韩松[1]2003年在《VEGF反义核酸对胰腺癌增殖及血管生成影响的研究》文中研究说明胰腺癌在西方发达国家中已成为第五大恶性肿瘤死亡病因，其死亡病例占胃肠道恶性肿瘤死亡病例的20%。尽管随着外科技术的提高，胰腺癌的切除率有了显着的提高，但由于胰腺癌早期诊断的困难、肿瘤本身的侵袭性、早期的淋巴和血行转移以及缺乏有效的系统治疗，胰腺癌的愈后极差。目前胰腺癌的化学治疗主要为针对肿瘤细胞的细胞毒性药物，这些药物对正常细胞亦有毒性，而且由于肿瘤新生物细胞的遗传不稳定性，化疗的同时导致对肿瘤细胞的耐药性选择。1971 年Folkman 首先提出了针对肿瘤血管生成的设想。当肿瘤细胞生长到一定程度时需要新生血管长入以提供营养促进转移。因此，肿瘤的血管化是新生物从小的局限的肿瘤转变为具有转移能力的增大的肿瘤过程中的关键步骤。有研究显示实体瘤如无新生血管长入，瘤体直径将无法超过0.4mm。这一过程中一系列前血管生成因子参与其中，包括bFGF、PDGF、PDEGF、FGF、Angiopoietin-1、TGF-β1、TGF-α、EGF 等。其中血管内皮生长因子（VEGF）是最具特征性的前血管生成因子，对血管内皮细胞的特异性作用在生长因子中具有相对唯一性。针对VEGF 人们采用VEGF 抗体、VEGF-毒素结合体、小分子量VEGF 受体拮抗剂等方法来抑制肿瘤血管生成，而VEGF 反义核酸技术亦被认为是一种有效抑制肿瘤细胞产生VEGF 的基因治疗方法。本研究采用PCR 方法从pcDNA3-VEGF121 中拷贝VEGF121 cDNA 片段，并在其上下游分别引入Eco RⅠ和Bam HⅠ限制性酶切位点。通过双酶切及连接反应将VEGF121 cDNA 反向插入质粒载体pcDNA3 多克隆位点中Bam HⅠ和Eco RⅠ之间，从而成功构建人反义VEGF121 真核表达质粒pcDNA3-ASVEGF121。采用脂质体介导的方法将VEGF121 反义表达质粒转染人胰腺癌细胞系BxPC-3，通过G-418 的筛选获得稳定表达反义VEGF121 的阳性克隆。PCR 方法检测质粒neoRDNA 片段，进行外源质粒整合度的鉴定。结果显示外源质粒已经整合于细胞基因。在肿瘤细胞体外研究中，采用RT-PCR 的方法检测了VEGF121 基因转录水平的变化；ELISA 方法测定培养液上清VEGF 蛋白表达水平的变化。采用免疫组化的方法检测培养细胞表面VEGF、Flk-1、Bcl-2 的表达。通过克隆形成试验、MTT法测定细胞生长曲线检测肿瘤细胞增殖能力。采用Annexin Ⅴ-FITC 和PI 双标记以流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况。通过测定ECV-304 生长曲线，研究了肿瘤细胞上清对血管内皮细胞增殖的影响。通过体外血管生成试验，研究了培养液上清的体外促血管生成活性。肿瘤细胞体外研究结果显示，VEGF121 反义表达质粒能显着抑制胰腺癌细胞VEGF121 mRNA 的表达，且培养液上清中VEGF 蛋白水平受到明显抑制。免疫组<WP=5>化显示VEGF 反义核酸对细胞表面的VEGF 也有明显的抑制作用，而VEGF 受体－Flk-1 的表达显着上升。Pearson 相关性分析显示VEGF 阳性率与Flk-1 阳性率呈明显的负相关（P＝0.017）。研究发现抑制胰腺癌细胞VEGF 的表达能降低细胞Bcl-2 的表达。但两者相关性无统计学意义（P=0.074）。克隆形成试验显示转染反义表达质粒的胰腺癌细胞克隆形成率明显降低，生长曲线测定显示细胞生长受到显着抑制。表明VEGF 反义核酸能抑制胰腺癌的单细胞增殖能力，降低肿瘤细胞的独立生存能力及对生存环境的适应性。Annexin Ⅴ-FITC 和PI 双标记流式细胞仪检测凋亡结果显示VEGF 反义核酸能促进肿瘤细胞的凋亡。通过测定ECV-304生长曲线，显示肿瘤细胞培养液上清促血管内皮细胞生长作用受到明显的抑制。体外血管生成试验显示培养液上清的体外促血管生成活性受到显着抑制。通过BxPC-3 胰腺癌细胞皮下注射的方法，我们成功建立了胰腺癌裸鼠移植瘤模型，并研究了VEGF 反义核酸对胰腺癌细胞在裸鼠体内增殖的影响及移植瘤血管生成的变化。在体内研究中，我们观察了移植瘤体积的变化。裸鼠处死后，称取移植瘤的重量。瘤体行病理切片，免疫组化染色检测VEGF、Flk-1、Bcl-2表达变化。HE 染色观察移植瘤血管生成情况，并行血管内皮细胞特异性Ⅷ因子相关抗原的免疫组化染色。采用IHS 评分判定VEGF、Flk-1、Bcl-2 表达水平，测定移植瘤微血管密度（MVD）。体内研究结果显示，转染VEGF121 反义表达质粒的胰腺癌裸鼠移植瘤生长缓慢，体积最小，最大直径不超过5mm。免疫组化显示移植瘤VEGF、Flk-1、Bcl-2的表达变化与体外培养条件下类似，即转染反义表达质粒的移植瘤VEGF、Bcl-2表达受抑制，Flk-1 表达水平上升。常规HE 染色显示，转染VEGF121 反义表达质粒的胰腺癌裸鼠移植瘤包膜下缺乏血管结构，瘤体内亦缺乏明显的血管结构及结缔组织。而对照组具有丰富的血管结构，尤其以瘤体包膜下及肿瘤结缔组织内最为丰富。血管内皮细胞特异性Ⅷ因子相关抗原的免疫组化染色显示对照组瘤体包膜下及肿瘤结缔组织内有丰富的棕黄色阳性染色的血管内皮细胞。而转染反义表达质粒的移植瘤则缺乏阳性染色的血管内皮细胞，微血管密度显着下降。总之，研究揭示VEGF 反义核
韩松, 王跃祥, 宋后燕, 倪泉兴, 花天放[2]2009年在《VEGF_(121)反义核酸抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成》文中认为目的:探讨VEGF121反义核酸对裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖及血管生成的影响,探索通过VEGF反义核酸抑制肿瘤生长。方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系Bx-PC-3接种于裸鼠背部皮下。将实验鼠分为实验组、对照组和空白组。定期测定裸鼠移植瘤体积,免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤VEGF、Flk-1表达水平。测定裸鼠移植瘤微血管密度。结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,裸鼠胰腺癌移植瘤生长明显减缓。移植瘤VEGF表达明显受到抑制,Flk-1表达水平上调。裸鼠胰腺癌移植瘤微血管密度明显降低。结论:人反义核酸VEGF121能显着抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的增殖,并能抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的血管生成。
邵成浩, 胡先贵, 刘瑞, 张怡杰, 唐岩[3]2006年在《血管内皮生长因子反义核酸对胰腺癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响》文中提出目的探讨腺病毒介导的血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸对胰腺癌细胞增殖、凋亡和血管生成的作用。方法构建反向插入VEGF165基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-αVEGF)。18只裸鼠皮下接种人胰腺癌细胞株SW1990,随机分成3组(n=3),1周后瘤体内分别注射磷酸盐缓冲液(PBS,100μl,PBS对照组)、报告基因LacZ重组腺病毒(100μl,Ad-LacZ对照组)、反义VEGF重组腺病毒(100μl,Ad-αVEGF治疗组),隔日1次,共4次。1个月后处死动物。PCNA染色、TUNEL法和CD31染色观察反义VEGF165基因转染对胰腺癌细胞增殖、凋亡和血管生成的影响。结果Ad-αVEGF治疗组PCNA阳性表达率为(38.1±6.8)%,较LacZ组(89.6±4.3)%、PBS对照组(92.1±5.2)%明显降低(P<0.01),LacZ组与PBS对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。Ad-αVEGF治疗组细胞凋亡率(32.3±3.8)%,明显多于LacZ组(8.6±7.6)%和PBS对照组(9.9±4.2)%(P<0.01),LacZ组与PBS对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。Ad-αVEGF治疗组肿瘤微血管密度(12±3),明显少于LacZ组(26±5)和PBS对照组(25±4)(P<0.01),LacZ组与PBS对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论反义VEGF165基因转染可以抑制肿瘤细胞增殖,增加细胞凋亡,减少了肿瘤内微血管数量,从而抑制肿瘤生长。
刘海燕[4]2002年在《肿瘤血管内皮细胞相关基因的分离及鉴定》文中进行了进一步梳理肿瘤生长和转移依赖于肿瘤新生血管的形成，阻断新生血管形成，抑制肿瘤生长是近年来治疗肿瘤的一种新策略。肿瘤内皮细胞在肿瘤血管生成中有着至关重要的作用，是多种血管生成活性物质作用的关键性靶位，选择性地直接作用于肿瘤内皮细胞的药物将使抗血管治疗疗效更好，副作用更低。因此分离、克隆肿瘤血管内皮细胞相关或特异的基因，研究其功能将为研制筛选抗血管内皮治疗肿瘤的药物提供特异而重要的靶位。本文首次用肝癌肺癌组织匀浆活化的人血管内皮细胞建立了cDNA表达文库，筛选分离肿瘤血管内皮细胞相关或特异的基因，并对其中的2个基因进行了初步研究。 肿瘤血管内皮细胞相关基因的筛选分离 分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs，Human Umbilical Cord Vein Endothelial Cells)，用肝癌肺癌组织匀浆及血管内皮生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF进行培养及活化后，提取其mRNA，构建了原始库容为4×10~6pfu／ml的cDNA表达文库。采用抑制消减杂交(SSH)法对活化HUVECs和正常HUVECs cDNA进行消减，获得差异的cDNA片段，并采用随机引物法用~(32)P标记成探针。用正向消减探针对文库进行第一次筛选，反向消减探针进一步筛选去除假阳性。共获得阳性克隆177个。随机挑选70个进行核苷酸序列测定。生物信息学分析表明70个阳性克隆代表了35个基因片段。可以分为以下几类：A) 11个与肿瘤血管形成以及转移相关的基因。包括有①粘附分子基因，如骨粘连素(Osteonectin／SPARC)基因、纤连蛋
韩松, 王跃祥, 宋后燕, 倪泉兴, 花天放[5]2008年在《血管内皮生长因子_(121)反义核酸抑制人胰腺癌细胞体外促血管生成能力》文中认为目的:探讨VEGF121反义核酸对体外培养胰腺癌细胞促血管生成能力的影响,以期通过抑制VEGF引起的肿瘤血管生成来达到抑制肿瘤生长的目的。方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系BxPC-3在体外条件下培养,采用免疫组化检测肿瘤细胞表面VEGF及Flk-1表达水平。通过测定ECV-304生长曲线检测培养液上清对血管内皮细胞生长的影响。通过培养液上清体外血管生成试验检测肿瘤细胞体外促血管生成能力。结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,肿瘤细胞表面VEGF蛋白水平受到明显抑制,VEGF受体Flk-1表达水平上调。对血管内皮细胞ECV-304的促生长作用减弱。体外血管生成试验显示VEGF反义核酸能抑制肿瘤细胞体外促血管生成能力。结论:人反义VEGF121能显着抑制胰腺癌细胞表面的VEGF表达,抑制肿瘤细胞体外促血管生成能力。
韩松, 王跃祥, 宋后燕, 倪泉兴, 花天放[6]2007年在《VEGF反义核酸抑制人胰腺癌细胞的增殖》文中进行了进一步梳理目的:探讨VEGF121反义核酸对体外培养胰腺癌细胞增殖的影响,以求证明VEGF反义核酸具有抑制肿瘤生长的作用。方法:将稳定转染有VEGF反义核酸pcDNA3-ASVEGF121的胰腺癌细胞系BxPC-3在体外条件下培养,采用ELISA法检测其培养上清液中的VEGF表达水平。检测肿瘤细胞生长曲线,通过克隆形成试验检测肿瘤细胞的体外增值能力。采用Annexin Ⅴ-FITC和PI双标记法以流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况。结果:VEGF反义核酸转染BxPC-3细胞后,肿瘤细胞培养液上清VEGF蛋白水平受到明显抑制。生长曲线显示肿瘤细胞生长明显受到抑制,并且肿瘤细胞克隆形成率降低。流式细胞仪检测显示VEGF反义核酸能促进细胞凋亡。结论:人反义VEGF121能显着抑制胰腺癌细胞的VEGF表达,并能抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡。
宫向前[7]2004年在《Survivin基因在人大肠癌中的表达及其反义核酸治疗大肠癌的实验研究》文中研究表明背景:大肠癌作为人类多发性疾病,在世界范围内属于四大最常见恶性肿瘤之一,而且发病率有逐年增多的趋势,全球结直肠癌发病率平均每年递增2%,更重要的是结直肠癌治疗效果还不够理想,近30年来生存率提高不显着,寻求新的更有效的肿瘤标记物和治疗方法是生物医学的重要课题。凋亡是维持机体组织发生和内平衡的关键因素,这一过程紊乱所导致的细胞过渡生长和突变是肿瘤发生发展的基础。Survivin是1997年Altieri报道的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族新成员。作为一种新的凋亡抑制因子,是目前国内外分子生物医学研究的热点之一。它选择性地在人类常见恶性肿瘤中高表达,而在正常组织中不表达,与肿瘤的侵袭性和临床进展过程有关。另外,其蛋白作用与肿瘤细胞对抗癌药物和放疗的耐受性增加有关。因此survivin基因被认为是新型抗肿瘤治疗的理想靶基因。 反义核酸基因治疗是根据碱基互补原理,将具有与靶基因序列特异性的反义寡脱氧核苷酸导入肿瘤细胞,它与靶基因的相应的部位结合,抑制或阻断相应基因的表达转录,是肿瘤基因治疗方法中较有前途的一种。本研究首先研究survivin基因在人大肠癌中的表达及其临床意义,然后以它为靶基因,设计反义寡核苷酸
郭天康[8]2007年在《C-myc反义核酸联合5-氟尿嘧啶对肝癌细胞的生物学影响》文中研究说明恶性肿瘤严重危害人类的生命健康，当传统的治疗方法如手术、化疗、放疗等，对很多中晚期肿瘤患者束手无策时，生物治疗就成为必需的手段。基因治疗即其中之一，它是将基因通过载体转入患者体内，从而达到治疗和预防疾病的目的。肝癌是最常见且死亡率较高的恶性肿瘤之一，我国为肝癌高发国家，每年新发患者在10万以上，在我国农村和城市分别处于恶性肿瘤死亡率的第一、第二位，全世界每年有38.16万人死于肝癌，其中45％在中国。死亡率高，生存期短，严重威胁人民健康。在我国以HBV与肝癌发生的关系最为显着。肝癌临床上手术切除率低，对放、化疗敏感性差，转移情况普遍，预后极差，迫切需要新的治疗方法。近年来随着人们对肝癌分子病理机理研究的不断深入，为正在兴起的肝癌基因治疗提供了理论依据，促进了人们用分子手段治疗肝癌的探索性研究。提出了基因治疗与放疗、化疗、热疗相结合的综合治疗方案的新观点。本研究将C-myc反义核酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)和5-FU联合应用对肝癌细胞HEPG-2的生物学影响并观察基因治疗对化疗药物是否有明显的协同增强作用。采用常规培养HEPG-2细胞，用MTT法检测C-myc反义核酸和5-FU对肝癌细胞生长的抑制作用，通过荧光显微镜检测细胞形态变化，DNA电泳技术检测DNA ladder、流式细胞仪检测细胞周期和肿瘤细胞凋亡的发生，RT-PCR及免疫组化方法检测C-myc基因表达变化。结果表明①C-myc反义核酸能够抑制肝癌细胞增殖，诱导肝癌细胞的凋亡，并能够将肿瘤细胞阻滞于G_0／G_1期。②5-FU能够抑制肝癌细胞增殖，诱导肝癌细胞的凋亡，并能够将肿瘤细胞阻滞于S期。③C-myc反义核酸和5-FU联合应用作用于肝癌细胞时，有明显的协同作用，C-myc反义核酸能够增加肝癌细胞对5-FU的敏感性，提高5-FU对HEPG-2抑制效果。④反义核酸与化疗药物联合应用可大大降低药物浓度，提示化疗药物与基因治疗联合用药确实可起到提高药效降低用药剂量的作用有助于克服单用化疗药物所引起的不良反应大容易发生耐药等缺点并有助于解决单用治疗难以完全抑制肿瘤生长且成本较高等问题。综上所述C-myc反义核酸和5-FU能够分别抑制肝癌细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性，当两者联合应用时，表现出协同作用。荧光染色、DNA电泳技术、流式细胞仪检测证实C-myc反义核酸和5-FU都能够诱导肝癌细胞的凋亡。流式细胞仪检测细胞周期发现C-myc反义核酸能够将肿瘤细胞阻滞于G_0／G_1期，5-FU能够将肿瘤细胞阻滞于S期。RT-PCR及免疫组化方法结果显示C-myc反义核酸和5-FU都能够下调C-myc基因的表达，但这种对C-myc基因表达的抑制并无协同作用，这提示可能有其他基因参与了C-myc反义核酸和5-FU对HEPG-2细胞增殖抑制的协同作用。反义核酸与化疗药物联合应用可大大降低药物浓度，C-myc反义核酸对5-FU有增敏作用。
窦春青[9]2007年在《人FXYD6蛋白多克隆抗体制备及FXYD6与胆管癌细胞增殖、侵袭关系研究》文中进行了进一步梳理背景胆管癌早期诊断技术的改进是提高胆管癌疗效的关键因素之一。本课题组前期工作已在转录水平证实hFXYD6为胆管癌分化相关抗原。通过对FXYD6蛋白与胆管癌关系的逐步揭示，在为胆管癌早期诊断提供新的肿瘤标志物同时，也有望对胆管癌的发生演进发展有进一步认识。目的1．制备兔抗人FXYD6蛋白多克隆抗体。2．比较hFXYD6 mRNA、蛋白质在不同分化胆管癌组织的表达差异。3．探讨hFXYD6反义核酸对人胆管癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响。方法1．通过B细胞表位分析，设计hFXYD6抗原多肽，经原核表达、蛋白纯化、动物免疫、抗体纯化等过程，制备兔抗人hFXYD6蛋白多克隆抗体。2．采用SYBR~(?) GreenⅠ荧光定量Real Time PCR及免疫组化方法检测不同分化胆管癌hFXYD6 mRNA及表达差异。3．通过反义核酸技术研究hFXYD6蛋白与人胆管癌细胞增殖侵袭关系。构建hFXYD6反义核酸真核表达载体pcDNA3.1(-)／hFXYD6(-)并转染人胆管癌QBC939细胞，同时设pcDNA3.1(-)空载对照组和空白对照组。Real Time PCR和荧光免疫组化鉴定转染结果；MTT、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖活性；流式细胞仪检测细胞周期；Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力。结果1．经ELISA及免疫组化证实，成功制备高效价兔抗人FXYD6蛋白多克隆抗体。2．SYBR~(?) GreenⅠ荧光定量Real Time PCR结果表明：人FXYD6基因在正常胆管、高分化胆管癌及低分化胆管癌均存在表达；低分化组高于高分化组(P＜0.001)，高分化组高于正常组(P＜0.001)。免疫组化支持这一结果。3．与空白组和空载组比较，反义组细胞hFXYD6 mRNA及蛋白表达量降低；细胞群体倍增时间增加(46.8h vs 34.5h，35.3h)，细胞克隆形成率降低(24.3％±5.3％vs 61.0％±8.5％，58.0％±5.6％；P值均＜0.001)；细胞周期中G1期细胞比例明显升高(66.4％±2.9％vs 33.5％±2.3％，39.4％±3.7％；P值均＜0.001)，S期比例明显减少(18.6％±1.6％vs 36.2％±2.1％，34.1％±1.6％；P值均＜0.001)；Transwell侵袭小室中24h穿膜细胞数无显着改变(32.8±6.2 vs 34.4±5.3，29.4±5.2；分别为P=0.659，P=0.355)。空白组和空载组细胞间均无明显差异。结论1．hFXYD6与胆管癌分化相关，从正常胆管、高分化胆管癌到低分化胆管癌，hFXYD6表达量依次递增。2．hFXYD6反义核酸抑制人胆管癌QBC939细胞体外增殖活性，但对其侵袭能力无明显影响。
孙兴会[10]2004年在《尿激酶受体介导的基因转移研究》文中指出基因治疗的载体可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体是目前基因治疗的主要载体，但是病毒载体具有携带外源基因片段大小受到限制(7kb左右)、易引起机体免疫反应以及制备、贮存、质量控制比较困难等固有缺点，这促进了人们对非病毒载体的研究。在过去的十多年里，人们对受体介导的基因转移进行了广泛的研究，并取得了较大的进展。受体介导的基因转移有安全、低免疫原性、相对靶向性、载体制备简单、易规模化等许多优点。常用的受体有去唾液酸糖蛋白受体、胰岛素受体、血管内皮细胞生长因子受体、转铁蛋白受体、甘露糖受体、表皮生长因子受体、叶酸受体等。 肿瘤转移是肿瘤患者死亡的重要原因，尿激酶(urokinase,uPA)以及尿激酶受体(urokinase receptor,uPAR)在肿瘤转移过程中发挥着重要的作用。尿激酶受体以及纤溶系统中某些其它成员成为抑制肿瘤转移的靶标。靶向uPA和uPAR的单克隆抗体、可溶性uPAR、能阻断uPA和uPAR相互作用的uPA衍生肽都可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，uPAR反义核酸表达质粒对肿瘤细胞的侵袭和转移也有明显的抑制作用。 为了观察尿激酶受体反义核酸对肿瘤细胞的作用以及探讨尿激酶受体介导的基因转移的可能性，我们先利用重组腺病毒技术，在人肺巨细胞癌高转移株95D细胞中表达了尿激酶受体的反义基因，并观察其作用：同时表达纯化了尿激酶氨基末端的突变体，与报告基因表达质粒组装成复合物，观察该基因转移系统的基因转移效率，并介导尿激酶受体反义核酸靶向尿激酶受体的基因转移。 一．重组腺病毒介导的uPAR反义基因转移 为了观察uPAR反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用，用PCR方法扩增uPAR cDNA 5’端-46bp至+454bp一段长500bp的序列，克隆到病毒载体pAdeno-X中，构建出重组腺病毒载体pAdeno-X-uPAR(-)和pAdeno-X-uPAR(+)。PacI限制性内切酶线性化重组腺病毒载体，转染HEK293细胞，7天后可以获得滴度(pfu／ml)分别为1.5×10~8和0.5×10~8的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒，分别命名为Ad-uPAR(-)和Ad-uPAR(+)。以不同的病毒感染指数(MOI)感染人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞，3天后用RNA印迹法可以检测到肿瘤细胞中uPAR正义和反义核酸表达，随着MOI的升高，在Ad-uPAR(-)感染的肿瘤细胞中uPAR蛋白质水平逐渐下降，肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降，而感染Ad一uPAR(+)的肿瘤细胞无明显变化。结果表明重组腺病毒可以表达uRAR正义和反义核酸，uPAR反义核酸可以下调95D肿瘤细胞uPAR蛋白质水平，并明显抑制人肺巨细胞癌高转移株95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力。二.尿激酶受体介导的报告基因转移 利用能够被细胞内吞的重组蛋白发展靶向性非病毒载体系统，并进行基因转移是一个很有希望的研究方向。融合蛋白ATF一lyS10的氨基末端是尿激酶氨基末端135个氨基酸，起结合尿激酶受体的作用;梭基末端是10个赖氨酸，起结合质粒DNA的作用。在大肠杆菌中表达的ATF一lyslo主要以可溶形式存在，并具有人尿激酶的抗原性。纯化后的ATF一lyslo可以阻滞质粒DNA的迁移，并具有和细胞表面的尿激酶受体结合的能力。质粒DNA与ATF一lyslo以及多聚赖氨酸组装的基因转移复合物可以介导报告基因的转移，氯喳可以明显提高基因转移的效率，流感病毒血凝素融合肚的重组蛋白不能提高基因转移的效率。实验结果表明:①以ATF一lyslo重组融合蛋白组装的基因转移系统可以介导基因的转移②具有DNA结合能力和细胞靶向性的重组蛋白质ATF一lyslo为非病毒基因转移系统提供了一种新的途径。叁.尿激酶受体介导的ul】AR反义基因转移 将uPAR反义核酸表达质粒与ATF一lyslo以及多聚赖氨酸组装成基因转移复合物，并转染95D细胞。结果发现，AfF一lyslo介导的u队R反义核酸基因转移可以下调细胞uPAR蛋白水平，并降低细胞与纤连蛋白的粘附能力。Rl’- PCR可以检测到u队R反义核酸的表达，但uPAR mRNA水平没有明显下降。 ATF一lyslo介导的基因转移具有uPAR靶向性，而且基因转移复合物制备相对比较简单。其主要缺点有:①基因转移效率低;②基因转移复合物不够稳定，体内实验比较困难;③基因转移复合物存在非特异性结合细胞的可能。
参考文献：
[1]. VEGF反义核酸对胰腺癌增殖及血管生成影响的研究[D]. 韩松. 复旦大学. 2003
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[4]. 肿瘤血管内皮细胞相关基因的分离及鉴定[D]. 刘海燕. 中国协和医科大学. 2002
[5]. 血管内皮生长因子_(121)反义核酸抑制人胰腺癌细胞体外促血管生成能力[J]. 韩松, 王跃祥, 宋后燕, 倪泉兴, 花天放. 中国临床医学. 2008
[6]. VEGF反义核酸抑制人胰腺癌细胞的增殖[J]. 韩松, 王跃祥, 宋后燕, 倪泉兴, 花天放. 外科理论与实践. 2007
[7]. Survivin基因在人大肠癌中的表达及其反义核酸治疗大肠癌的实验研究[D]. 宫向前. 山东大学. 2004
[8]. C-myc反义核酸联合5-氟尿嘧啶对肝癌细胞的生物学影响[D]. 郭天康. 兰州大学. 2007
[9]. 人FXYD6蛋白多克隆抗体制备及FXYD6与胆管癌细胞增殖、侵袭关系研究[D]. 窦春青. 中国人民解放军军医进修学院. 2007
[10]. 尿激酶受体介导的基因转移研究[D]. 孙兴会. 复旦大学. 2004
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