV H蛋白在细胞膜上的表达量（p>0.05）;（2）抗hSLAM单克隆抗体可显着阻断CDV对Vero-hSLAM细胞的感染（p<0.05）;（3）CDV H蛋白D540G突变后可能分别与hSLAM 38位（Q）和41位（S）氨基酸产生分子间作用力;（4）D540G突变未明显增强H/hSLAM蛋白之间相互作用（p>0.05）;（5）5804Pe/H-VHS株能在体外有效感染人PBMC(病毒载量可达104.50TCID50/mL)（p<0.01）,且可明显抑制PBMC的增殖活性（p<0.05）;（6）CDV疫苗免疫血清可对5804Pe/H-VHS株产生交叉免疫作用（p<0.01）。为进一步明确病毒在体内致病性,本研究分别以5804Pe/H-VHS和5804Pe/H株(106.0TCID50)鼻腔感染hSLAM转基因小鼠hSLAM（+/+）/STAT1（-/-）。感染后7天,将小鼠麻醉后进行剖检观察。分别应用RT-PCR和Vero-hSLAM细胞检测组织中病毒载量,通过激光共聚焦技术研究组织中病毒与hSLAM受体共定位情况。上述结果显示,（1）与5804Pe/H感染组相比,5804Pe/H-VHS感染组脾脏显着肿大、增重（p<0.01）;（2）5804Pe/H-VHS感染组中,CDV RNA在脾脏、肺脏中呈强阳性,在淋巴结、胸腺和肾脏呈弱阳性,脑呈阴性,而5804Pe/H感染组,除胸腺呈弱阳性外,其余组织均为阴性;（3）5804Pe/H-VHS感染组在免疫细胞和器官（PBMC、脾脏、淋巴结、胸腺）和上皮组组中病毒载量均显着高于5804Pe/H感染组（p<0.01）;（4）5804Pe/H-VHS感染组脾脏、肺脏和淋巴结中病毒与hSLAM发生共定位,而5804Pe/H感染组中未观察到病毒e GFP荧光。综上,CDV 5804Pe/H-VHS株能体外有效感染人PBMC,并可抑制其细胞增殖活性;病毒感染hSLAM转基因小鼠后,可在其免疫器官和上皮组织中复制。本研究初步揭示了CDV适应hSLAM受体的分子机制,建立了CDV感染小鼠的致病模型,为进一步评估CDV跨种间感染人类的风险提供了研究基础。
刘本波[2]（2021）在《CTLA-4与中国猕猴艾滋病发病进程的关系及其机制的初步研究》文中提出目的:HIV-1/SIV（人/猴免疫缺陷病毒）感染机体后,病毒直接或间接作用会导致机体免疫系统活化,细胞免疫在控制患者体内病毒复制具有重要作用。免疫检查点分子在免疫反应中起着负调控的作用,但其在艾滋病中的作用机制尚不明确。因此,本研究以中国猕猴艾滋病动物模型为研究对象,探究免疫检查点分子CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞抗原4）的表达与中国猕猴艾滋病发病进程的关系,并初步探讨CTLA-4在SIV感染的猕猴中上调的作用机制。方法:本研究以SIV感染的中国猕猴艾滋病动物模型为基础,通过流式细胞术进行全血中CD4+T、CD8+T细胞计数,细胞表面分子HLA-DR、CD38表达水平检测,胞内CTLA-4、Ki67表达水平检测,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测血浆病毒载量。分析CTLA-4表达与CD4+T和CD8+T细胞数量、免疫学指标及病毒学指标的相关性,旨在探究CTLA-4表达与艾滋病疾病进程之间的关系。其次,建立氧化应激细胞模型,通过流式检测CTLA-4表达水平,探究活性氧（ROS）对CTLA-4表达的可能调控。通过病毒感染人T淋巴细胞系和胞外H2O2刺激检测ROS和CTLA-4水平,分析病毒感染及胞外氧化刺激对ROS和CTLA-4表达的影响。采用环磷酸腺苷等化合物刺激PBMC细胞,在基因和蛋白水平检测CTLA-4表达,酶联免疫吸附测定检测化合物刺激、SIV感染的猕猴外周血单个核细胞（PBMC）中蛋白激酶A（PKA）的含量和活化情况,进一步分析CTLA-4上调原因,通过PKA抑制剂处理检测CTLA-4表达水平进一步验证该结果。qPCR检测磷酸二酯酶（PDEs）和环磷酸腺苷（AC）基因表达水平对CTLA-4表达水平的影响,从而阐明SIV感染猕猴后CTLA-4上调的作用机制。结果:SIVmac239感染中国猕猴后,CTLA-4在CD4+T细胞中的表达显着上调,且随着感染进程的推进而变化。CTLA-4在CD4+T细胞中的表达与CD8+T细胞数呈显着正相关,与CD4+T细胞数和CD4/CD8比率呈显着负相关,与增殖活化呈显着正相关,与病毒载量呈显着正相关。CTLA-4表达上调的机制研究发现,病毒感染和H2O2刺激使PBMC中ROS水平升高,但均不会导致胞内CTLA-4表达上调。进一步研究其机制发现,IBMX、dbcAMP和Forskolin均能诱导CTLA-4表达上调;化合物刺激后胞内c AMP浓度增加,PKA活性显着升高,当加入PAK抑制剂时,CTLA-4显着下调;SIV感染急性期,胞内cAMP浓度显着升高,PKA显着活化,AC6型和AC7型显着上调,而PDE3型、PDE4型和PDE5型显着下调。结论:SIVmac239感染的中国猕猴中CTLA-4的表达显着上调,通过胞外氧化刺激探究CTLA-4表达上调的机制发现,艾滋病猕猴动物模型中CTLA-4表达的上调与ROS水平的升高无关。进一步探究其机制发现,SIVmac239病毒感染引起胞内cAMP水平升高,从而使PKA活化,进而导致CTLA-4表达上调。
黄侠[3]（2020）在《猕猴miRNA的鉴定及其在SIV感染个体B细胞中的表达谱分析》文中研究指明在HIV感染早期,随着病毒的大量复制,不仅辅助性T细胞数据急剧下降,而且B细胞也出现数量下降和功能损伤。有研究指出,艾滋病毒感染早期B细胞的状态可影响感染后期机体的免疫应答,可见,研究感染早期B细胞的免疫活动对理解机体的免疫保护机制很重要。但目前有关HIV感染早期B细胞的损伤机制并不十分清楚。miRNA是调控细胞生命活动的新层次,因此,从miRNA角度分析有助于为理解B细胞功能受损机制提供线索。考虑到HIV感染早期患者的病例数量极少,使用模型动物为研究提供了便利。SIV感染的猕猴模型具有与HIV-1患者类似的临床表型,是目前研究艾滋病发病机制及其疫苗和药物药效评价的最佳动物模型。鉴于目前有关猕猴miRNA的特征以及有关猕猴miRNA调控SIV复制的研究并不多见,本研究首先运用同源搜索和RNA测序相结合的方法,分析猕猴基因组中保守miRNA的种类和基因分布特征,并对猕猴miRNA与人miRNA进行比较,探索miRNA基因的进化规律。本研究在猕猴中共鉴定了1558条保守miRNA基因,其中1413条在食蟹猴和恒河猴基因组中均保守存在。有1083条和1150条人类miRNA前体序列分别在食蟹猴和恒河猴基因组中找到同源序列,表明大多数miRNA在进化过程中保守。miRNA基因主要分布在基因间隔和内含子区,miRNA基因簇普遍存在。绝大部分miRNA基因簇在人与猕猴之间保守。RNA测序结果显示,miRNA的相对表达量与进化年龄相关,越古老的miRNA分子拥有更高的表达水平。进一步,对三只SIVmac239感染中国恒河猴的外周血B细胞进行分离,比较了感染后0天,7天和28天B细胞miRNA表达谱的变化,运用edge R包进行差异表达miRNA的筛选,结果表明,感染前后miRNA表达谱差异显着,受到SIV病毒刺激后,大部分miRNA的表达被上调。感染后7天和感染后28天的miRNA表达谱差异不大,大部分miRNA在感染后28天,仍然延续上调模式。进一步采用GO和KEGG对差异显着miRNA的功能进行预测,结果提示表达上调miRNA靶标富集通路前三依次是:MAPK、Ras和癌症中蛋白糖基化相关通路;表达下调miRNA靶标富集通路前三依次是:MAPK、内吞和轴突导向通路。部分差异表达miRNA可通过NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路以及凋亡通路等途径来影响B细胞的活化、增殖与分化。该研究结果为理解miRNA对SIV感染早期B细胞损伤的影响提供了线索。
苏婉[4]（2020）在《人55型腺病毒单克隆中和抗体的制备及表位分析》文中研究指明人55型腺病毒（HAdV55）是近年来发现的由HAdV11与HAdV14重组而来的新型B种腺病毒。由于HAdV55在人群中的预存免疫普遍较低,容易在人群密集的地方如医院、军队、学校等地爆发,可致重症呼吸道疾病甚至死亡,给社会带来严重危害。为减少HAdV55爆发带来的危害,我们亟需一种能够有效阻止其在人群中传播的药物。抗体是指在抗原刺激下由浆细胞产生的一种呈Y字型、对机体具有保护作用的蛋白质,单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的抗体,具有高度均一、仅能针对某一特定抗原表位的特点。抗体与相应抗原结合之后可以阻断抗原对机体的感染,在临床上广泛用于疾病的诊断、治疗及预防,而目前针对可引起严重暴发感染的HAdV55抗体制备的相关研究报道很少,因此本课题拟在本实验室已有HAdV55候选疫苗及HAdV14-55高变区嵌合病毒的基础上,利用单细胞PCR技术,从免疫猕猴中克隆出HAdV55特异性的单克隆抗体,并进行活性分析和表位分析。本论文的主要研究工作概括如下:研究目的获得具有良好结合、中和作用的HAdV55单克隆抗体,以期用于HAdV55的治疗;鉴定抗体与HAdV55的结合表位与中和表位,以期为HAdV55的预防、诊断及抗病毒药物的研发提供研究基础。研究方法利用本实验室已有的HAdV55候选疫苗,免疫中国猕猴;免疫后猕猴采血并分离PBMC,利用流式细胞仪分选出单个的HAdV55特异性的记忆B细胞;利用单细胞PCR技术,获得单克隆抗体基因序列,并将其克隆到表达质粒上,在哺乳动物细胞中表达单克隆抗体;SDS-PAGE蛋白胶电泳后进行考马斯亮蓝染色检测抗体的表达,而后利用ELISA检测抗体的结合活性,利用微量中和实验检测抗体的中和活性;利用HAdV 14-55高变区嵌合病毒（HAdV14-55HVR）分析抗体与病毒作用的中和表位。研究结果利用流式细胞仪共分选了3块96孔板共计276个记忆B细胞,利用单细胞PCR技术克隆获得了具体47对抗体基因,首先选择其中的21对基因进行表达验证,表达之后得到15个具有结合活性的抗体,13个具有中和活性抗体。对其中7个抗体大量表达纯化浓缩之后进行效价测定及表位分析发现,有1个抗体与HAdV55的Fiber表位相互作用,6个抗体与HAdV55的Hexon表位相互作用;这些抗体进行中和效价测定结果显示,其中28A1、28A5、28F3、29A10这4个单克隆抗体具有较高效价,它们的IC50分别为0.2697ng/ml、0.1981ng/ml、0.4025ng/ml、0.5575ng/ml,能够有效的中和完整的HAdV55病毒颗粒。对结合Hexon抗体的中和表位研究发现,抗体中和表位可能为HVR1、HVR2、HVR7,但是需要更多样本量验证。结论通过单细胞PCR技术可快速克隆得到HAdV55特异性抗体基因;通过单细胞克隆法制备得到的抗体具有良好的结合活性、中和活性;通过HAdV14-55HVR鉴定抗体中和表位,推测HAdV55特异性单克隆抗体的中和表位可能为HVR1、HVR2、HVR7,但需要更多的样本量来佐证。
袁伦志[5]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
马丽敏[6]（2018）在《猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的建立与评价》文中指出猴B病毒（Monkey B virus,即Macacine alphaherpesvirus 1）,是一种人畜共患病病原,其在自然宿主猕猴中多呈良性经过,而感染人后可引起脑脊髓炎甚至死亡,是目前确定的35种非人灵长类疱疹病毒中唯一一种已知对人有致病性的病毒,也是我国实验动物微生物学等级及监测国家标准中普通级实验用猴应排除的病原微生物。而目前现有的猴B病毒检测方法存在与人单纯疱疹病毒有交叉反应、步骤繁琐或无法同时检测猴B病毒所有基因型的问题,因此,亟需建立快速、特异、通用检测猴B病毒的方法,对于相关人员暴露后的快速诊断和治疗以及对建立高质量的实验猴群均具有重要意义。目的:建立能同时检测猴B病毒5种基因型的通用实时荧光定量PCR检测体系,并对其进行方法学评价。方法:首先,通过文献调研,确定猴B病毒的gB基因相对保守,从GenBank上下载猴B病毒5种基因型代表株的gB基因序列,使用DNAStar软件对这5种基因型代表毒株进行比对,确定猴B病毒各基因型gB基因的相对保守位置,再将这些保守位置序列与人单纯疱疹病毒Ⅰ型（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）、人单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes simplex virus type 2,HSV-2）的代表株序列进行比对,最终确定碱基错配位置较多的gB基因保守区域设计了两套检测猴B病毒的通用引物和探针,分别为3号和4号通用引物探针检测体系。其次,将设计的两套引物探针进行合成,并分别对其针对HSV-1、HSV-2的特异性进行初步评价。接着,为两套引物探针构建相应的猴B病毒参考品质粒作为模板,对两套检测体系的反应体系(引物浓度、探针浓度、添加Mg2+浓度)和反应条件（退火温度）进行优化,确定了最佳反应体系和反应条件后,初步对其针对gB基因插入pUC19载体后构建的gB基因重组质粒的灵敏度进行评价,从中选取灵敏度较好的一套,建立实时荧光定量PCR检测体系的标准曲线,最后对其分别进行特异性、通用性、敏感性和重复性评价。结果:3号、4号引物探针检测体系在检测HSV-1、HSV-2时,均为阴性。3号引物探针检测体系的最佳反应体系为:Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10μL,探针终浓度为800 nmol/L,上游引物和下游引物终浓度为1000 nmol/L,添加MgCl2终浓度为3mmol/L,模板3μL,加无菌去离子水至20μL;最佳反应条件为:95℃30 s;95℃5s、58℃30 s,40个循环。4号引物探针检测体系的最佳反应体系为:Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10μL,探针终浓度为550 nmol/L,上游引物和下游引物终浓度为800nmol/L,模板3μL,加无菌去离子水至20μL;最佳反应条件为:95℃30 s;95℃5s、62℃30 s,40个循环。再对3号、4号引物探针检测体系针对猴B病毒gB基因重组质粒的灵敏度进行初步评价,发现3号引物探针检测体系的灵敏度优于4号。接着以3号引物探针检测体系建立标准曲线,该标准曲线在1×1071×102 copies/μL模板范围内,相关系数为R2=0.999。方法学评价结果显示,该实时荧光定量PCR检测体系与HSV-1、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒均无交叉反应;该方法可同时检测猴B病毒5种基因型,分别是恒河猴基因型、食蟹猴基因型、日本猕猴基因型、豚尾猴基因型和狮尾猴基因型;其检测恒河猴基因型猴B病毒的检测下限为10copies/μL;5次批内和5次批间实验重复性良好。结论:本研究建立了猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系,并对其进行了方法学评价,该检测体系针对同属疱疹病毒科的HSV-1和HSV-2具有良好的特异性、针对猴B病毒5种基因型具有良好的通用性、针对猴B病毒具有敏感性高和重复性好的特点。为猴B病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒的研发奠定了一定基础,对于临床疑似猴B病毒感染病例的辅助诊断以及猴B病毒流行病学的深入研究,无猴B病毒实验猴群的建立,均有着重要意义。
蔡标,戴陈伟,李舜,武昌俊,刁慧敏,辛及娣,童琳[7]（2018）在《实验猕猴B病毒抗体检测结果分析》文中提出目的研究实验猕猴B病毒抗体阳性情况。方法选取安徽省实验猕猴中心400只猕猴,各采集静脉血5 m L,3 000 r/min离心10 min后,抽取上层血清,采用酶联免疫吸附试验与免疫酶试验检测血清B病毒抗体,观察B病毒抗体阳性率。结果400份有效样本中,B病毒抗体阳性率为36.50%;雌性猕猴B病毒抗体阳性率为36.74%,雄性为为36.22%,两者差异无统计学意义（χ2=0.012,P=0.913）。幼年猕猴B病毒抗体阳性率为30.68%,青年猕猴B病毒抗体阳性率为32.34%,成年猕猴B病毒抗体阳性率为66.67%,差异有统计学意义（χ2=26.200,P=0.000）。结论实验猕猴B病毒抗体阳性率处于较高水平,雌性猕猴B病毒抗体阳性率高于雄性猕猴,成年猕猴B病毒抗体阳性率较高。因此,需加强实验猕猴的管理,以减少B病毒感染,生产出安全性更高的实验猕猴。
胡培宇[8]（2017）在《新型埃博拉疫苗诱导灵长类治疗性抗体研究》文中提出2014年爆发的埃博拉疫情造成西非多国公共安全卫生系统瘫痪并引起全球恐慌,至今尚无有效治疗手段。抗体是治疗突发烈性传染病积极且有效的方式,其中抗病毒血清的应用已有一百多年的历史,如麻疹、甲型肝炎早期治疗及康复者血清治疗埃博拉病毒、H1N1及H5N1病毒感染。康复者血清治疗依然存在很多问题,如安全性、供给不足、质量难以控制并且交叉保护性差。因此,本研究提出:通过多次免疫非人灵长类动物如猕猴,从而获得与人高度同源的高效价抗体。首先,本研究利用团队成熟的病毒载体疫苗平台,在已构建完Zaire型、Sudan型埃博拉病毒及马尔堡病毒腺病毒载体疫苗基础上,继续开发2型腺病毒载体本迪布焦埃博拉病毒疫苗rAd2-BEBOV GP,结果显示,经密码子优化后的本迪布焦埃博拉病毒GP蛋白编码序列成功重组至病毒载体,并能在细胞水平高效率表达全长GP蛋白。接下来,本研究利用酶联免疫法（ELISA）和假病毒微量中和实验对比研究腺病毒载体疫苗、GP蛋白和埃博拉病毒样颗粒（eVLP）三种埃博拉候选疫苗诱导抗体反应的能力,结果显示,无论是单次免疫还是两次免疫,在小鼠和中国猕猴中腺病毒载体疫苗均可迅速诱导高水平的结合抗体和中和抗体。本研究通过优化配伍多种亚型腺病毒载体疫苗,并联合GP蛋白疫苗和eVLP疫苗反复免疫中国猕猴,获得可有效中和多种亚型丝状病毒假病毒感染的高免血清。我们进一步利用AKTA蛋白纯化系统,优化纯化体系达到较高的IgG回收率,获得一批高纯度灵长类免疫球蛋白IgG,并保留了较高的中和活性。由于中国猕猴抗体基因与人高度同源,使用中国猕猴作为免疫动物制备烈性传染病免疫球蛋白不但可降低异源蛋白的毒副作用,更重要的是,本研究利用多种疫苗反复免疫灵长类动物获得的广谱抗丝状病毒免疫球蛋白IgG是应对不同亚型感染的良策,为防控埃博拉疫情提供了应对方案。
刘波[9]（2017）在《饲养猴群中诺如病毒感染的初步探讨》文中认为人诺如病毒（HumanNorovirus,简称huNoVs）是导致人类非细菌性急性胃肠炎的主要病因,近年来其感染导致的发病率和致死率都在不断升高。所有年龄人群对该病毒感染均敏感。虽然多数人感染诺如病毒后可自愈,但对儿童和免疫缺陷人群仍构成了严重的威胁。诺如病毒分子进化快、人群感染后持续排毒、低剂量感染及传播途径多样性等特点使得诺如病毒暴发流行较为严重,因此感染后快速确诊和及时治疗很重要。研发有效的疫苗不仅可以减轻公共卫生负担,还可以提高国民经济效益和生活质量。然而,目前诺如病毒体外培养体系和体内动物模型的缺乏,给疫苗研发造成极大的阻碍。本研究主要目的是通过对饲养猴群中诺如病毒感染情况的初步探索,为以后建立诺如病毒的非人类灵长类动物感染模型打下基础。为此,本论文主要进行了以下6个部分的研究:1)通过TaqMan荧光定量RT-PCR方法对某人工饲养猴群及某医院患者粪便中的诺如病毒排毒情况进行检测,检测猴群中诺如病毒排毒情况是为后期动物模型构建筛选合适动物和病毒株,检测人群中诺如病毒流行情况为后期人诺如病毒感染动物实验筛选病毒株;2)选取部分阳性样品进行全基因组序列扩增,通过全基因比对可以了解诺如病毒的进化与变异;3)通过PCR扩增得到一株猴源GⅡ.17型诺如病毒的P结构域及P结构域变体基因,进行密码子优化后,在原核表达系统中诱导表达重组融合蛋白,纯化后的蛋白免疫小鼠后制备抗血清,并通过Western Blot和ELISA分析蛋白的抗原性,为后期诺如病毒感染动物后样品检测做准备;4)用含有GⅡ.17型诺如病毒的粪便滤液在自然状态下通过口服感染健康猴子,分析感染后猴子的临床症状和排毒情况,为诺如病毒感染动物模型的构建做初步探索;5)通过ELISA方法对猕猴来源的唾液样本进行分型后,用前面表达纯化得到的P结构域及其变体蛋白进行唾液结合实验,有助于诺如病毒感染机制的研究;6)分离并初步进行猕猴肠上皮细胞的3D培养,为后期诺如病毒常规培养系统的建立及疫苗中和评价奠定基础。通过以上研究,我们得到如下结果:（1）共检测猕猴粪便样品28例,人源粪便样品49例,诺如病毒在猕猴和患者中阳性检出率分别为28.57%、36.73%,确定了诺如病毒可以感染猕猴。（2）通过RT-PCR扩增得到一株GⅡ.17型猴源诺如病毒全基因组序列,Genebank号为:KX356908。此外,还扩增获得了三株GⅡ.4型人源诺如病毒全基因组序列。（3）测序结果表明,我们成功地构建了 P结构域及其变体基因原核表达质粒。SDS-PAGE分析显示,诱导表达P结构域蛋白在超声裂解上清和包涵体中都有,而其变体蛋白主要存在于超声裂解上清中。Western Blot和ELISA结果表明,表达纯化得到的P结构域及其变体蛋白有很好的抗原性和免疫原性。表达的蛋白免疫小鼠诱导的抗体ELISA效价达到1:32 000。（4）攻毒实验结果表明,猕猴口服含诺如病毒的粪便滤液后,虽然没有出现发热、呕吐、腹泻等临床症状（这与健康成年人感染诺如病毒临床表现相一致）,但是具有较为明显的粪便排毒。而且进一步的ELISA分析血清中诺如病毒抗体滴度结果表明,尽管攻毒前2只猕猴血清中均有较高诺如病毒特异性抗体滴度,然而随着感染后时间的推移,ELISA效价有所增加。（5）唾液表型分析发现,猕猴群中唾液表型A、B、AB、H分布比率分别为15.79%、68.42%、14.04%、1.75%。通过正交实验检测猕猴血液样本的ABO分型,发现唾液表型与血液表型相符。当用诺如病毒P结构域蛋白P-RGD或P结构域变体蛋白P△R与唾液样本结合时并未发现明显结合,需进一步实验探讨和验证结果。（6）为得到肠道干细胞来源的肠细胞,我们首先通过EDTA螯合法成功分离到猕猴结肠来源肠上皮隐窝,然后通过基质胶模拟3D环境培养肠隐窝,在生长因子的诱导下可见其生长,然而肠细胞的组织形态及生长规律等特征还有待进一步的验证。结论:本论文通过分析某饲养猴群和某医院诺如病毒的感染情况发现,其阳性检出率分别为28.57%和37.63%。诺如病毒全基因组序列分析表明猴群中的GⅡ.17型诺如病毒与人的同源性高达99%。我们通过基因工程方法获得的猴源诺如病毒P结构域蛋白及其变体蛋白,可用于今后诺如病毒感染的血清学等方面研究。猴群中的诺如病毒再次感染猴子后,在体内能进行复制和粪便排毒,并且能诱导相应的抗体产生。最后,我们还成功分离培养了猕猴肠上皮细胞。总之,本论文的研究为以后建立诺如病毒的非人类灵长类动物感染模型和体外细胞培养模型打下了基础。
贾媛媛[10]（2017）在《猕猴睾丸生殖细胞纯化、培养及基因修饰探索》文中指出人类遗传信息的传递与配子发生过程息息相关,而雄性配子发生则承担了其中一半的重担。目前绝大部分科学家都是利用啮齿类动物小鼠作为模式动物来研究男性配子发生过程中的基因调控机制,但是啮齿类动物与人类存在巨大的生殖间隔,其所能提供的研究线索十分有限。与啮齿类动物相比,灵长类动物在生理生化各方面都与人类十分相似,因而具有更重要的研究价值。虽然小鼠各级生精细胞的分离及精原干细胞培养方法的研究,经过这些年的不断优化已经十分成熟,但是由于材料难以获得,缺乏有效分子标志等原因,对于灵长类各级生精细胞的研究及精原干细胞培养的探索难以取得有效进展。我们通过学习小鼠STA-PUT（Sedimentation Velocity）的实验方法,成功地利用不同年龄的猕猴睾丸组织分离出了精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子、长形精子、以及成熟精子,并且对各期生精细胞进行了特异性分子标志的细胞荧光验证,完成了纯度鉴定。同时,我们成功地对猕猴睾丸进行了白消安造模实验,并对猕猴的精原干细胞培养、基因修饰及细胞移植做出探索,以期得到基因修饰后精原干细胞在猕猴体内再生精克隆。我们利用大鼠精原干细胞的培养液及多种生长因子的组合培养精原干细胞至14天后,对于培养出的细胞克隆进行荧光鉴定,并对其进行基因表达分析,发现符合精原干细胞特征,表达多个特异分子标志物,包括Utf1、Zbtb16、Fgfr3、Dazl。我们将STA-PUT的实验方法应用于猕猴睾丸细胞,成功分离出5个不同时期的生精细胞,并且完成精原细胞的体外维持培养。这些初步获得的各期生精细胞探索,为灵长类动物精子发生过程中基因表达变化、生殖细胞基因修饰,以及灵长类动物精原干细胞体外长期增殖提供了线索。
二、两种方法检测猕猴B病毒抗体的初步探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、两种方法检测猕猴B病毒抗体的初步探讨（论文提纲范文）
（1）犬瘟热病毒对人SLAM受体适应机制及其在人SLAM转基因小鼠体内复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 犬瘟热病毒研究进展 |
| 1.1 犬瘟热概述 |
| 1.1.1 CDV的病原学 |
| 1.1.2 犬瘟热流行病学 |
| 1.1.3 犬瘟热的临床症状与病理变化 |
| 1.2 犬瘟热病毒的基因组结构和功能 |
| 1.2.1 CDV形态结构 |
| 1.2.2 CDV基因组结构 |
| 1.2.3 CDV蛋白及其主要功能 |
| 1.3 犬瘟热病毒致病机理 |
| 1.3.1 信号淋巴细胞激活分子 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒受体相关分子4 |
| 1.3.3 其他受体 |
| 1.3.4 SLAM介导CDV入侵淋巴细胞 |
| 1.3.5 Nectin-4 介导CDV入侵上皮组织 |
| 1.4 犬瘟热病毒基因变异与跨宿主传播 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 犬瘟热病毒5804Pe/H株适应人SLAM受体的机制研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养与病毒增殖 |
| 2.2.2 hSLAM抗体阻断试验 |
| 2.2.3 CDV H与hSLAM蛋白同源建模与蛋白对接分析 |
| 2.2.4 Western blot检测H蛋白表达量 |
| 2.2.5 免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白相互作用 |
| 2.2.6 人外周血单个核细胞（PBMC）分离与培养 |
| 2.2.7 CDV体外感染人PBMC |
| 2.2.8 抗体交叉中和试验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒滴度测定结果 |
| 2.3.2 hSLAM抗体阻断试验结果 |
| 2.3.3 CDV H与 hSLAM相互作用三维结构预测结果 |
| 2.3.4 Co-IP检测CDV H与hSLAM受体之间的相互作用结果 |
| 2.3.5 D540G突变对CDV H蛋白表达量的影响 |
| 2.3.6 D540G突变对CDV H蛋白膜表达量的影响 |
| 2.3.7 CDV体外感染人PBMC结果 |
| 2.3.8 抗体交叉中和试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 犬瘟热病毒在hSLAM受体转基因小鼠中复制的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 动物、细胞和病毒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 hSLAM转基因小鼠攻毒 |
| 3.2.2 小鼠组织与PBMC病毒RNA的提取 |
| 3.2.3 小鼠组织中病毒RNA差异表达检测 |
| 3.2.4 小鼠组织中病毒载量测定 |
| 3.2.5 CDV与hSLAM受体体内组织共定位 |
| 3.2.6 数据统计与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 CDV感染hSLAM转基因小鼠结果 |
| 3.3.2 CDV核酸在hSLAM转基因小鼠组织中检测结果 |
| 3.3.3 CDV感染hSLAM转基因小鼠不同组织中病毒载量结果 |
| 3.3.4 CDV感染小鼠病毒与hSLAM共定位结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）CTLA-4与中国猕猴艾滋病发病进程的关系及其机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 免疫检查点分子在艾滋病发病进程中的研究进展 |
| 1.1 常见的免疫检查点分子及其基本功能 |
| 1.1.1 程序性死亡受体(PD-1) |
| 1.1.2 细胞毒T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4) |
| 1.1.3 其它免疫检查点分子 |
| 1.2 免疫检查点分子在免疫治疗中发挥重要作用 |
| 1.3 免疫检查点分子与艾滋病进程的关系 |
| 1.4 免疫检查点分子在艾滋病治疗中的应用 |
| 1.4.1 免疫检查点抑制剂 |
| 1.4.2 免疫检查点分子靶向清除潜伏HIV |
| 1.4.3 免疫检查点分子体外阻断恢复免疫重建 |
| 1.5 小结与展望 |
| 第二章 CTLA-4与中国猕猴艾滋病发病进程的关系 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 病毒 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 溶液 |
| 2.2.5 耗材 |
| 2.2.6 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 艾滋病动物模型的建立 |
| 2.3.2 血液样品的收集 |
| 2.3.3 PBMC的分离及冻存 |
| 2.3.4 血浆病毒载量的检测 |
| 2.3.5 外周血中CD4+ T和CD8+ T细胞数检测 |
| 2.3.6 细胞表面分子检测 |
| 2.3.7 胞内染色检测细胞因子 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 CTLA-4在SIV感染前后CD4+ T和CD8+ T细胞及其亚群中的表达 |
| 2.4.2 CTLA-4在SIV感染前后CD4+ T和CD8+ T细胞及其亚群中表达的动态变化 |
| 2.4.3 CTLA-4在T细胞上的表达与血浆病毒载量的相关性分析 |
| 2.4.4 CTLA-4在T细胞上的表达与免疫学指标相关性分析 |
| 2.4.5 CTLA-4的表达与细胞增殖、活化的相关性分析 |
| 2.5 结论与讨论 |
| 第三章 ROS对T细胞中CTLA-4表达的影响 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 病毒 |
| 3.2.3 试剂 |
| 3.2.4 溶液 |
| 3.2.5 耗材 |
| 3.2.6 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞的培养 |
| 3.3.2 病毒感染细胞实验 |
| 3.3.3 氧化应激细胞模型的建立 |
| 3.3.4 胞内ROS和NO水平的检测 |
| 3.3.5 流式检测胞内CTLA-4表达 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HIV-1_(IIIB)感染的H9和Jurkat细胞中ROS和CTLA-4水平变化 |
| 3.4.2 慢性感染的H9和Jurkat细胞中ROS和CTLA-4水平变化 |
| 3.4.3 H9和Jurkat细胞氧化应激模型的建立 |
| 3.4.4 胞外氧化刺激对T细胞中ROS和CTLA-4水平的影响 |
| 3.4.5 胞外氧化刺激对猕猴PBMC细胞中ROS和CTLA-4水平的影响 |
| 3.5 结论与讨论 |
| 第四章 cAMP-PKA通路对CTLA-4表达的可能调控 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验样本 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 溶液 |
| 4.2.4 耗材 |
| 4.2.5 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞的复苏与培养 |
| 4.3.2 化合物对PBMC中CTLA-4表达水平的影响 |
| 4.3.3 流式检测PBMC中CTLA-4的表达水平 |
| 4.3.4 Trizol法提取细胞中总RNA |
| 4.3.5 逆转录 |
| 4.3.6 基因表达水平检测 |
| 4.3.7 蛋白浓度测定 |
| 4.3.8 cAMP浓度测定 |
| 4.3.9 蛋白激酶A(PKA)含量测定 |
| 4.3.10 蛋白激酶A(PKA)活性检测 |
| 4.3.11 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 化合物刺激对CTLA-4表达的影响 |
| 4.4.2 化合物刺激和SIV感染对cAMP水平的影响 |
| 4.4.3 化合物刺激使PKA活化从而影响CTLA-4表达水平 |
| 4.4.4 SIV感染急性期对PKA活性的影响 |
| 4.4.5 SIV急性感染期和慢性感染期AC和PDE水平 |
| 4.4.6 PDEs抑制剂使CTLA-4表达上调 |
| 4.5 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 附录 |
（3）猕猴miRNA的鉴定及其在SIV感染个体B细胞中的表达谱分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 艾滋病的现状与治疗瓶颈 |
| 1.2 免疫系统与艾滋病 |
| 1.3 miRNA与艾滋病 |
| 1.4 艾滋病实验动物模型 |
| 1.4.1 SIV感染猕猴实验动物模型 |
| 1.4.2 猕猴miRNA的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 猕猴miRNA的鉴定与分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验样本 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 猕猴外周血的采集 |
| 2.3.2 猕猴RNA的提取 |
| 2.3.3 猕猴小RNA文库的构建 |
| 2.3.4 原始数据处理与比对分析 |
| 2.3.5 猕猴miRNA基因的同源搜索 |
| 2.3.6 猕猴miRNA基因定位分析 |
| 2.3.7 猕猴miRNA相对表达量与进化年龄相关性分析 |
| 2.3.8 miRNA靶基因分析 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 小RNA测序数据的分类注释 |
| 2.4.2 食蟹猴外周血miRNA表达谱分析 |
| 2.4.3 猕猴miRNA基因的同源搜索 |
| 2.4.4 猕猴miRNA基因定位分析 |
| 2.4.5 猕猴miRNA相对表达量与进化年龄的相关性分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 SIV感染恒河猴B细胞mi RNA表达谱分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SIV感染的中国恒河猴PBMC的采集 |
| 3.3.2 SIV感染的中国恒河猴B细胞分选 |
| 3.3.3 流式细胞术检测B细胞 |
| 3.3.4 SIV感染的中国恒河猴B细胞RNA的提取 |
| 3.3.5 SIV感染的中国恒河猴小RNA文库的构建 |
| 3.3.6 原始数据处理与比对分析 |
| 3.3.7 SIV感染的中国恒河猴B细胞差异表达mi RNA的筛选 |
| 3.3.8 差异表达miRNA靶基因预测与分析 |
| 3.3.9 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 SIV感染恒河猴血液指标分析 |
| 3.4.2 B细胞小RNA测序数据的分类注释 |
| 3.4.3 SIV感染后B细胞miRNA表达谱分析 |
| 3.4.4 差异表达miRNA靶基因分析 |
| 3.4.5 差异表达miRNA功能预测 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）人55型腺病毒单克隆中和抗体的制备及表位分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 腺病毒概述 |
| 1.1.1 腺病毒简介 |
| 1.1.2 腺病毒感染机制 |
| 1.1.3 腺病毒载体 |
| 1.1.4 HAdV55及其亲本腺病毒 |
| 1.2 单克隆抗体 |
| 1.2.1 单克隆抗体制备方法 |
| 1.2.2 抗体药物在治疗病毒感染上的应用 |
| 1.2.3 腺病毒单克隆抗体作用机制 |
| 第2章 单个B细胞克隆法筛选HAdV55中和抗体 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 分子克隆常用试剂 |
| 2.1.2 蛋白质电泳相关试剂 |
| 2.1.3 细胞培养和质粒转染相关试剂 |
| 2.1.4 ELISA相关试剂 |
| 2.1.5 中和实验相关试剂 |
| 2.2 实验分析及作图软件 |
| 2.3 实验相关仪 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 HAdV55候选疫苗免疫中国猕猴 |
| 2.4.2 分离免疫猕猴外周血单个核细胞 |
| 2.4.3 流式分选 HAd V55 特异性记忆细胞 |
| 2.4.4 逆转录及单细胞 PCR 扩增抗体基因片段 |
| 2.4.5 抗体基因克隆 |
| 2.4.6 线性化载体制备 |
| 2.4.7 抗体基因与对应载体连接 |
| 2.4.8 连接产物转化 |
| 2.4.9 菌液 PCR 鉴定阳性克隆 |
| 2.4.10 测序结果分析 |
| 2.4.11 抗体基因在293T细胞中的表达 |
| 2.4.12 考马斯亮蓝染色检测抗体表达 |
| 2.4.13 ELISA 检测抗体与 HAd V55 的结合能力 |
| 2.4.14 基于碱性磷酸酶的微量中和实验测定 HAd V55 单克隆抗体中和能力 |
| 2.4.15 293F细胞生产单克隆抗体 |
| 2.4.16 Protein A凝胶柱纯化抗体 |
| 2.4.17 Western Blot鉴定结合表位 |
| 2.4.18 病毒微量中和实验鉴定中和表位 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 HAdV55特异性单克隆抗体基因获取 |
| 3.1.1 HAdV55候选疫苗免疫中国猕猴 |
| 3.1.2 流式细胞仪分选HAdV55特异性记忆B细胞 |
| 3.1.3 单细胞PCR获取抗体基因 |
| 3.1.4 克隆表达载体 |
| 3.1.5 菌液PCR及测序验证 |
| 3.1.6 抗体表达 |
| 3.1.7 抗体活性检测 |
| 3.1.8 抗体大量表达及EC_(50)、IC_(50)测定 |
| 3.1.9 结合表位、中和表位鉴定 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 各试剂盒使用操作说明书 |
| 附录 B 质粒载体 Heavy 链、Kappa 链、Lammbda 链示意图 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（6）猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的建立与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猴B病毒的发现与命名 |
| 2 猴B病毒的生物学特性 |
| 2.1 猴B病毒与人单纯疱疹病毒高度相似 |
| 2.2 猴B病毒的基因型分型 |
| 3 猴B病毒的流行病学 |
| 3.1 猴B病毒在猴群中的流行病学 |
| 3.2 猴B病毒在人群中的流行病学 |
| 4 猴B病毒的感染与临床表现 |
| 4.1 猴B病毒对猴的感染 |
| 4.2 猴B病毒对人的感染 |
| 5 猴B病毒感染的诊断与治疗 |
| 5.1 猴B病毒的诊断 |
| 5.2 猴B病毒感染后的治疗 |
| 6 总结与展望 |
| 第二章 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的建立与评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系引物和探针的设计与合成 |
| 1.3 猴B病毒参考品质粒的制备 |
| 1.4 猴B病毒通用检测引物、探针的特异性初步实验 |
| 1.5 猴B病毒通用实时荧光定量PCR反应体系的建立 |
| 1.6 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测灵敏度的初步评价 |
| 1.7 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系标准曲线的建立 |
| 1.8 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的方法学评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 猴B病毒参考品质粒的制备 |
| 2.2 猴B病毒3号、4引物探针的特异性初步实验 |
| 2.3 猴B病毒3号、4号引物探针检测体系的建立 |
| 2.4 猴B病毒3号、4号引物探针灵敏度的初步评价 |
| 2.5 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系标准曲线的建立 |
| 2.6 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的特异性评价结果 |
| 2.7 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的灵敏度评价结果 |
| 2.8 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的重复性评价结果 |
| 2.9 猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的通用性评价结果 |
| 3.分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表(Abbreviation) |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（7）实验猕猴B病毒抗体检测结果分析（论文提纲范文）
| 1 对象与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 检测试剂与方法 |
| 1.3 结果判定 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 检测结果 |
| 2.2 不同性别实验猕猴B病毒抗体阳性率比较 |
| 2.3 不同年龄实验猕猴B病毒抗体阳性率比较 |
| 2.4 不同体质量猕猴B病毒抗体阳性率比较 |
| 3 讨论 |
（8）新型埃博拉疫苗诱导灵长类治疗性抗体研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、埃博拉病毒 |
| 1 埃博拉出血热 |
| 2 埃博拉病毒分型 |
| 3 埃博拉病毒的结构 |
| 4 埃博拉病毒侵染细胞机制 |
| 5 埃博拉出血热临床症状及传播途径 |
| 6 埃博拉出血热治疗手段 |
| 二、使用免疫球蛋白进行传染性疾病治疗 |
| 研究目的、基础与假设 |
| 实验技术路线 |
| 实验材料 |
| 一、实验试剂、材料、仪器 |
| 1 实验主要仪器及产家 |
| 2 实验试剂及厂家 |
| 3 实验主要试剂及溶液配制 |
| 第一章 埃博拉bundibugyo亚型疫苗rAd2-BEBOV GP构建 |
| 第一节 实验方法 |
| 1 CaCl_2法制备DH5α、Top10与XL-Blue感受态 |
| 2 Hanahan法制备BJ5183超级感受态 |
| 3 rAd2-BEBOV GP质粒构建 |
| 4 rAd2-BEBOV GP病毒拯救、扩增、纯化 |
| 第二节 实验结果与分析 |
| 1 Bundibugyo亚型GP蛋白密码子优化 |
| 2 携带Bundibugyo亚型GP蛋白优化基因的穿梭质粒pGA1-BEBOV GP的构建 |
| 3 利用同源重组获得rAd2-BEBOV GP质粒 |
| 4 rAd2-BEBOV GP病毒拯救 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第二章 利用埃博拉假病毒系统评价不同疫苗免疫后诱导的抗体水平 |
| 第一节 实验方法 |
| 1 制备埃博拉假病毒包装质粒 |
| 1.1 埃博拉假病毒包装质粒转化 |
| 1.2 埃博拉假病毒包装质粒鉴定 |
| 1.3 埃博拉假病毒包装质粒的大量制备 |
| 2 包装埃博拉假病毒 |
| 2.1 293T细胞培养 |
| 2.2 埃博拉假病毒包装质粒共转染实验 |
| 2.3 埃博拉假病毒收集 |
| 3 埃博拉假病毒TCID_(50)确定及病毒中和实验 |
| 3.1 Huh7细胞培养 |
| 3.2 埃博拉假病毒TCID_(50)的确定 |
| 3.3 假病毒-血清中和实验 |
| 4 利用三种埃博拉候选疫苗免疫中国猕猴 |
| 4.1 三种埃博拉候选疫苗疫苗信息 |
| 4.2 中国猕猴免疫疫苗后采血、分离血清保存 |
| 第二节 实验结果与分析 |
| 一、埃博拉假病毒的制备 |
| 1 鉴定Zaire(1976、2014)、Sudan、Marburg假病毒包装质粒GP基因 |
| 2 制备获得的Zaire(1976、2014)/Sudan/MAR假病毒荧光值 |
| 3 病毒GP蛋白western blot实验结果 |
| 二、利用埃博拉假病毒系统评价不同免疫原诱导的抗体水平 |
| 1 免疫不同埃博拉免疫原的小鼠体内诱导的抗体水平 |
| 2 免疫不同埃博拉免疫原的中国猕猴体内诱导的抗体水平 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第三章 中国猕猴抗埃博拉病毒免疫球蛋白纯化 |
| 第一节 实验方法 |
| 1 蛋白纯化柱子的安装 |
| 2 中国猕猴抗病毒血清样品收集与准备 |
| 3 中国猕猴血清免疫球蛋白纯化流程 |
| 4 进一步浓缩纯化获得的免疫球蛋白 |
| 5 对纯化后获得的猕猴免疫球蛋白进行鉴定 |
| 5.1 SDS-PAGE蛋白电泳鉴定 |
| 5.2 SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色 |
| 5.3 ELISA法鉴定终产物中IgG的含量 |
| 5.4 病毒中和实验鉴定纯化产物中和效价 |
| 第二节 实验结果与分析 |
| 1 免疫埃博拉抗原的中国猕猴血清中和效价 |
| 2 选择高效价血清进行中国猕猴抗埃博拉总IgG的纯化 |
| 3 抗埃博拉中国猕猴血清纯化过程及产物鉴定 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 总结与展望 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 已发表及待发表文章 |
| 致谢 |
（9）饲养猴群中诺如病毒感染的初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1、诺如病毒基本特征 |
| 1.1 诺如病毒的分子生物学特征 |
| 1.2 诺如病毒的流行病学 |
| 2、诺如病毒的检测方法 |
| 2.1 诺如病毒颗粒检测方法 |
| 2.2 诺如病毒核酸检测方法 |
| 2.3 诺如病毒蛋白质检测方法 |
| 3、诺如病毒蛋白体外表达技术 |
| 3.1 诺如病毒衣壳蛋白杆状表达系统 |
| 3.2 诺如病毒衣壳蛋白原核表达系统 |
| 4、诺如病毒的动物模型与体外培养 |
| 5、本论文研究内容与意义 |
| 一、实验材料 |
| 1、实验动物及病毒株 |
| 2、主要试剂及试剂盒 |
| 3、主要溶液的配制 |
| 3.1 蛋白表达所用溶液 |
| 3.2 琼脂糖电泳所用溶液 |
| 3.3 Western blot所用溶液 |
| 3.4 ELISA所用溶液 |
| 3.5 猴源肠上皮细胞培养基 |
| 4、主要仪器设备 |
| 5、抗体 |
| 二、实验方法 |
| 1、粪便样本中诺如病毒的检测 |
| 1.1 粪便样本的采集、制备 |
| 1.2 粪便样本中RNA提取 |
| 1.3 TaqMan荧光定量RT-PCR方法定量检测粪便样本中诺如病毒含量 |
| 2、诺如病毒全基因组扩增及序列分析 |
| 2.1 诺如病毒阳性样品的筛选 |
| 2.2 一株猴源GⅡ.17型诺如病毒全基因组序列扩增 |
| 2.3 三株人源GⅡ.4型诺如病毒全基因组序列扩增 |
| 3、GⅡ.17基因型诺如病毒P结构域及其变体蛋白的原核表达 |
| 3.1 重组质粒P-RGD-GST、P△R-GST的构建 |
| 3.2 重组融合蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 3.3 不含载体的目的蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.4 目的蛋白的抗血清制备及ELISA检测效价 |
| 4、诺如病毒自然感染猕猴模型的初步建立 |
| 4.1 诺如病毒自然感染猕猴模型的构建 |
| 4.2 感染后猕猴临床表现观察及样本采集 |
| 4.3 感染后猕猴粪便中诺如病毒含量检测 |
| 4.4 感染后猕猴血清中诺如病毒抗体滴度检测 |
| 5、猕猴唾液与诺如病毒P结构域及变体蛋白的结合 |
| 5.1 猕猴唾液样本分型 |
| 5.2 GⅡ.17型诺如病毒与唾液中HBGAs结合分析 |
| 6、诺如病毒体外细胞培养的初步探索 |
| 6.1 猕猴结肠上皮细胞分离培养 |
| 三、实验结果 |
| 1、粪便样本中诺如病毒含量测定结果 |
| 2、诺如病毒全基因组序列分析结果 |
| 2.1 一株猴源GⅡ.17型诺如病毒全基因组序列分析 |
| 2.2 三株人源GⅡ.4型诺如病毒全基因组序列分析 |
| 3、GⅡ.17基因型诺如病毒P结构域及其变体的原核表达与鉴定 |
| 3.1 重组质粒P-RGD-GST、P△R-GST的构建 |
| 3.2 重组融合蛋白P-RGD-GST、P△R-GST的原核表达 |
| 3.3 重组融合蛋白P-RGD-GST、P△R-GST的纯化和鉴定 |
| 3.4 目的蛋白P-RGD、P△R的纯度和鉴定 |
| 3.5 蛋白浓度的测定 |
| 3.6 目的蛋白P-RGD、P△R抗血清的制备及ELISA检测效价 |
| 4、诺如病毒自然感染猕猴模型的初步建立 |
| 4.1 感染后猕猴临床表现观察与分析 |
| 4.2 感染后猕猴粪便中诺如病毒含量 |
| 4.3 感染后猕猴血清中诺如病毒抗体滴度 |
| 5、猕猴唾液与诺如病毒P结构域及变体蛋白的结合 |
| 5.1 猕猴唾液表型分布测定 |
| 5.2 诺如病毒与猕猴唾液中HBGAs结合情况 |
| 6、诺如病毒体外细胞培养的初步探索 |
| 6.1 永生化猴源肠上皮细胞的分离培养 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1. 三株人源GⅡ.4基因型诺如病毒全基因组序列 |
| 1.1、人源2057全基因组序列 |
| 1.2、人源2060全基因组序列 |
| 1.3、人源2086全基因组序列 |
| 附录2. 原核表达纯化蛋白核苷酸序列及氨基酸序列 |
| 2.1、载体pGEX-4T-1含GST部分核苷酸序列 |
| 2.2、密码子未优化P结构域蛋白(P-RGD)核苷酸序列 |
| 2.3、密码子优化后P结构域(P-RGD)核苷酸序列 |
| 2.4、P结构域(P-RGD)氨基酸序列 |
| 2.5、P-RGD基因插入pGEX-4T-1载体后即P-RGD-GST核苷酸序列 |
| 2.6、密码子未优化P结构域变体蛋白(P△R)核苷酸序列 |
| 2.7、密码子优化后P结构域变体蛋白(P△R)核苷酸序列 |
| 2.8、P结构域变体蛋白(P△R)氨基酸序列 |
| 2.9、P△R基因插入pGEX-4T-1载体后即GST-P△R核苷酸序列 |
| 附录3. 缩略词表 |
| 附录4. BCA标准品稀释方法 |
| 研究生简历 |
| 致谢 |
（10）猕猴睾丸生殖细胞纯化、培养及基因修饰探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验步骤和方法 |
| 三.主要的仪器设备 |
| 结果与分析 |
| 一.猕猴睾丸组织学分析与抗体检测 |
| 二.STA-PUT分离后各级生精细胞纯度鉴定 |
| 三.细胞移植受体与移植技术平台构建 |
| 四.建立灵长类猕猴精原细胞初步培养体系 |
| 五.猕猴睾丸生殖细胞基因修饰探索 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 一.不同物种(小鼠、猴、人)精原细胞亚型分类及动力学研究 |
| 二.不同物种(小鼠、猴、人)精原细胞分子标志 |
| 三.不同物种(小鼠、猴、人)各级生精细胞的分离方法 |
| 四.不同物种(小鼠、猴、人)精原干细胞培养进展 |
| 五.总结与展望 |
| 六.参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、两种方法检测猕猴B病毒抗体的初步探讨（论文参考文献）
- [1]犬瘟热病毒对人SLAM受体适应机制及其在人SLAM转基因小鼠体内复制的研究[D]. 冉伟. 黑龙江八一农垦大学, 2021(09)
- [2]CTLA-4与中国猕猴艾滋病发病进程的关系及其机制的初步研究[D]. 刘本波. 大理大学, 2021(08)
- [3]猕猴miRNA的鉴定及其在SIV感染个体B细胞中的表达谱分析[D]. 黄侠. 华南理工大学, 2020(02)
- [4]人55型腺病毒单克隆中和抗体的制备及表位分析[D]. 苏婉. 华侨大学, 2020(01)
- [5]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [6]猴B病毒通用实时荧光定量PCR检测体系的建立与评价[D]. 马丽敏. 河南科技学院, 2018(07)
- [7]实验猕猴B病毒抗体检测结果分析[J]. 蔡标,戴陈伟,李舜,武昌俊,刁慧敏,辛及娣,童琳. 安徽医学, 2018(03)
- [8]新型埃博拉疫苗诱导灵长类治疗性抗体研究[D]. 胡培宇. 广州医科大学, 2017(02)
- [9]饲养猴群中诺如病毒感染的初步探讨[D]. 刘波. 北京协和医学院, 2017(02)
- [10]猕猴睾丸生殖细胞纯化、培养及基因修饰探索[D]. 贾媛媛. 南京医科大学, 2017(05)