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啶氧菌酯降解菌的筛选鉴定及其降解基因克隆

2020-12-02阅读(515)

啶氧菌酯降解菌的筛选鉴定及其降解基因克隆

论文摘要

啶氧菌酯（Picoxystrobin）是一种人工合成的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂,具有高效广谱和适用范围广等特点。随着啶氧菌酯使用范围的扩大和使用量的增长,生态环境中啶氧菌酯的残留量存在快速增加的风险,其对生态环境的潜在威胁也成为关注的热点。微生物降解具有安全和低成本等优点,是消除生态环境中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等农药残留最具有应用前景的技术之一。采用啶氧菌酯为唯一碳源的培养基选择性培养方法,筛选获得一株高效降解啶氧菌酯的降解菌PY3,生理生化鉴定结合16S rRNA系统发育分析表明,菌株PY3属沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustirs）。菌株PY3的最佳降解条件均为35℃和pH 6.0。在最佳降解条件下培养11 d,菌株PY3对50 mg/L啶氧菌酯的降解率达72.0%。采用气相色谱质谱联用仪测定降解菌降解啶氧菌酯的中间代谢产物,推导的菌株PY3降解啶氧菌酯的途径,包括苯环和N杂环之间氧桥键断裂后酯化,以及苯环和N杂环开环反应。采用酯酶活性染色,结合飞行时间质谱,从菌株PY3总蛋白获得了5个具有酯酶活性的降解酶肽段,根据红假单胞菌属细菌的基因组,采用PCR技术克隆了对应的5个酯酶基因,原核表达酯酶基因（加GST标签）,谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化带GST标签的酯酶蛋白,得到4个可溶性的融合蛋白P-RPA1879、P-RPA1844、P-RPA1745和P-gloB,蛋白分子量大小分别为65.7 kDa、77.4 kDa、71.3 kDa和54.7 kDa。降解活性测定结果表明,它们的降解平均速率分别为0.62、0.66、0.59和0.72 mg/（mg·min）。本研究为啶氧菌酯农药残留的微生物修复提供了降解菌及降解酶新资源,也为构建啶氧菌酯高效降解工程菌提供了科学依据。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 甲氧基丙烯酸酯类农药概述
  •     1.1.1 甲氧基丙烯酸酯类杀虫剂的发展现状
  •     1.1.2 啶氧菌酯农药简介
  •   1.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的危害
  •     1.2.1 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对陆生生物的毒性
  •     1.2.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对水生生物的毒性
  •     1.2.3 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对土壤生物的毒性
  •   1.3 甲氧基丙烯酸酯类农药降解菌研究
  •     1.3.1 啶氧菌酯在自然环境的代谢途径
  •   1.4 光合细菌降解农药的研究
  •   1.5 啶氧菌酯农药残留的检测
  •   1.6 蛋白表达系统的研究
  •   1.7 研究目的和意义
  • 第二章 降解菌的筛选、鉴定及其降解特性
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 主要培养基
  •     2.1.2 主要实验试剂
  •     2.1.3 主要仪器
  •     2.1.4 菌株的富集培养与分离
  •     2.1.5 菌株的鉴定
  •     2.1.6 菌株最佳生长条件
  •     2.1.7 菌株最佳降解条件
  •     2.1.8 菌株最佳条件下的降解动态
  •     2.1.9 啶氧菌酯降解中间代谢产物测定
  •     2.1.10 样品的萃取以及上样前处理
  •     2.1.11 气相色谱检测
  •   2.2 结果与分析
  •     2.2.1 菌株的鉴定
  •     2.2.2 菌株的最佳生长条件
  •     2.2.3 菌株的降解特性
  •     2.2.4 菌株在最佳条件下的降解动态
  •     2.2.5 菌株PY3降解啶氧菌酯的降解机理
  •   2.3 结论与讨论
  • 第三章 降解菌PY3降解啶氧菌酯的酯酶蛋白筛选与鉴定
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 主要仪器
  •     3.1.2 主要培养基和试剂
  •     3.1.3 Native-PAGE检测
  •     3.1.4 蛋白的LC-MS/MS扫描鉴定
  •     3.1.5 降解相关基因序列的获得
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 Native-PAGE及酯酶染色
  •     3.2.2 蛋白的LC-MS/MS扫描鉴定结果
  •   3.3 结论与讨论
  • 第四章 降解酯酶纯化及降解活性
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 主要仪器
  •     4.1.2 试剂和培养基
  •     4.1.3 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
  •     4.1.4 啶氧菌酯降解相关基因的克隆
  •     4.1.5 梯度PCR扩增目的片段
  •     4.1.6 目的条带的纯化回收
  •     4.1.7 原核表达载体的构建
  •     4.1.8 融合蛋白的诱导
  •     4.1.9 细胞的超声波破碎
  •     4.1.10 SDS-PAGE检测
  •     4.1.11 蛋白的纯化
  •     4.1.12 纯化蛋白的定量
  •     4.1.13 Western blot验证
  •     4.1.14 纯化蛋白的降解活性测定
  •   4.2 结果与分析
  •     4.2.1 基因组DNA的凝胶电泳检测
  •     4.2.2 降解相关基因的梯度PCR扩增
  •     4.2.3 回收目的片段
  •     4.2.4 原核表达载体的构建
  •     4.2.5 融合蛋白的初步诱导
  •     4.2.6 活性蛋白的诱导
  •     4.2.7 蛋白质纯化后的定量
  •     4.2.8 Western blot验证
  •     4.2.9 纯化蛋白的降解力测定
  •   4.3 结论与讨论
  • 第五章 总结与展望
  •   5.1 总结
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 祝腾辉

    导师: 刘勇

    关键词: 啶氧菌酯,沼泽红假单胞菌,降解基因,降解特性,降解酶活性

    来源: 湖南农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用

    单位: 湖南农业大学

    基金: 国家自然科学基金

    分类号: X172

    DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000602

    总页数: 69

    文件大小: 4068k

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