文蓉[1]2009年在《柚苷酶生产菌株的选育及其酶学性质的研究》文中进行了进一步梳理柚皮苷是柑橘类果汁中的主要苦味成分,会明显的降低柑橘类果汁的品质。酶法脱苦与传统方法相比具有工艺简单、反应条件温和、对果汁品质无影响及环保无污染等优势因而是最理想的脱苦方法。本文采用透明圈法从沙田柚皮腐烂液中筛选出一株产柚营酶的野生菌株,随后采用紫外、亚硝基胍、亚硝基胍和紫外结合以及离子注入等方式对该菌株进行诱变选育,并对选育菌株所产柚苷酶的酶学性质进行了研究。主要研究结果如下：(1)出发菌株的筛选采用透明圈法从发霉的柚子皮上筛选到产柚苷酶能力强的菌株52株,经摇瓶复筛后得到菌株M1,其发酵液酶活为140.8 U/mL,经传代验证该菌株具有较好的遗传稳定性。对菌株M1进行传统形态学分类学鉴定,初步鉴定为青霉,命名为青霉M1(Penicillium sp.M 1)。(2)青霉M1(Penicillium sp.M 1)的紫外、亚硝基胍及紫外和亚硝基胍复合诱变UV诱变条件为15W紫外灯,照射处理时间5 min,获得一株高产柚苷酶菌株青霉U15(Penicillium sp.U 15),摇瓶发酵酶活为334.3 U/mL,其产酶能力较出发菌株提高了137.4%。NTG诱变条件为NTG浓度800μg/mL,时间2h,获得一株高产柚苷酶菌株青霉N09(Penicillium sp.N 09),摇瓶发酵酶活为380.5U/mL,其产酶能力较出发菌株提高了14.4%。紫外和亚硝基胍诱变条件为NTG浓度800μg/mL,UV照射时间为4 min,获得一株高产柚苷酶菌株青霉UN02(Penicillium sp.UN 02),摇瓶发酵酶活为448.9 U/mL其产酶能力较出发菌株提高了18.0%,经传代验证,该菌株具有较理想的遗传稳定性,而且具有比较理想的产酶潜力,有待进一步开发。(3)N+离子注入法诱变用N+离子注入法对高产菌株青霉UN 02(Penicillium sp.UN 02)进行进一步的诱变选育,采用注入能量为15 KeV,剂量为192×1013 ions/cm2范围附近诱变,经过透明圈初筛和摇瓶复筛得到青霉1523(Penicillium sp.1523),摇瓶发酵酶活为573.6 U/mL,其产酶活力出发菌株提高了27.8%,且该菌株具有较好的遗传稳定性,是一株比较理想的柚苷酶高产菌株。(4)柚苷酶酶学性质的研究通过对青霉1523(Penicillium sp.1523)所产柚苷酶的酶学性质试验,得出最适反应温度为50℃,最适pH为4.0；多种金属阳离子对该酶活性有不同的影响,Ca2+、Mg2+在浓度为2.5～100 mM时,对柚苷酶酶活有促进作用；Mn2+、Zn2+、EDTA在浓度为2.5-30 mM时,对柚苷酶酶活有促进作用；Cu2+在浓度为2.5-50 mM时对柚苷酶酶活有促进作用；Fe2+、SDS在浓度较低时对柚苷酶酶活有抑制作用。
马晶[2]2003年在《DS9701菌株的诱变及其酶学性质的研究》文中研究说明聚 3-羟基丁酸(PHB)不仅具有热塑性塑料的性质，还在自然环境中具有生物可降解性，因而成为传统石化塑料的替代品，在工业等领域具有广阔的应用前景，也成为国内外生物材料领域的研究热点。 自然界中的许多种微生物都具有降解PHB的能力，这依赖于分泌一种特殊的胞外PHB解聚酶。本项工作主要是筛选能高效降解PHB的突变株，并对其进行酶学性质的研究，主要结果如下： 1．以青霉(Penicillium.sp)DS9701为出发菌株，通过紫外线诱变分生孢子，采用透明圈初筛和摇瓶培养复筛的方法，获得4个能稳定遗传的PHB解聚酶高产菌株。其中09菌株的酶活是原始菌株的2.3倍。 2．初步研究了02、04、09和14菌株粗酶液的基本性质。02菌株粗酶液的最适反应温度45℃～50℃，温度稳定范围40℃～50℃；最适反应pH 5.0，pH稳定范围4.0-5.0。04菌株粗酶液的最适反应温度50℃，温度稳定范围40℃～50℃；最适反应pH 5.0，pH稳定范围5.0～7.0。09菌株粗酶液的最适反应温度50℃～60℃，温度稳定范围40℃～50℃；最适反应pH 5.0，pH稳定范围5.0～7.0。14菌株粗酶液的最适反应温度40℃，40℃以下稳定；最适反应pH 5.8，pH稳定范围5.0～8.0。 3．经过比较粗酶液的性质后，对09号菌株产生的PHB解聚酶进行了分离纯化，并对其解聚酶的特性进行了探讨。以粗酶液为起始，经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤后，分离纯化了该酶，纯化倍数约为37.9，酶活力回收率8.9％。经12.5％SDS-PAGE法测得所分离纯化酶蛋白的相对分子质量约为41.5KD。该酶反应的最适温度和pH分别为50℃和5.0。在温度50℃以下和pH 5.0～6.0范围内稳定。一些金属离子对PHB解聚酶有抑制作用。质谱仪测得酶降解PHB的产物主要是二聚体。
王淑媛[3]2008年在《青霉TS67的诱变选育及抗真菌作用机理研究》文中指出海洋真菌TS67是从渤海海域分离获得的一株青霉菌株,该菌株能产生抗植物病原真菌病害的次级代谢产物,对多种植物病原真菌具有不同程度的抗性,抗菌谱较广。本文针对玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolaris maydis)和大豆尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)这两种植物病原真菌对青霉TS67从高产菌株的选育,活性物质的理化性质及类型分析,抗真菌机制等方面进行了系列研究。(1)为了提高青霉TS67的抗真菌活性,对其分生孢子进行物理和化学诱变处理,通过平板对峙法和管碟法,获得3株高产且传代稳定性较好的突变菌株Z10,W8,UD3,其抑菌活性分别比原始菌株提高了41.9%,45.6%,31.3%。(2)初步探讨了青霉TS67菌株发酵活性产物对玉蜀黍平脐蠕孢菌和大豆尖孢镰刀菌的抑制作用,结果表明:用50%发酵液处理120h后,对两种病原菌菌丝生长的抑制率分别为77.78%,70.30%,孢子产生抑制率分别达58.8%,73.5%;50%发酵液处理孢子12h,孢子萌发抑制率分别达78.3%,62.0%。电镜实验表明:经抗菌活性物质处理后的菌丝呈现菌体表面瘤状畸形、菌丝生长顶端不规则膨胀、菌丝体内部发生原生质浓缩等现象,初步推测该抗菌活性物质能够作用于病原真菌细胞壁。理化性质及分离提取实验证实青霉TS67菌株产生的抗真菌活性物质属于蛋白类物质。(3)采用3,5-二硝基水杨酸法检测青霉TS67发酵液中几丁质酶和β-葡聚糖酶活力,结果表明几丁质酶和β-葡聚糖酶的比活力分别为2.2 U/mg 13.1 U/mg。同时对β-葡聚糖酶酶学特性研究,结果表明该酶在弱酸,60℃条件下较稳定,酶反应的最适pH5.0,最适反应温度55℃,金属离子K~+,Mg~(2+),Ca~(2+),Al~(3+),Mn~(2+),Fe~(2+),Fe~(3+),Zn~(2+)对该酶有的激活作用,采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的分子量约为62KDa。
周海路[4]2006年在《DS9701-D2菌株PHB解聚酶的纯化及性质研究》文中研究表明聚-β-羟基丁酸酯(PHB)是许多细菌非平衡生长状态下积累的碳源、能源储藏物,它作为一种新型的可生物降解材料,不仅具有与化学合成塑料相似的物理机械特性,还具有完全的生物降解性以及较好的生物相容性,成为国内外生物材料领域的研究热点。 环境中广泛分布有可降解胞外PHB的微生物种类。对于细菌降解PHB的研究已经比较深入,而对于真菌降解PHB的生物学性质及环境影响因素缺乏了解。本项工作主要是从一株可高效降解PHB的青霉的发酵液中分离纯化其PHB解聚酶,对其进行酶学性质及蛋白质基本结构的研究,主要结果如下: 1.青霉(Penicillium sp.)DS9701-D2菌株分泌PHB解聚酶的最高峰出现在96h。发酵液经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-100HR层析后,分离纯化得到PHB解聚酶,纯化倍数为45.7,回收率为9.7%。利用SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的纯度。 2.PHB解聚酶的酶学性质:酶促反应的最适温度和最适pH分别为30℃和5.0。酶在温度45℃以下和pH5.0～6.0范围内稳定。金属离子Na~+、K~+对PHB解聚酶的活性有明显的促进作用,而Zn~(2+)、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)对该酶有抑制作用。通过双倒数作图法求得该酶的Km值为0.69g/L。质谱仪测得PHB解聚酶酶促降解PHB的产物主要是二聚体,而菌株发酵终产物主要是3-HB单体。 3.酶蛋白的相对分子质量为46.8KDa,等电点为7.6。其氨基酸组成为:天冬氨酸(Asp)14.1%;谷氨酸(Glu)9.1%:丝氨酸(Ser)5.5%;组氨酸(His)3.8%;精氨酸(Arg)3.2%;甘氨酸(Gly)7.5%;苏氨酸(Thr)9.5%;脯氨酸(Pro)5.9%;丙氨酸(Ala)8.4%;缬氨酸(Val)7.2%;甲硫氨酸(Met)2.6%:异亮氨酸(Ile)4.9%;亮氨酸(Leu)7.0%;苯丙氨酸(Phe)4.5%;赖氨酸(Lys)4.1%;酪氨酸(Tyr)5.1%。 4.应用CD光谱检测蛋白质的二级结构,α-螺旋、β-转角和任意卷曲分别占47.9%,23.1%,29.0%。
郭子琦, 李凡, 刘东波, 夏红梅, 陈珊[5]2011年在《Penicillium sp.DS9701-09分泌的聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的纯化及性质研究》文中研究说明以Penicillium sp.DS9701-09为研究对象,对其分泌的PHB解聚酶进行分离纯化和表征.通过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-100凝胶过滤,从发酵液中纯化了一种对PHB具有高效降解能力的解聚酶,纯化倍数为37.9,酶活力回收率为8.9%.经SDS-PAGE检测,确定酶蛋白的相对分子质量为41.5 kDa.酶反应的最适温度和pH分别为50℃和5.0,在50℃以下和pH=5.0~6.0之间酶的稳定性较好.金属离子对PHB解聚酶具有一定的抑制作用,降解酶对PHB的酶解产物主要是羟基丁酸二聚体.
王伟华[6]2006年在《聚β-羟基丁酸酯解聚酶发酵及酶性质研究》文中指出聚β-基丁酸酯(PHB)为微生物在不平衡生长条件下于细胞内合成的一类贮藏性聚酯,广泛存在于自然界原核生物中。因其不仅具有与化学合成高分子相似的性质,而且,其良好的生物相容性、生物降解性、光学活性和压电性等独特的性质使得PHB可以作为包装材料、光学材料和医用材料等取代通用的塑料而得到多方面的应用。本实验是在对PHB解聚酶降解行为充分研究的基础上,优化发酵生产和分离纯化途径,对Penicillium sp. DS9713a菌株产生的胞外聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶进行提纯,并对其酶学性质及蛋白质学性质进行了初步研究。主要实验结果如下:1、以青霉(Penicillium sp.),编号DS9713a为实验菌株,采用传统摇瓶培养和发酵罐发酵生产胞外PHB解聚酶。产酶高峰分别出现在96h和72h。对发酵液按以下流程进行分离纯化:发酵液处理--->超滤浓缩(截留分子量5000)--->(NH_4)_2SO_4沉淀除杂(40%饱和度)--->分级透析--->冷冻干燥---> Sepharose CL-6B凝胶色谱。经检测纯化后的PHB解聚酶,纯化倍数为59.1,总酶活回收率为20%。2、酶蛋白基本性质:采用高效液相色谱对酶蛋白单一性进行检测,结果显示样品纯度较好;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一谱带,依据PHB解聚酶的Rm求得其分子量为18 000Da;采用连续聚丙烯酰胺等电聚焦电泳等电点pI为7.6;最适pH为8.6;化学试剂EDTA对PHB解聚酶抑制率最强,SDS,巯基乙醇使酶活损失较大,H_2O_2,尿素对酶活抑制不明显。3、PHB解聚酶蛋白质学研究:Agilent1100型氨基酸自动分析仪分析样品氨基酸组分,结果显示,DS9713a菌株所产生的PHB解聚酶除Met外含有15种常见氨基酸,其中天冬氨酸和谷氨酸含量较高,其侧链基团可能在底物结合或酶的催化反应中起作用;圆二色谱分析显示酶蛋白二级结构为:Helix:47.5%,Turn:24.3%, Random:28.2%;以PHB为底物,对降解产物进行质谱检测,结果降解产物为3HB单体。
参考文献：
[1]. 柚苷酶生产菌株的选育及其酶学性质的研究[D]. 文蓉. 中南林业科技大学. 2009
[2]. DS9701菌株的诱变及其酶学性质的研究[D]. 马晶. 东北师范大学. 2003
[3]. 青霉TS67的诱变选育及抗真菌作用机理研究[D]. 王淑媛. 天津商业大学. 2008
[4]. DS9701-D2菌株PHB解聚酶的纯化及性质研究[D]. 周海路. 东北师范大学. 2006
[5]. Penicillium sp.DS9701-09分泌的聚β-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶的纯化及性质研究[J]. 郭子琦, 李凡, 刘东波, 夏红梅, 陈珊. 内蒙古师范大学学报(自然科学汉文版). 2011
[6]. 聚β-羟基丁酸酯解聚酶发酵及酶性质研究[D]. 王伟华. 东北师范大学. 2006