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耐辐射奇球菌特异DNA甲基化修饰模式及其参与维持基因组稳定性的功能研究

2020-12-02阅读(118)

耐辐射奇球菌特异DNA甲基化修饰模式及其参与维持基因组稳定性的功能研究

论文摘要

耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）具有极强的DNA损伤修复能力,对电离辐射、紫外线、干燥以及各种DNA损伤化学试剂等引起的突变和致死效应都具有超强的抗性,被誉为世界上“最顽强的细菌”。耐辐射奇球菌作为研究生物体DNA损伤修复及基因组稳定性维持的模式生物之一,对其生存机理的研究将有助于深入认识极端环境压力下的生命活动过程和特有规律具有重大意义。本研究应用生化与分子生物学等技术方法鉴定了耐辐射奇球菌特异的DNA甲基化修饰模式及其关键DNA甲基转移酶,发现其在维持耐辐射奇球菌基因组稳定性中具有重要作用,阐明了该DNA甲基转移酶的生化特性,研究了DNA甲基化修饰对耐辐射奇球菌基因转录水平的调控作用。（1）利用第三代单分子实时测序技术（SMRT-Seq）对耐辐射奇球菌R1株（D.radiodurans R1,DraR1）基因组进行重测序及DNA甲基化修饰预测分析。通过构建甲基转移酶敲除株、超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱分析及SMRT-Seq等方法发现,DraR1基因组主要以N4-methylcytosine（4mC）修饰为主,含量约为1.3‰4mC/dC,由DNA甲基转移酶M.DraR1（Methyltransferase from DraR1）介导催化形成,修饰发生在“CCGCGG”保守motif上的第二个胞嘧啶C的N4位上;其次为N6-methyladenosine（6mA）修饰,含量约为0.4‰6mA/dA,由ORF2230P、ORF14075P和ORF15360P编码的甲基转移酶催化形成,但未鉴定到与该修饰有关的保守motifs;而5-methylcytosine（5mC）修饰的含量极其微弱,且没有发现相关甲基转移酶。因此,4mC甲基化修饰为耐辐射奇球菌的表观遗传标志。（2）通过对耐辐射奇球菌M.DraR1的生物信息学分析发现,其氨基酸序列中含有典型的DNA甲基转移酶保守结构域,从N端至C端依次为含“FxGxG”保守motif的甲基供体SAM结合域、TRD底物识别域及“SPPY”甲基转移催化域,属α型DNA甲基转移酶类;体内和体外生化功能分析结果显示,M.DraR1具有底物识别特异性,可严格地结合并甲基化修饰含“CCGCGG”保守位点的DNA底物,保护其免受同源性限制性内切酶SacII的切割,进一步证实了M.DraR1可介导催化耐辐射奇球菌基因组4mC甲基化修饰的形成。（3）通过表型分析并结合RNA-Seq测序,研究了4mC甲基化修饰对耐辐射奇球菌的生物学意义。结果显示,敲除M.DraR1基因后并不会影响耐辐射奇球菌的生长能力,但会引起该物种对高剂量的DNA损伤因子变得敏感,如UV、γ-ray辐照等;同时,还会显著提高耐辐射奇球菌的自发突变率、自然转化效率及重组率,表明4mC甲基化修饰的缺失会引起耐辐射奇球菌基因组的不稳定性。荧光显微镜和透射电镜结果显示,缺失4mC甲基化修饰后,耐辐射奇球菌中部分细胞表现出染色质DNA弥散、类核区扩大的特殊行为;转录组测序分析结果显示4mC修饰的缺失将导致DNA损伤响应和DNA修复等相关转录本的富集。这些结果暗示着4mC修饰可能通过影响耐辐射奇球菌DNA构象来调控其转录水平,进而参与维持其自身基因组的稳定性。综上所述,本研究鉴定了耐辐射奇球菌基因组特异的DNA甲基化修饰模式及其DNA甲基转移酶M.DraR1,结果表明4mC甲基化修饰具有参与维持该物种基因组稳定性的重要功能,首次揭示了4mC修饰在耐辐射奇球菌中介导的表观调控作用。研究结果加深了对DNA 4mC甲基化修饰参与维护耐辐射奇球菌基因组稳定性功能作用的新认识,而且也为深入研究细菌限制-修饰系统的表观调控分子机制奠定了理论基础。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • Abstract
  • 主要缩略词
  • 第1章 文献综述
  •   1.1 细菌DNA甲基化修饰研究进展
  •     1.1.1 细菌DNA甲基化修饰概述
  •     1.1.2 甲基化修饰碱基的检测方法
  •     1.1.3 细菌常见的甲基化修饰类型
  •     1.1.4 细菌DNA甲基化修饰的表观调控机制
  •   1.2 耐辐射奇球菌的研究进展
  •     1.2.1 耐辐射奇球菌的基本概述
  •     1.2.2 耐辐射奇球菌的极端抗性机制
  •     1.2.3 耐辐射奇球菌DNA甲基化修饰研究进展
  • 第2章 耐辐射奇球菌基因组SMRT测序及DNA甲基化分析
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料与方法
  •     2.2.1 菌株
  •     2.2.2 常用仪器
  •     2.2.3 本章所用化学试剂
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 试剂配制
  •     2.3.2 菌株的活化与培养
  •     2.3.3 总DNA的提取
  •     2.3.4 第三代单分子实时测序（SMRT-seq）
  •     2.3.5 多序列比对分析
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 耐辐射奇球菌基因组DNA提取质量评估
  •     2.4.2 耐辐射奇球菌基因组重测序数据分析
  •     2.4.3 基因预测与功能注释
  •     2.4.4 耐辐射奇球菌的比较基因组分析
  •     2.4.5 耐辐射奇球菌基因组DNA甲基化分布
  •     2.4.6 耐辐射奇球菌DNA甲基转移酶的预测
  •     2.4.7 耐辐射奇球菌限制性内切酶的预测
  •   2.5 小结
  • 第3章 耐辐射奇球菌基因组DNA甲基化修饰质谱鉴定
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 菌株
  •     3.2.2 主要仪器
  •     3.2.3 化学试剂
  •     3.2.4 试剂配置
  •     3.2.5 菌株活化与培养
  •     3.2.6 甲基转移酶基因敲除株的构建
  • 4-甲基脱氧胞苷（4mC/m4dC）的合成'>    3.2.7 标准品N4-甲基脱氧胞苷（4mC/m4dC）的合成
  •     3.2.8 合成的4mC鉴定
  •     3.2.9 超高效液相色谱-三重四极杆液质联用分析
  •     3.2.10 修饰碱基（6mA）的斑点杂交验证
  •     3.2.11 基因组DNA酶切分析
  •     3.2.12 统计分析
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 耐辐射奇球菌DNA甲基转移酶基因敲除株验证
  • 4-甲基脱氧胞苷的化学合成分析'>    3.3.2 标准品N4-甲基脱氧胞苷的化学合成分析
  •     3.3.3 核苷标准品UHPLC-QQQ-MS/MS分析及标准曲线制作
  •     3.3.4 耐辐射奇球菌基因组DNA甲基化修饰分析
  •     3.3.5 敲除株ΔM.DraR1的SMRT-Seq分析
  •     3.3.6 耐辐射奇球菌基因组DNA限制性酶酶切分析
  •     3.3.7 奇球菌属基因组DNA甲基化修饰质谱分析
  •   3.4 本章小结
  • 第4章 甲基转移酶M.DraR1的分离纯化及生化分析
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与方法
  •     4.2.1 菌株及质粒
  •     4.2.2 主要仪器设备与实验材料
  •     4.2.3 甲基转移酶M.DraR1及其同源物的Motif在线分析
  •     4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
  •     4.2.5 转化及质粒提取
  •     4.2.6 质粒pRRS-M.DraR1的构建
  •     4.2.7 质粒pRRS-M.DraR1的酶切分析
  •     4.2.8 可溶性M.DraR1蛋白诱导条件的优化
  •     4.2.9 甲基转移酶M.DraR1的纯化步骤
  •     4.2.10 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析
  •     4.2.11 凝胶迁移实验（EMSA）
  •     4.2.12 甲基转移酶M.DraR1体外酶活反应
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 多序列比对分析
  •     4.3.2 甲基转移酶M.DraR1体内活性分析
  •     4.3.3 甲基转移酶M.DraR1可溶性诱导条件的优化结果
  •     4.3.4 可溶性M.DraR1蛋白的纯化结果
  •     4.3.5 甲基转移酶M.DraR1的质谱鉴定结果
  •     4.3.6 甲基转移酶M.DraR1的底物结合特性
  •     4.3.7 甲基转移酶M.DraR1的体外酶活分析
  •   4.4 本章小结
  • 第5章 M.DraR1参与维持耐辐射奇球菌基因组稳定性作用
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料与方法
  •     5.2.1 菌种与质粒
  •     5.2.2 主要仪器设备与实验材料
  •     5.2.3 补偿株的构建
  •     5.2.4 生长曲线的测定
  •     5.2.5 突变率的测定
  •     5.2.6 表型与生存率的测定
  •     5.2.7 转化与重组效率的测定
  •     5.2.8 荧光显微镜分析
  •     5.2.9 透射电子显微镜分析
  •     5.2.10 RNA-seq及数据分析
  •   5.3 结果与讨论
  •     5.3.1 敲除株ΔM.DraR1生长能力与突变率分析
  •     5.3.2 敲除株表型及生存率分析
  •     5.3.3 转化效率及重组率分析
  •     5.3.4 敲除株ΔM.DraR1细胞显微结构分析
  •     5.3.5 转录组测序数据分析
  •     5.3.6 差异表达基因分析
  •     5.3.7 差异表达基因的富集分析
  •     5.3.8 4mC修饰参与调节DNA损伤响应
  •     5.3.9 4mC修饰参与维持耐辐射奇球菌的内核结构
  •     5.3.10 4mC修饰参与调控DNA修复
  •     5.3.11 4mC修饰调控耐辐射奇球菌的自然感受态能力
  •   5.4 本章小结
  • 第6章 总结与展望
  •   6.1 总结
  •   6.2 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读学位期间的研究成果

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 李胜杰

    导师: 华跃进

    关键词: 耐辐射奇球菌,甲基转移酶,甲基化,基因表达调控,基因组稳定性

    来源: 浙江大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 浙江大学

    基金: 国家自然科学基金(项目编号:31870051),国家重点研发计划(项目编号:2017YFA0503900),国家基础研究计划(项目编号:2015CB910600)

    分类号: Q933

    DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.001943

    总页数: 158

    文件大小: 5668K

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