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银杏黄酮合成途径GbDFR家族三个新基因的克隆与功能研究

2020-12-02阅读(261)

银杏黄酮合成途径GbDFR家族三个新基因的克隆与功能研究

论文摘要

二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是参与植物黄酮合成途径下游花青素合成的关键酶。DFR不仅影响植物花和果实的颜色,而且对于植物不同黄酮组分的分配具有一定的调控作用。银杏作为最古老的孑遗植物,具有极高的营养价值和药用价值,尤其对心脑血管疾病的防治有显著的疗效。黄酮类物质是银杏提取物的主要活性成分之一,所以研究银杏黄酮合成途径具有重要的现实意义。本研究以拟南芥At DFR基因为参考,对银杏全基因组序列进行比对,发现了银杏Gb DFR家族的三个新基因并对这三个新基因的功能和特性进行了比较系统的研究。我们首先考查了外源激素和环境刺激对银杏黄酮合成及这三个基因表达的影响,初步分析了三个基因在外界刺激诱发银杏黄酮合成过程中的功能差异;然后分别构建了这三个基因的表达载体,通过注射烟草和拟南芥tt3突变体瞬时表达后的蛋白体外酶活实验初步验证这三个基因的功能;最后通过转化野生型烟草及拟南芥tt3突变体对这三个基因的功能进行进一步的验证。主要研究内容及结果如下:1、根据拟南芥的At DFR基因序列,利用生物信息学技术对银杏全基因组序列进行搜索比对,获得银杏三个基因的序列。通过序列比对分析,我们发现这三个基因与之前报道的三个Gb DFR基因不同,所以将它们分别命名为Gb DFR4、Gb DFR5和Gb DFR6。2、考察了外源施加水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）以及季节变化对银杏黄酮含量以及三个基因表达的影响。结果显示:SA和JA处理都能影响银杏黄酮的含量,不过它们对三个Gb DFR基因的调控比较复杂。另外,从四月份开始,银杏的花青素含量逐月上升,但是三个Gb DFR基因的表达量却逐月下降。3、克隆了这三个Gb DFR基因,构建了它们的35S超表达载体。4、通过注射烟草和拟南芥tt3突变体的叶片对Gb DFR蛋白进行瞬时表达,并对提取的蛋白进行体外酶活实验分析。结果显示,三个基因编码的蛋白在体外都具有DFR的酶活性。5、用叶盘法将三个Gb DFR基因的表达载体分别转入野生型烟草中,考察外源基因的表达对烟草花色及花青素含量的影响。结果显示,转基因烟草的花青素含量比野生型更高,花的颜色更深。6、通过花序侵染法将三个Gb DFR基因转化拟南芥tt3突变体进行功能回复实验,在刚刚获得的转基因阳性苗中观察到了多个生长点,推测与生长素运输有关。综上所述,本论文实验结果初步证明这三个基因能够行使DFR基因的功能,具有二氢黄酮醇4-还原酶活性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 植物次生代谢产物
  •   1.2 黄酮类化合物
  •   1.3 黄酮类化合物生物合成途径的研究进展
  •     1.3.1 拟南芥黄酮类化合物合成途径相关基因的研究
  •     1.3.2 其他物种的黄酮合成途径研究
  •   1.4 二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因研究概况
  •     1.4.1 植物DFR基因简介及其研究意义
  •     1.4.2 植物DFR基因的特征及功能研究
  •   1.5 银杏研究现状
  •     1.5.1 银杏黄酮类化合物
  •     1.5.2 银杏黄酮合成途径关键酶基因研究概况
  •     1.5.3 应用高通量测序进行银杏基因的研究
  •     1.5.4 外界环境对银杏黄酮合成及相关基因表达的影响
  •   1.6 立题依据与目的意义
  •   1.7 论文设计思路
  • 第二章 GbDFR三个新基因的克隆与表达载体的构建
  •   2.1 实验材料、试剂与仪器
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 试剂
  •     2.1.3 仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 GbDFR家族基因的克隆
  •     2.2.2 表达载体的构建及转化
  •   2.3 结果与分析
  •   2.4 讨论
  • 第三章 外源激素和季节变化对银杏黄酮和花青素合成及GbDFR4、GbDFR5 和GbDFR6 表达的影响研究
  •   3.1 实验材料、试剂与仪器
  •     3.1.1 实验材料
  •     3.1.2 试剂
  •     3.1.3 仪器
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 实验材料的种植
  •     3.2.2 SA对银杏黄酮合成及GbDFR基因的影响
  •     3.2.3 MeJA对银杏黄酮合成及GbDFR基因的影响
  •     3.2.4 季节变化对银杏花青素合成及GbDFR基因的影响
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 SA处理银杏幼苗
  •     3.3.2 MeJA处理银杏幼苗
  •     3.3.3 季节变化对银杏花青素合成及GbDFRs基因的影响
  •   3.4 讨论
  • 第四章 GbDFRs三个基因在烟草和拟南芥中瞬时表达产物的催化活性研究
  •   4.1 实验材料、试剂与仪器
  •     4.1.1 实验材料
  •     4.1.2 试剂
  •     4.1.3 仪器
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 拟南芥tt3 突变体材料的鉴定
  •     4.2.2 植物材料的培养及处理方法
  •     4.2.3 烟草中GbDFRs的表达检测
  •     4.2.4 注射后烟草和拟南芥中Gb DFRs编码的蛋白酶活检测
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 tt3 突变体材料鉴定结果
  •     4.3.2 GbDFRs注射烟草瞬时表达半定量PCR结果
  •     4.3.3 注射烟草和拟南芥中GbDFRs活性检测
  •   4.4 讨论
  • 第五章 GbDFRs三个基因在烟草中的表达及相关功能分析
  •   5.1 实验材料、试剂与仪器
  •     5.1.1 实验材料
  •     5.1.2 试剂
  •     5.1.3 仪器
  •     5.1.4 培养基
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 烟草无菌苗的种植
  •     5.2.2 烟草叶盘法遗传转化
  •     5.2.3 转基因植株的鉴定
  •     5.2.4 转基因烟草花和叶片中花青素含量测定
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 转基因烟草鉴定结果
  •     5.3.2 转基因烟草花青素含量测定
  •   5.4 讨论
  • 第六章 外源GbDFRs对拟南芥tt3 突变体表型的影响
  •   6.1 实验材料、试剂与仪器
  •     6.1.1 实验材料
  •     6.1.2 试剂
  •     6.1.3 仪器
  •   6.2 实验方法
  •     6.2.1 拟南芥tt3 突变体的培养
  •     6.2.2 花序浸染法转化拟南芥
  •     6.2.3 转基因拟南芥的鉴定
  •   6.3 结果与分析
  •   6.4 讨论
  • 第七章 结论与展望
  •   7.1 结论
  •   7.2 创新
  •   7.3 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 硕士期间发表的论文及参与的科研项目

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 董理想

    导师: 徐茂军,倪君

    关键词: 银杏,黄酮,功能分析

    来源: 杭州师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,林业

    单位: 杭州师范大学

    分类号: Q943.2;S792.95

    总页数: 85

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