拟南芥PIF7基因在高温应答中的功能研究

论文摘要

在自然界中,光和温度是对植物生长发育极其重要的两个外界环境因素。为了适应各种各样的环境,高等植物有一整套的感受器去感受光和温度的变化。光敏色素是植物的一类可以吸收红光（R）及远红光（FR）的光受体。在拟南芥中,光敏色素有五个同源基因—光敏色素A-E（phytochromeA-E,phyA-E）。其中,光敏色素B是植物感受遮荫信号（低红光远红光比）的主要光受体。高温（27-30℃）可以诱导拟南芥产生一系列与遮荫相似的应答反应,包括下胚轴的伸长,叶角的偏下性增强等。而且,近期人们发现光敏色素B还是拟南芥的热感受器。光敏色素互作因子（PHTOCHR0ME INTERACTING FACTORS,PIFs）是一类能与光敏色素互作的转录因子。在拟南芥中,PIFs家族有八个成员。它们参与调控光形态建成和对遮荫及高温的应答等多种反应。YUCCA8（YUC8）编码一种吲哚-3-丙酮酸单加氧酶,参与吲哚乙酸（IAA）生物合成,同时其催化的反应还是该过程中的限速步骤。高温和遮荫处理均能通过快速诱导YUC8的表达,增强生长素的合成,进而促进下胚轴的伸长。PIF4（PHTOCHROME INTERACTING FACTOR4）在遮荫和高温应答中起到关键作用。遮荫和高温处理可以促进PIF4直接结合YUC8启动子,激活其转录,从而促进生长素的快速合成和下胚轴的伸长。在光下,PIF4被磷酸化后迅速通过泛素化途径降解。遮荫则通过抑制PIF4的磷酸化,稳定PIF4蛋白。高温对PIF4的调控则主要发生在转录水平,通过快速诱导P1F4的表达,提高其蛋白水平。PIF7（PHTOCHROME INTERACTING FACTOR 7）也是避荫反应的重要调控因子,正调控YUC8的表达。与PIF4不同的是,PIF7在光下是稳定的,遮荫处理促进PIF7的去磷酸化。而PIF7是否参与高温应答目前尚不明确。在本研究中我们发现,PIF7在高温应答中也起到了重要作用,其作用机制可能不同于PIF4。高温对PIF7的调控主要是降低去磷酸化的PIF7蛋白的水平。光敏色素快速调节因子1（PHYTOCHROME RAPIDLY REGULATED 1,PAR1）是避荫反应的负向调控因子。PAR1虽然是螺旋-环-螺旋（Helix-loop-helix,HLH）类转录因子,但不具有DNA结合结构域。PAR1可以与PIF4直接相互作用,抑制其DNA结合活性,从而影响PIF4下游靶基因的表达。我们的结果表明,PARl基因的过表达影响了高温诱导的下胚轴伸长及YUC8和一些生长素应答基因的表达。PAR1在高温条件下蛋白水平是逐渐增加的,这暗示PAR1可能具有限制高温过分诱导下胚轴伸长的功能。PIF7可以直接与PARI相互作用,阻断PARI对PIF4转录激活活性的抑制。根据以上结果,我们推测在高温应答的早期（转入高温环境的前6个小时）,高温诱导的PIF4可以结合YUC8的启动子,激活其转录。此时,PIF7可以通过与PAR1的互作,抑制其对PIF4的负调控。稍后,PARl的蛋白水平逐渐增加,超出了P1F7的调控能力,从而抑制了PIF4对YUC8的转录激活。本研究提供了一个关于植物高温应答的新模型。我们知道,植物生活史中能利用的碳源是有限的,密植所造成的遮荫和高温会造成植物在营养生长时期导致营养分配不当,不利于产量的提高。同时,全球气候变暖也会带来类似的问题。我们可以利用这个新模型改良植物的碳分配,从而为未来的育种工作提供理论依据。

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摘要

Abstract

缩写对照表

1. 前言

1.1 拟南芥

1.2 热形态建成

1.2.1 热感应

1.2.2 热应答

1.3 生长素与生长素依赖的温度应答

1.3.1 生长素的生物合成与高温应答

1.3.2 生长素的运输与高温应答

1.3.3 生长素的响应及信号转导与高温应答

1.4 光敏色素互作因子

1.4.1 光敏色素互作因子4

1.4.2 光敏色素互作因子7

1.5 光敏色素快速调节因子1

1.6 本研究的目的与意义

2. 材料和方法

2.1 植物材料与生长条件

2.1.1 植物材料

2.1.2 生长条件

2.2 分子克隆技术

2.2.1 聚合酶链式扩增反应

2.2.2 聚合酶链式扩增反应产物回收

2.2.3 DNA片段胶回收

2.2.4 不依赖连接酶的克隆

2.2.5 酶切连接克隆

2.2.6 寡核苷酸退火连接

2.2.7 大肠杆菌DH5α感受态的制备

2.2.8 重组质粒化学转化法转化大肠杆菌感受态

2.2.9 质粒小量提取提取

2.3 植物物的种植和杂交方法

2.3.1 种子灭菌与春化

2.3.2 拟南芥的移栽

2.3.3 拟南芥的杂交

2.4 拟南芥基因型鉴定

2.4.1 拟南芥DNA快速提取

2.4.2 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

2.5 拟南芥下胚轴长度的测量

2.6 农杆菌介导的转基植物构建

2.6.1 农杆菌感受态GV3101的制备

2.6.2 重组质粒电击转化农杆菌GV3101

2.6.3 农杆菌介导的拟南芥花序侵染法转基因

2.6.4 转基因植株筛选

2.7 植物总RNA提取和反转录

2.7.1 使用Tripure提取植物总RNA

2.7.2 总RNA反转录cDNA

2.8 实时荧光定量PCR

2.8.1 反应体系

2.8.2 反应程序

2.8.3 结果分析

2.9 酵母双杂交

2.10 拟南芥叶肉原生质体转化

2.10.1 PEG沉淀法大量提纯质粒

2.10.2 原生质体转化技术

2.10.3 双分子荧光互补

2.10.4 瞬时表达转录激活的双荧光素酶分析

2.10.5 原生质体免疫共沉淀技术

2.11 蛋白质技术

2.11.1 拟南芥的总蛋白提取

2.11.2 丙烯酰胺凝胶电泳

2.11.3 蛋白质免疫印迹

2.12 本研究中所使用的引物

2.12.1 分子克隆引物

2.12.2 T-DNA鉴定引物

2.12.3 Q-RT PCR引物

2.13 试剂配制

2.13.1 抗生素的配制

2.13.2 植物激素的配制

2.13.3 培养基的配制

2.13.4 质粒大量提取试剂的配制

2.13.5 植物DNA提取试剂的配制

2.13.6 琼脂糖凝胶电泳试剂配制

2.13.7 聚合酶链式反应10x Ex缓冲液

2.13.8 植物蛋白提取试剂的配制

2.13.9 丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制

2.13.10 蛋白质免疫印迹相关试剂的配制

2.13.11 酵母转化相关试剂的配制

2.13.12 原生质体转化相关试剂的配制

2.13.13 原生质体瞬时表达双荧光素酶分析相关试剂的配制

2.13.14 原生质体免疫共沉淀相关试剂的配制

2.14 本研究使用的仪器

2.15 本研究使用的网站和软件

2.15.1 本研究使用的数据库

2.15.2 本研究使用的软件

3. 结果与分析

3.1 光敏色素互作因子7突变体PIF7-2在高温应答反应中有缺陷

3.2 光敏色素互作因子7的突变体对植物激素的应答

3.2.1 生长素类似物毒莠定可以完全回复pif7-2的下胚轴伸长缺陷

3.2.2 表油菜素内酯可以回复pif7-2非高温响应的下胚轴伸长缺陷

3.2.3 赤霉素不能回复pif7-2的下胚轴伸长缺陷

3.3 高温对光敏色素互作因子7的调控

3.3.1 光敏色素互作因子7在高温环境中的转录水平不变

3.3.2 光敏色素互作因子7在高温环境中蛋白水平几乎不变

3.4 光敏色素互作因子7的突变体在生长素的生物合成过程中有缺陷

3.4.1 光敏色素互作因子4的高温诱导在pif7-2中是正常的

3.4.2 吲哚-3-丙酮酸单加氧酶基因（YUC8）的高温诱导在pif7-2中有缺陷

3.4.3 生长素响应的下游响应基因的高温诱导在pif7-2中有缺陷

3.5 光敏色素互作因子7对于YUC8有弱的转录激活活性

3.5.1 在酵母中光敏色素互作因子7没有转录激活活性

3.5.2 在拟南芥原生质体中光敏色素互作因子7对YUC8有弱的转录激活活性

3.6 光敏色素互作因子7与光敏色素互作因子4直接相互作用

3.7 光敏色素互作因子4与光敏色素互作因子7的异源二聚体不具有更强的转录激活活性

3.8 光敏色素互作因子7与光敏色素快速调控因子1直接相互作用

3.8.1 在酵母中光敏色素互作因子7与光敏色素快速调控因子1发生相互作用

3.8.2 双分子荧光互补实验表明光敏色素互作因子7与光敏色素快速调控因子1具有相互作用

3.8.3 免疫共沉淀表明光敏色素互作因子7直接与光敏色素快速调控因子1相互作用

3.9 光敏色素快速调控因子1的过表达植株在高温应答反应中有缺陷

3.9.1 光敏色素快速调控因子1的过表达植株在高温条件下下胚轴不能伸长

3.9.2 光敏色素快速调控因子1自身启动子植株在高温条件下下胚轴不能伸长

3.9.3 光敏色素快速调控因子1的过表达植株中光敏色素互作因子4的高温诱导是正常的

3.9.4 光敏色素快速调控因子1的过表达植株中YUC8的高温诱导有缺陷

3.9.5 光敏色素快速调控因子1的过表达植株中生长素下游的响应基因的高温诱导有缺陷

3.10 光敏色素快速调控因子1对高温的响应

3.10.1 高温诱导光敏色素快速调控因子1的转录

3.10.2 光敏色素快速调控因子1的蛋白水平在高温下积累

3.11 光敏色素互作因子7可以阻断光敏色素快速调控因子1对光敏色素互作因子4介导的YUC8转录的抑制作用

3.12 PIF7调控高温应答反应的机制模型

3.13 其他与光敏色素互作因子7相互作用的蛋白

3.13.1 光敏色素互作因子7与赤霉素不敏感因子（GAI）能直接相互作用

3.13.2 光敏色素互作因子7与FCA直接相互作用

3.13.3 光敏色素互作因子7与SAV4直接相互作用

4. 讨论与展望

4.1 PIF7可能在高温反应中有很多作用

4.2 PAR1及HFR1等光形态建成的正向调控因子在拟南芥高温应答中扮演着重要角色

4.3 PIF7可以竞争性结合很多负调控因子从而阻断它们对PIF4的转录激活活性的抑制

4.4 展望

4.4.1 光敏色素互作因子7对光敏色素互作因子4的转录水平的影响

4.4.2 光敏色素互作因子7在高温响应中的亚细胞定位变化

4.4.3 光敏色素互作因子7对光敏色素快速调控因子2的调控

4.4.4 光敏色素互作因子7在高温响应中对染色质结构的影响

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 潘辰亮

导师: 陶懿

关键词: 热响应

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q943.2

总页数: 104

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