导读:本文包含了亲和力成熟论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:抗体,亲和力,成熟,全人,分子,基因工程,噬菌体。
亲和力成熟论文文献综述
先德群[1]（2018）在《抗TSLP全人源重组抗体亲和力的体外成熟》一文中研究指出目的:胸腺基质细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)于20多年前,被鉴定为小鼠胸腺基质细胞系分泌的一种细胞因子。不久后,相应的人类直系同源基因也被发现。目前,TSLP所介导的信号传导通路已被广泛研究,包括上调多种Th2相关疾病的细胞因子,如:哮喘、遗传过敏性皮炎、超敏反应,甚至有部分癌症也与之相关。所以,TSLP被认为是治疗相关疾病的潜在靶标~([1])。自1975年杂交瘤技术问世以来,人们能制备具有良好特异性的单克隆抗体。但由于此类单抗的鼠源性,在用于治疗人类疾病时,会产生强烈的人抗鼠抗体反应(HAMA)~([2,3]),导致临床应用受到限制。目前的抗体药物领域的研究热点,主要集中于利用基因工程技术,将鼠源抗体进行人源化改造~([4-6])。单克隆抗体药物的发展先后经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体四个阶段~([7])。本实验平台前期构建大库容量全人源抗体文库和噬菌体展示技术,筛选获得了anti-TSLP-scFv(抗胸腺基质细胞生成素全人源单链抗体),很好的解决了免疫原性问题,但通过此技术获得的抗体亲和力较低~([8,9])。本研究通过计算机辅助技术对抗体和抗原进行同源建模,并通过分子对接和分子动力学模拟,预测可以提高抗体亲和力的氨基酸残基,进行定点突变,以促进抗TSLP人源重组抗体的体外亲和力成熟。方法:本研究前期,已通过噬菌体展示技术从全人源抗体文库筛选了特异性好的抗TSLP-scFv(84),并通过基因公司测序,获得了该抗体的DNA序列。1.本研究利用计算机辅助技术构建TSLP和抗TSLP-scFv的同源叁维模型,并使用分子对接技术进行分子动力学及力场模拟,获得合理稳定的对接模型。通过丙氨酸扫描及单点突变,预测出突变后能提高抗体亲和力的氨基酸位点。2.根据突变位点设计特异性引物,采取重迭PCR原理,对目的片段进行单点突变,获得突变后的抗TSLP-scFv的DNA序列。将突变后的序列与原核表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF,感受肽,表达后通过ELISA筛选出亲和力提升的抗TSLP-scFv菌株。3.将亲和力提升的抗体基因插入真核表达载体PCDNA3.1-sp-Fc和PMH_3~(en),转染HEK-293T细胞,表达抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定获得的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。4.通过生物大分子相互作用技术检测重组抗体的亲和力。结果:1.利用计算机Discovery studio4.5系统,建立TSLP抗原和抗TSLP-scFv叁维模型。通过BLAST Search(NCBI Server)搜索到与TSLP和抗TSLP-scFv序列相似度最高的5J11A和4KFZ C(VH)/4HS6 A(VL)作为初始模型。通过ZDOCK对蛋白质进行对接计算,基于CHARMm力场能量,使用RDOCK对ZDOCK寻找到的对接复合物构型进行优化。通过分子动力学模拟,获得最终的对接稳定构象Pose50。通过对接表面氨基酸分析,进行丙氨酸扫描及饱和突变,确定虚拟突变后亲和力提升的氨基酸组合为TRP(109)-ARG,TRP(109)-LYS,TRP(109)-TYR,TRP(109)-LEU,TRP(109)-GLU。2.通过突变位点的特异性引物相互配对,扩增出突变点前片段大小约为300bp,突变点后片段大小约为450bp。重迭延伸PCR连接后的抗TSLP-scFv基因片段大小约为750bp。3.将突变后的抗TSLP-scFv基因序列插入表达载体pLZ16,测序验证重组成功的质粒转化E.coli DH5αF,。通过原核系统表达抗TSLP-scFv,ELISA筛选出突变后的M4亲和力明显提升。4.突变前的84和突变后的M4基因序列,成功重组到真核表达质粒PCDNA3.1-sp-Fc和PMH_3~(en),转染HEK-293T细胞后表达的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白,经SDS-PAGE、Western blot鉴定大小约为67KD。5.生物大分子相互作用技术(BIAcore)测定突变后的M4,亲和力较突变前提高了约10倍。结论:利用计算机辅助技术,成功促进了抗TSLP重组抗体的体外亲和力成熟。(本文来源于《西南医科大学》期刊2018-05-01）
先德群,年四季,叶迎春,徐文峰,袁青[2]（2017）在《抗TSLP全人源单链抗体的体外亲和力成熟》一文中研究指出目的:对抗TSLP-scFv全人源单链抗体进行单点突变,以提高其亲和力。方法:本研究前期筛选了特异性好的抗TSLP-scFv,本研究利用Discovery Studio系统模拟TSLP和抗TSLP-scFv叁维结构,进行分子对接,对结合表位氨基酸进行随机突变,选取可显着提高其亲和力的氨基酸突变点,根据突变位点设计引物,采用重迭延伸PCR对氨基酸位点进行突变。将突变后的scFv基因与表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF,,表达后筛选亲和力提高的抗TSLP-scFv。结果:DS系统筛选出可以提高scFv亲和力的5个单点突变氨基酸位点,PCR扩增出突变后的抗TSLPscFv DNA片段大小为1000bp左右。将测序正确的菌株进行表达,通过ELISA筛选出与抗原结合力提升的抗TSLP-scFv;通过生物大分子相互作用技术,测定单抗的亲和力,突变后的scFv M4亲和力较突变前提高了10倍左右。结论:成功提升了抗TSLP-scFv全人源单链抗体的亲和力。(本文来源于《第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编》期刊2017-10-26）
先德群,年四季,叶迎春,徐文峰,袁青[3]（2017）在《抗TSLP全人源单链抗体的体外亲和力成熟》一文中研究指出目的:对抗TSLP-scFv全人源单链抗体进行单点突变,以提高其亲和力。方法:本研究前期筛选了特异性好的抗TSLP-scFv,本研究利用Discovery Studio系统模拟TSLP和抗TSLP-scFv叁维结构,进行分子对接,对结合表位氨基酸进行随机突变,选取可显着提高其亲和力的氨基酸突变点,根据突变位点设计引物,采用重迭延伸PCR对氨基酸位点进行突变。将突变后的scFv基因与表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF',表达后筛选亲和力提高的抗TSLP-scFv。结果:DS系统筛选出可以提高scFv亲和力的5个单点突变氨基酸位点,PCR扩增出突变后的抗TSLP-scFv DNA片段大小为1000bp左右。将测序正确的菌株进行表达,通过ELISA筛选出与抗原结合力提升的抗TSLP-scFv;通过生物大分子相互作用技术,测定单抗的亲和力,突变后的scFv M4亲和力较突变前提高了10倍左右。结论:成功提升了抗TSLP-scFv全人源单链抗体的亲和力。(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊2017年09期）
舒梅[4]（2016）在《抗独特型纳米抗体的亲和力成熟及检测伏马菌素B_1绿色免疫分析方法的研究》一文中研究指出伏马菌素(Fumonisin,FB)主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)等镰刀菌属产生的次级代谢产物,主要污染玉米及其制品。目前,已发现20多种伏马菌素及其衍生物,其中FB_1是最主要组分,其毒性也最强。检测样品中FB_1的方法有理化分析法和免疫分析法,免疫分析法具有选择性好、操作简便、耗时短、成本低等优点,适合于食品安全监测时高通量快速筛检。而FB_1是小分子化合物,一般采用竞争免疫分析模式进行检测;这种检测模式需要FB_1标准物和化学合成抗原,化学合成抗原时也需使用大量FB_1标准物及有机溶剂;这些物质的使用对操作人员的健康具有潜在的危害,若废液处理不当,还可能对实验室及环境造成污染。本研究以anti-FB_1 m Ab(3F11)为靶分子,从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库中淘选得到与anti-FB_1 m Ab(3F11)特异结合的抗独特型纳米抗体,以该抗独特型纳米抗体作为FB_1抗原模拟物,替代传统抗原,建立免疫分析方法提高检测灵敏度。其次,将抗独特型纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达,将融合蛋白作为酶标抗原,分别建立了一步酶联免疫分析和一步化学发光免疫分析方法。最后,通过热点随机突变使抗独特型纳米抗体亲和力得以提高,并将亲和力提高的Ab2Nb B_1D作为标准物,建立了FB_1绿色免疫分析方法。主要研究内容如下:1从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库中首次淘选得到抗FB_1单抗的抗独特型纳米抗体,建立以抗独特型纳米抗体替代传统抗原的绿色免疫分析方法。1.1基于抗独特型纳米抗体FB_1模拟物的淘选以anti-FB_1 m Ab(3F11)为靶分子,经过3轮亲和淘选,从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库中获得一株可与anti-FB_1 m Ab(3F11)特异性结合的抗独特型纳米抗体B26,建立了检测FB_1的间接竞争Phage-ELISA,该方法的IC50值为1.07±0.22 ng/m L。1.2抗独特型纳米抗体的表达及其在免疫检测中的应用将B26的编码基因克隆至pET-25b表达载体,构建原核表达载体pET-B26,自诱导表达纯化后得到可溶性的抗独特型纳米抗体,将其作为包被抗原建立Nb-ELISA;该方法的IC50为0.95±0.12 ng/m L,线性范围为0.27–5.92 ng/m L;灵敏度比传统ELISA提高了20倍;与FB2的交叉反应率为4.93%,与其它四种真菌毒素(DON、AFB_1、OTA、ZEN)无交叉反应;Ab2 Nb只选择与anti-FB_1 m Ab(3F11)可变区发生特异性结合,其为半抗原抑制性独特型抗体;对样品进行加标回收试验,回收率为71.90%-112.15%之间;分别采用Nb-ELISA与市售ELISA试剂盒对30份实际样品进行检测,两种方法检测结果的相关性为0.992。1.3抗原抗体结合动力学参数的分析采用生物薄膜光干涉技术分别对Ab2 Nb、FB_1-BSA与anti-FB_1 m Ab(3F11)的结合动力学参数进行测定;Ab2 Nb对anti-FB_1 m Ab(3F11)的KD值为164.6n M,FB_1-BSA对anti-FB_1 m Ab(3F11)的KD值为0.62 n M。Ab2 Nb与anti-FB_1m Ab(3F11)具有较低的亲和力,Nb-ELISA显示出比传统ELISA更高的灵敏度。结果提示:在竞争免疫分析方法中,小分子化合物与包被抗原竞争能力起关键作用,适当选用与抗体的亲和力较低的包被抗原,有利提高检测灵敏度。2成功将抗独特型纳米抗体与碱性磷酸酶融合表达,首次制备了纳米抗体类酶标抗原,建立检测FB_1的直接竞争一步法绿色免疫分析方法。2.1直接竞争一步ELISA的建立成功制备了抗独特型纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(Ab2 Nb-AP),该融合蛋白仍保留了良好的碱性磷酸酶活性和抗体结合能力;以Ab2 Nb-AP为酶标抗原,建立了检测谷物中FB_1的直接竞争一步ELISA;该方法的IC50为2.69±0.25ng/m L,线性范围为0.93–7.73 ng/m L,最低检测限(LOD)为0.35 ng/m L;批内加标回收率为81.50%-112.24%、批内变异系数为2.43%-11.41%,批间加标回收率为71.20%-114.03%、批间变异系数为2.51%-12.50%。2.2直接竞争一步CLIA的建立以Ab2 Nb-AP为酶标抗原,建立了检测谷物中FB_1的直接竞争一步CLIA;该方法的IC50为0.89±0.09 ng/m L,线性范围分别为0.29–2.68 ng/m L,LOD为0.12 ng/m L,灵敏度比以FB_1-BSA建立的两步法ELISA提高了9倍;与FB2的交叉反应率为4.93%,与其它四种真菌毒素(DON、AFB_1、OTA、ZEN)无交叉反应;批内加标回收率为85.40%-112.68%、批内变异系数为2.47%-13.03%,批间加标回收率为83.50%-109.25%、批间变异系数为2.74%-14.86%;实际谷物样本的检测结果与LC-MS/MS的检测结果相关系数为0.97。3抗独特型纳米抗体体外亲和力成熟3.1热点随机突变提高抗独特型纳米抗体亲和力对B26的CDR3区2处热点涉及4位氨基酸进行随机突变,通过亲和淘选获得4株突变子;相比B26,4株突变子的显色值明显增强,提示其与anti-FB_1m Ab(3F11)的结合活性增强,灵敏度均降低;B_1D、B2E、B3I和B4L与anti-FB_1m Ab(3F11)的KD值分别为10.4 n M、25 n M、49.5 n M和55 n M,提示4株突变子的亲和力均得到提高,其中B_1D与抗体的亲和力较B26提高15.8倍,进一步证实:在竞争免疫分析方法中,检测抗原与抗体的亲和力提高了,其检测灵敏度将低;相比B26和化学合成抗原,B_1D、B2E、B3I和B4L的热稳定性均有明显提高。3.2基于抗独特型纳米抗体的绿色ELISA方法的建立。分别建立以FB_1标准物及Ab2 Nb B_1D为标准物的间接竞争ELISA;在相同的抑制率下,Ab2 Nb B_1D浓度与FB_1标准物浓度具有良好的线性相关,方程为y=1.7x+3.2(R2=0.998),其中y为FB_1浓度,x为Ab2 Nb B_1D浓度;采用两步法计算FB_1含量,首先根据样品检测的抑制率计算替代标准物的Ab2 Nb B_1D浓度,然后通过Ab2 Nb B_1D浓度与FB_1的线性相关方程,再转换为样品中FB_1含量。进行FB_1的添加回收试验,批内加标回收率为75.60%-112.12%、批内变异系数为2.70%-9.66%,批间加标回收率为72.80%-115.44%、批间变异系数为3.17%-11.04%;分别采用以Ab2 Nb B_1D为标准物的间接竞争ELISA和LC-MS/MS用于实际玉米样本中FB_1含量的测定,并将其结果进行相关性分析,相关系数为0.986。(本文来源于《南昌大学》期刊2016-12-13）
刘媛,林曼曼,张霄,徐重新,焦凌霞[5]（2016）在《基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用》一文中研究指出从天然抗体库中筛选得到的抗体通常亲和力较低,在微摩尔水平;同时,经过多次免疫获得的天然抗体也存在100 pmol/L的亲和力极限。然而,以抗体亲和力体内成熟为理论基础的亲和力体外成熟技术,可以模拟体细胞高频突变和克隆选择过程。该技术可以解决库来源抗体亲和力不高、实际应用难的问题,也可以帮助天然抗体突破其亲和力极限。抗体基因体外突变技术可以模拟自体高频突变过程,是抗体亲和力体外成熟的重要手段,常见的抗体基因体外突变技术可以分为易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、DNA改组、突变株、定点突变和链替换等方法。易错PCR可以在抗体基因全长或部分区域随机引入突变,但随着突变率的增加,阳性克隆数量呈指数性递减。DNA改组包括抗体片段随机化切割和重组步骤,可以加快抗体的体外进化速度。突变株法易于构建超大容量的抗体库,但有害突变和突变率难以控制。定点突变的区域通常选择与抗原直接接触的互补决定区(complementary determination region,CDR)或自体突变热点进行操作。链替换通常保留母体抗体的一条重链或轻链,而对另一条链进行随机化组合。这些基因突变方法在提高抗体亲和力中获得了不同程度的应用,但也存在效率不高,且方法选择较为盲目等问题。可是,采用抗体X射线晶体衍射和计算机模拟等方法,却可以帮助预测抗体结合部位,为突变位点的理性设计和方法选择提供有效信息,因而成为亲和力体外成熟技术未来发展的趋势之一。(本文来源于《浙江大学学报(农业与生命科学版)》期刊2016年01期）
徐磊[6]（2015）在《靶向多亚型IFNα的新表位全人源单抗的体外亲和力成熟》一文中研究指出AIA22是从大容量全合成人单链噬菌体抗体库中通过高通量固相筛方法获得的一个抗多亚型IFNα全人源抗体分子,具有有别于临床在研同靶点抗体(Sifalimumab和AGS-009)的全新抗原表位(IFNAR2结合表位),能够有效中和除IFNa-7以外的全部IFNα亚型,具备与临床在研同靶点抗体完全不同的IFNα亚型中和谱。前期研究证实,AIA22较对照抗体Sifalimumab具有明显的表位优势,主要体现为AIA22在对IFNα-2b等亚型亲和力低于Sifalimumab的情况下表现出明显优于Sifalimumab的中和活性。但是,AIA22对多数亚型IFNα(IFNa-2b、4b除外)的中和活性不及对照抗体Sifalimumab,提示候选抗体分子AIA22有待进一步改造,以提升其对多个亚型IFNα的中和活性。本研究主要依赖基于结构的抗体体外亲和力成熟技术,对AIA22进行定点设计和改造,并评价其结合活性、中和活性、稳定性、代谢特征等分子特性,最终筛选获得对多亚型IFNα亲和力和中和活性明显提高的候选抗体分子,整体中和活性达到甚至超过对照抗体Sifalimumab的水平。首先,我们对AIA22轻重链CDR区进行了丙氨酸扫描,并通过ELISA方法鉴定丙氨酸扫描突变体对IFNa-1b和IFNa-2b的结合活性变化,结果揭示了抗原抗体相互作用的关键信息,为同源模建和分子对接方法构建的抗原-抗体复合物结构模型提供了实验数据支持。基于对复合物结构模型的分析,发现AIA22和IFNa-Ib亲和力低的可能原因是AIA22与IFNa-1b相互作用界面存在明显的结构冲突(重链Y99与IFNα-1b的LoopAB区)。结合丙氨酸扫描的结果,以改变冲突位点局部构象为目的,我们设计了一系列突变体抗体,ELISA鉴定其结合活性的变化,同时对结合活性显着改善的突变位点进行选择组合。采用ELISA和forteBio系统就组合突变体对IFNα-1b和IFNα-2b的亲和力及动力学特性进行鉴定,获得多个对IFNα-1b结合活性有改善对IFNa-2b结合活性不降低的突变体抗体。进一步地,对突变体抗体进行体外中和活性的鉴定,并最终获得对多个IFNa亚型中和活性明显提高的突变体抗体分子L-S34A+H-32G96W(命名为AIAmut)。相比于亲本抗体AIA22, AIAmut对IFNa-1b、2a、2b、4b、5、10、16、17、21的中和活性有不同程度的提高,对IFNα-6、8的中和活性基本保持不变,对IFNa-14中和活性降低明显。整体而言,AIAmut对IFNα中和活性有明显的提升。相比于对照抗体Sifalimumab,突变体抗体AIAmut在保证对IFNa-2b中和活性优势的前提下,对IFNα-4b、5、10、16、17、21的中和活性也达到Sifalimumab水平；对IFNα-1b的中和活性已接近Sifalimumab;对IFNα-6,8,14的中和活性与Sifalimumab仍存在较大差距。在基于结构模建进行分子设计的同时,我们成功结晶了AIA22-Fab/IFNα-2b复合物,并解析获得晶体结构信息。基于复合物晶体结构,以AIAmut为基础,我们设计了一系列突变体抗体分子。首先,我们构建了突变体抗体分子,并利用forteBio系统对突变体进行鉴定,比较突变体抗体分子对IFNα-lb的亲和力与结合特征的变化。对优选的突变体抗体分子,进一步检测其对IFNa-2b的亲和力与结合特征的变化。淘汰对IFNa-2b结合活性明显降低的突变体,最终得到W2S1A7、W2A7、W2A10、W2A11、S1A7、S1A10、S1A11、VV3共计8个候选突变体抗体分子。进一步地,我们以表达水平、稳定性和中和活性等为评价指标对8个候选抗体分子进行优选。稳定性评价方面,以4℃放置样品为标准品,分别以重组IFNα-1b-His、IFNα-2b-His和IFNα-4a-His为目标抗原,比较分析室温和37℃条件下于血清和pH6.5 PBS缓冲液中放置的各突变体抗体的结合活性,进而评价其稳定性。结果表明,除W3和SIA11的结合活性表现明显低于其他突变体及AIAmut外,其他突变体稳定性均好于AIAmut。考虑W3的表达水平明显低于其他突变体,直接淘汰W3。同时,结合各突变体抗体对IFNa-1b和IFNa-2b中和活性的初步评价结果,优选出W2S1A7、W2A7和W2A10叁个突变体抗体分子。与AIAmut相比,叁个突变体抗体分子对IFNα-1b和FNα-2b的中和活性均有提高,特别是对IFNa-1b的中和活性提升明显,达到甚至优于Sifalimumab的水平。就叁个候选抗体分子对各亚型IFNa的中和活性进行全面评价,结果表明,W2S1A7和W2A7对各亚型IFNa整体(除IFNa-14外)的中和活性提升更为明显。具体地,W2S1A7和W2A7对IFNα-2b、4a、21的中和活性优于Sifalimumab;对IFNα-1b、5、8、10、16、17的中和活性与Sifalimumab相当；对IFNa-6的中和活性有明显提高,但与Sifalimumab相比仍然存在较大差距；对IFNa-7仍无中和活性；相比于AIAmut,突变体抗体分子对IFNa-14的中和活性存在明显降低。Babl/C小鼠的体内的代谢特征评价结果表明,W2SIA7和W2A7体内半衰期均不低于120小时。相比之下,W2S1A7最高血药浓度及半衰期均优于W2A7,因此,我们最终确定W2S1A7为候选抗体药物分子。(本文来源于《安徽大学》期刊2015-05-01）
张天娇[7]（2015）在《乙肝表面抗体亲和力成熟的实验研究》一文中研究指出乙型肝炎作为全球十大致死性疾病之一，严重影响人类的生命健康。现阶段对于乙型肝炎来说还是预防为主，各类抗病毒药物的应用并没有取得令人满意的效果。但是，抗乙型肝炎病毒抗体的出现对乙型肝炎产生有效的防治作用，为乙型肝炎的防治带来新的希望。随着基因工程技术和结构生物学的飞速发展，对抗体的研究和应用起到了巨大的推进作用。通过基因工程技术改造的抗体虽然具有较好的特异性，但是操作繁琐，工作量大。结构生物学的发展有效的弥补了基因工程技术在抗体改造中的不足，可以通过计算机模拟技术对基因工程抗体的亲和力进行计算，减少突变抗体的数量，并进行进一步的优化。本课题通过计算机模拟技术对已获得的乙肝表面抗体亲和力进行优化，并通过生物学实验对其亲和力进行验证。我们首先利用生物信息学方法研究了乙肝病毒表面抗原M（Middle Hepatitis B SurfaceAntigen, MHBsAg）和目标抗体的序列特征，并从已有的数据库中分别找到了与之同源性较高、质量比较好的晶体结构。接着，利用同源模建技术以晶体结构1WZ4为模板构建了目标病毒MHBsAg表位的叁维结构，以晶体结构4JDT中的H链和晶体结构4KMT中L链为模板同源模建了目标抗体的重链和轻链，参考晶体结构1F11中抗体轻链和重链的组装方式构建了目标抗体的叁维结构。然后，利用分子力学技术，先后通过最陡下降法和共轭沉降法两步对预测得到的MHBs Ag表位和抗体复合物结构进行了适度优化。接着，通过分子对接技术将优化后的MHBsAg表位与目标抗体结构进行蛋白质‐蛋白质分子对接，优选出了目标病毒MHBsAg表位与目标抗体的较好的结合方式。该结合模式中MHBs Ag表位的一个螺旋部分镶嵌在轻、重两条链的loop区中间，MHBsAg的两个螺旋所形成的角度也尽可能多地把重链的CDR3区包住，增大了抗原‐抗体之间的相互作用，增强了抗体对抗原的识别，这些与之前的文献调研结果相符合。在对抗原‐抗体复合物进行了适度优化之后，我们对二者之间的相互作用进行了结构分析。在这个结合状态中，MHBs Ag能够很好的嵌入到抗体复合物轻链和重链CDR3区形成的凹槽中间，并与之进行充分地接触，在二者之间共产生了8个氢键相互作用，1个盐桥相互作用和1个阳离子‐π相互作用。在氢键相互作用中，抗体轻链参与的氨基酸主要有两个，Arg30和Tyr32，重链参与的氨基酸主要有4个，Tyr32、Arg98、Gln108和Tyr109，而MHBsAg表位参与的氨基酸有8个，Asn1、Ser2、Gln4、Phe5、His6、Tyr18、Gly22和Gly23。以这些相互作用为线索，对抗体轻链上的Arg30，Ala50和重链上的Arg98进行饱和突变，通过计算获得了突变前后的自由能变化图谱。将这叁个位点联合突变为结合能最大的氨基酸残基，构建抗体突变体并诱导表达，对其活性鉴定发现联合突变体的亲和力明显高于未经过结构优化的抗体。综上所述，本课题通过计算机模拟技术实现了对乙型肝炎表面抗体结构的优化，并且通过生物学方法证明经过结构优化的抗体亲和力确实得到了明显的提升。为全人源化乙型肝炎表面抗体的临床应用奠定了基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2015-04-01）
邓龙,周思,郭新东[8]（2014）在《基于基因突变的基因工程抗体亲和力成熟研究》一文中研究指出基因工程重组抗体可通过对基因序列的分析、修饰与修改,从而改进抗体特性。对基于基因突变的基因工程抗体亲和力成熟的方法进行总结,主要包括小分子有机物-抗体相互作用机制分析、抗体序列数据库及计算机模拟技术,以及新兴的分子模拟与对接技术。(本文来源于《生物技术进展》期刊2014年06期）
冷文娜,叶剑敏,王安利[9]（2013）在《斑点叉尾鮰IgM抗体亲和力成熟的研究》一文中研究指出抗体亲和力成熟是获得性免疫反应最重要的特征之一,即抗体的亲和力随着免疫反应而逐渐增加的过程。与哺乳动物相比较,抗体亲和力成熟的研究在硬骨鱼中才刚刚起步。本实验以斑点叉尾鮰为研究对象,腹腔注射TNP-KLH(T细胞依赖抗原)和TNP-LPS(T细胞非依赖抗原),采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测免疫后鱼血清IgM抗体的亲和力,通过酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测外周血B细胞分泌的IgM抗体亲和力,和运用流式细胞仪的方法测定B细胞表面IgM抗体的亲和力。通过以上研究得出:(1)TNP-LPS组(免疫后第3周免疫反应达到高峰)达到免疫反应高峰比TNP-KLH组(第4周免疫反应达到高峰)来的更早、更快;(2)在免疫反应早期,两个抗原免疫组都是以低亲和力抗体为主,随着免疫反应的进行,高亲和力的抗体在后期占据优势;(3)比较得出,血清抗体、B细胞分泌的抗体,以及B细胞表面抗体的亲和力成熟成正相关的关系。同时本研究建立了一种有效测定硬骨鱼类B细胞表面抗体亲和力成熟的流式细胞仪方法。抗体亲和力成熟的研究将为渔用疫苗的制备开发以及免疫反应的精确评价提供理论基础。(本文来源于《中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会论文摘要汇编》期刊2013-11-05）
金晶[10]（2013）在《人源抗狂犬病毒基因工程抗体亲和力成熟研究》一文中研究指出狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus, RV)引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百。根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)推荐,对狂犬病Ⅲ级暴露后的预防主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin, RIG)的方法。目前使用的两类RIG为人抗狂犬病毒免疫球蛋白(human rabies immune globulin, HRIG)和马抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equine rabies immune globulin, ERIG)。但ERIG副反应比较严重,而且对某些疫苗的抗体反应有抑制,HRIG价格昂贵,供应量有限并且有潜在的病原威胁。抗狂犬病毒单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAbs)具有中和效果高,安全性好,成本低,可大量生产等优点,能够取代RIG用于狂犬病的暴露后预防。抗体体外亲和力成熟主要是模拟体内亲和力成熟的过程,采取各种策略对抗体基因进行相应的突变,构建突变抗体库,通过亲和筛选获得高亲和力的抗体。在体外亲和力成熟的过程中,突变策略主要可分为随机突变、置换和定向突变。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,分别通过易错突变和链置换的方法筛选高亲和力的人源抗狂犬病毒中和抗体,实验有以下两部分：一、人源抗狂犬病毒scFv抗体易错库的构建与筛选为获得针对狂犬病毒糖蛋白II号表位的高亲和力抗体,我们采用scFv噬菌体展示平台,对一株糖蛋白II号表位中和抗体RV08采用链置换法进行改造。首先将母本抗体RV08的重链和轻链基因克隆入pHAL14载体,以此克隆作为模板进行6-8轮易错PCR。用已随机引入突变的质粒构建scFv噬菌体抗体库,使用高效噬菌体对scFv噬菌体抗体库进行包装。在成功构建scFv噬菌体抗体库的基础上,用纯化的狂犬病毒颗粒CTN株对scFv噬菌体抗体库进行富集筛选,利用ELISA、IFA对所获人源单克隆抗体scFv段基因的功能特性进行鉴定,并通过序列测定确定所获抗体的基因序列,我们获得90株抗狂犬病毒scFv抗体。二、人源抗狂犬病毒全抗体表达及功能鉴定将这90株抗体经293T双质粒真核表达系统表达IgG抗体,通过ELISA、IFA方法筛选到5株亲和力较高的针对狂犬病毒糖蛋白的抗体,通过非竞争ELISA方法测定亲和力。结果显示这5株抗体亲和力均能达到10-9M,对狂犬病毒CTN株具有良好的中和活性。其中,HL2、HL37和HL46亲和力分别为1.56x10"9M,1.88x10-9M,1.30×10-9M,略高于RV08。5株抗体轻链和重链的CDR区均有氨基酸发生突变,但重链CDR3区均无突变发生,提示仅通过易错PCR的方法引入少量的突变碱基,很难获得重链CDR3区有意义的氨基酸突变。综上所述,本研究运用噬菌体易错抗体库技术,构建了人源抗狂犬病毒scFv噬菌体抗体库,筛选获得了90株特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源scFv抗体。其中5株构建为IgG全抗体后显示出高亲和力。这一结果为实现单克隆抗体的亲和力成熟奠定了基础。(本文来源于《中国疾病预防控制中心》期刊2013-06-01）
亲和力成熟论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:对抗TSLP-scFv全人源单链抗体进行单点突变,以提高其亲和力。方法:本研究前期筛选了特异性好的抗TSLP-scFv,本研究利用Discovery Studio系统模拟TSLP和抗TSLP-scFv叁维结构,进行分子对接,对结合表位氨基酸进行随机突变,选取可显着提高其亲和力的氨基酸突变点,根据突变位点设计引物,采用重迭延伸PCR对氨基酸位点进行突变。将突变后的scFv基因与表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF,,表达后筛选亲和力提高的抗TSLP-scFv。结果:DS系统筛选出可以提高scFv亲和力的5个单点突变氨基酸位点,PCR扩增出突变后的抗TSLPscFv DNA片段大小为1000bp左右。将测序正确的菌株进行表达,通过ELISA筛选出与抗原结合力提升的抗TSLP-scFv;通过生物大分子相互作用技术,测定单抗的亲和力,突变后的scFv M4亲和力较突变前提高了10倍左右。结论:成功提升了抗TSLP-scFv全人源单链抗体的亲和力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
亲和力成熟论文参考文献
[1].先德群.抗TSLP全人源重组抗体亲和力的体外成熟[D].西南医科大学.2018
[2].先德群,年四季,叶迎春,徐文峰,袁青.抗TSLP全人源单链抗体的体外亲和力成熟[C].第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编.2017
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[4].舒梅.抗独特型纳米抗体的亲和力成熟及检测伏马菌素B_1绿色免疫分析方法的研究[D].南昌大学.2016
[5].刘媛,林曼曼,张霄,徐重新,焦凌霞.基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用[J].浙江大学学报(农业与生命科学版).2016
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[9].冷文娜,叶剑敏,王安利.斑点叉尾鮰IgM抗体亲和力成熟的研究[C].中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会论文摘要汇编.2013
[10].金晶.人源抗狂犬病毒基因工程抗体亲和力成熟研究[D].中国疾病预防控制中心.2013
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