酿酒酵母中去乙酰化酶Hda1调节亮氨酸代谢机制的研究

论文摘要

亮氨酸是人体中含量最为丰富的必需氨基酸之一,作为调节因子控制蛋白的合成和降解,参与调节能量代谢并为蛋白合成提供底物。亮氨酸缺乏导致严重的生长缺陷,因此维持亮氨酸的代谢平衡对于生物活动的正常进行相当重要。生物体中存在多种蛋白质修饰方式,调控着细胞的各种生理以及病理过程。乙酰化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,涉及到转录调控、信号通路调控、代谢调控、蛋白质活性调控乃至病原微生物感染调控等多个重要生理功能而受到广泛关注与研究。我们在探寻营养代谢的过程中,首次发现并证实真核生物中去乙酰化酶Hda1在亮氨酸的代谢过程中起着重要调节作用。本论文以酿酒酵母为模式生物,利用分子生物学和代谢组学的方法研究去乙酰化酶Hda1在亮氨酸代谢过程中的调节作用。实验结果显示HDA1基因敲除菌株在SC培养基中显示出生长缺陷并且其亮氨酸含量当对于野生型菌株显著降低。补充外源亮氨酸,hda1?细胞恢复生长,而其它氨基酸等氮源则无恢复效应。利用自发突变,筛选hda1?细胞突变菌株,检测发现其亮氨酸含量均恢复到野生型（WT）水平。自发突变菌株全基因组测序结果表明SEO1（推断的通透酶）和BAP2（高亲和力的亮氨酸转运蛋白）的蛋白序列发生点突变（Seo1-A242G,Bap2-D573N）,COS4（调控蛋白周转的蛋白）则是在表达水平发生变化。在hda1?细胞中过量表达SEO1、BAP2和COS4均能恢复在SC培养基上的生长。m RNA表达水平测定和Lac-Z报告基因实验结果显示,BAP2和COS4在hda1?细胞中的m RNA表达显著高于野生型水平;而亮氨酸均诱导SEO1、BAP2和COS4 m RNA表达。蛋白水平检测结果证实SEO1以及突变体SEO1在野生型和hda1?细胞中并无显著差别。本论文研究结果证明去乙酰化酶Hda1通过调控SEO1、BAP2和COS4来控制亮氨酸吸收,从而影响细胞的生长。该机制的阐明将为亮氨酸引起的营养缺陷和疾病产生机制提供全新的诠释和思维。

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摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 课题研究背景

1.1.1 亮氨酸在生命活动中的作用

1.1.2 去乙酰化酶HDA1 在生命活动中的作用及研究意义

1.2 研究现状及发展动态分析

1.2.1 亮氨酸代谢及功能的研究现状及发展动态

1.2.2 去乙酰化酶Hda1 的研究现状及发展动态

1.3 课题研究内容概述

第2章去乙酰化酶Hda1 新功能的发现

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 供试菌株

2.1.2 仪器和设备

2.1.3 培养基和试剂的配制

2.1.4 主要试剂及药品

2.2 方法

2.2.1 菌种的活化与保藏

2.2.2 各种培养基中细胞的生长实验

2.2.3 生长曲线的测定

2.2.4 质谱测定酵母细胞中氨基酸含量

2.3 结果与分析

2.3.1 HDA1 基因敲除菌株在SC培养基中显示出生长缺陷

2.3.2 在SC培养基中添加YPD培养基成分后hda1?细胞的生长状况

2.3.3 不同氮源对hda1?菌株在SC固体培养基上生长缺陷的影响

2.3.4 探究HDA1 基因的敲除影响亮氨酸的代谢类型

2.4 小结

第3章 HDA1 调节亮氨酸代谢机制相关基因的筛选

3.1 实验材料与仪器

3.1.1 仪器和设备

3.1.2 培养基和溶液的配制

3.1.3 主要试剂

3.2 方法

3.2.1 突变体的筛选

3.2.2 突变体全基因组DNA的提取

3.2.3 质粒的构建

3.2.4 酵母转化

3.2.5 生长实验

3.2.6 突变菌株的筛选

3.2.7 高压液相色谱

3.3 结果与分析

3.3.1 hda1?自发突变体的筛选

3.3.2 突变体功能的鉴定

3.3.3 突变体全基因组测序结果分析

3.3.4 候选基因的克隆

3.3.5 候选基因的功能鉴定

3.4 小结

第4章 HDA1 调控亮氨酸代谢机制的研究

4.1 实验材料与仪器

4.1.1 仪器及设备

4.1.2 培养基和实验相关试剂的配制

4.1.3 主要试剂

4.2 方法

4.2.1 Lac-Z报告基因质粒构建

4.2.2 酵母转化实验

4.2.3 β-半乳糖苷酶报告基因实验

4.2.4 qPCR引物设计

4.2.5 提取酵母细胞中的RNA

4.2.6 qPCR实验

4.2.7 酿酒酵母细胞蛋白的提取

4.2.8 蛋白印记法（Western Blot）

4.3 结果与分析

4.3.1 定量PCR测定HDA1 调控候选基因的mRNA水平

4.3.2 Lac-Z报告基因的方法测定HDA1 调控候选基因的mRNA水平

4.3.3 Western Blot测定候选基因的蛋白水平

4.4 小结

总结

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 芦雯

导师: 伍晓斌

关键词: 酵母,亮氨酸,去乙酰化,代谢机制

来源: 上海师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海师范大学

分类号: Q936

总页数: 70

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酿酒酵母中去乙酰化酶Hda1调节亮氨酸代谢机制的研究

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