论文摘要
Myostatin（肌肉抑制素,MSTN）,是负调控骨骼肌生长和发育的因子,会抑制骨骼肌的生长和发育。敲除MSTN可以促进肌肉发育同时抑制脂肪生成,所以MSTN的敲除对于生产肌肉发达而脂肪减少的转基因动物具有重要意义。研究发现DNA甲基化也是调控肌肉发育的重要因素,但是在肌肉卫星细胞成肌分化过程中MSTN与DNA甲基化之间的相互作用还未见报道。本研究通过以下试验研究了DNA甲基化在MSTN突变牛肌肉卫星细胞成肌分化过程中的作用机制。试验一,对MSTN缺失和野生型牛肌肉组织进行转录组分析,共富集到差异表达基因721个,下调基因647个,上调基因74个。差异显著富集到的生物过程（Biological Process）主要与免疫系统、生物过程的正调控、发育过程、对刺激的应答、生长以及代谢过程有关。同时富集到了肌肉发育、成骨分化、蛋白质磷酸化、细胞增殖、细胞分化、基因表达的调控、凋亡以及脂肪酸代谢相关的条目。MSTN基因编辑牛肌肉组织与野生型肌肉组织转录组数据相比,富集到165个下调的信号通路,其中具有显著性差异（P value<0.05）的有47个,富集到的信号通路与肌肉发育、脂肪代谢、破骨分化、钙信号通路、长寿调控、生长激素信号通路以及细胞周期相关。与野生组相比,MSTN突变后上调的信号通路共富集到21个,其中具有显著性差异的信号通路有3个,为磷酸戊糖途径以及心肌收缩等信号通路。转录组数据同时富集到了DNA甲基转移酶DNMT家族以及去甲基化酶TET家族,且MSTN突变后DNMT显著下调,而去甲基化酶TET家族的表达显著上调,表明MSTN与DNA甲基化之间具有重要联系。试验二,通过组织块贴壁法分别分离获得了野生型和MSTN基因编辑牛的肌肉卫星细胞,通过流式细胞术研究两种细胞的细胞表面抗原特性,采用免疫荧光方法研究其来源与特性,对分离的肌卫星细胞进行成肌、成脂和成骨诱导对其干性进行鉴定。通过细胞周期以及EdU增殖实验检测分离的两种细胞增殖情况。结果表明这两种细胞表面抗原特性为CD34-/CD105+/CD90+,证明这两种细胞符合间充质干细胞表面标记特性。分离的这两种细胞都可以向成肌、成脂和成骨方向分化,具有干细胞特性。通过免疫荧光试验证明细胞表达肌肉卫星细胞特异性蛋白MyoD,成肌分化形成的肌管表达肌管特异性蛋白MHC。MSTN突变的细胞其MSTN表达显著低于野生组。表明本研究分离获得了MSTN基因编辑和野生型的牛肌肉卫星细胞。细胞增殖符合细胞周期,且MSTN基因编辑细胞其细胞增殖相对于野生型细胞加快,通过细胞周期相关基因检测表明MSTN基因编辑细胞的周期蛋白基因表达上调,而抑制细胞周期的基因表达下调,其中MSTN下调最显著,推测MSTN突变主要通过抑制CDKN1C的表达,从而促进了CyclinA-CDK2的表达,进而促进DNA合成,促进细胞周期。试验三,研究DNA甲基化在MSTN缺失的肌卫星细胞成肌分化过程中的作用机制。在成肌过程中统计肌管融合率并测量肌管长度,发现MSTN突变会促进肌管融合。对成肌相关因子进行检测表明MSTN突变会促进成肌因子表达,检测成肌因子甲基化状态发现MSTN突变会降低成肌因子的甲基化,从而导致表达上调,表明MSTN会通过影响成肌因子的甲基化状态来调控成肌分化。进一步研究发现MSTN突变导致的成肌因子发生去甲基化是通过上调去甲基化酶TET1实现的。SMAD2/SMAD3是MSTN基因下游转录因子,通过JASPAR数据库预测发现SMAD2/SMAD3可能与TET1启动子结合,接下来通过染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR实验证明了转录因子SMAD2/SMAD3与去甲基化关键基因TET1启动子的结合,表明MSTN对TET1基因表达的调控是通过SMAD2/SMAD3发挥的。通过双荧光素酶报告试验证明SMAD3会抑制TET1启动子活性,表明MSTN突变会通过下调SMAD3,从而上调TET1的表达。接下来对野生型细胞过表达TET1,结果发现TET1过表达会促进肌管融合,而干扰MSTN突变细胞中的TET1基因会降低肌管融合率。该试验证明MSTN会通过SMAD2/SMAD3转录因子与TET1的结合调控TET1的表达,而TET1通过发挥去甲基化作用对成肌因子的表达进行调控,从而调控肌卫星细胞的成肌分化过程。综上所述,本研究分离获得了MSTN基因编辑和野生型牛肌肉卫星细胞,通过细胞周期检测显示MSTN突变主要通过抑制CDKN1C的表达,从而促进了CyclinA-CDK2的表达,进而促进DNA合成,促进细胞周期。且在成肌分化过程中,MSTN突变后通过下调SMAD2/SMAD3的活性,减少其对TET1启动子的抑制,上调TET1表达,从而促进成肌因子发生去甲基化,进而促进成肌分化过程。本研究首次挖掘了MSTN与DNA甲基化之间的调节机制,为研究MSTN与表观修饰之间的关系提供了研究基础。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 高丽
导师: 李光鹏
关键词: 基因编辑牛,肌肉卫星细胞,细胞增殖,成肌分化,甲基化
来源: 内蒙古大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 内蒙古大学
基金: 国家科技重大专项(2016ZX08007-002),内蒙古自治区科技创新引导项目(KCBJ2018002)
分类号: Q23
DOI: 10.27224/d.cnki.gnmdu.2019.000073
总页数: 121
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