论文摘要
M23家族蛋白酶具有内肽酶和酰胺酶活性,能降解细菌细胞壁肽聚糖,作为新型的蛋白类抗生素倍受关注。部分噬菌体裂解酶属M23家族蛋白酶,能高效地裂解多重耐药性细菌,使其有望应用于取代传统的抗生素治疗。本文在已获得腾冲热海栖热菌噬菌体TSP4基因组的基础上,分析此噬菌体裂解酶基因的基本特征,对裂解酶基因进行克隆表达,同时探索利用高温酶热稳定性高的特点,建立基于菌体热裂解的重组裂解酶快速纯化方法,并通过抑菌活性和AFM观察评价纯化后裂解酶的活性。最后将裂解酶用可溶性淀粉吸附制备成酶制剂,定期评价酶制剂的酶活变化。为了探索裂解酶的裂解机理,本文分别利用革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的肽聚糖,与裂解酶进行反应,研究其对肽聚糖的吸附特征,通过液质联用分析裂解酶水解肽聚糖的位点,并进一步通过对裂解酶基因的定点突变,验证裂解酶的活性位点及特征。为了探索裂解酶的抑菌效果,本文通过致死率分析及电镜观察,评价裂解酶对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和多重耐药肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果。并通过在小鼠身上制造了皮肤伤口,定殖耐药金黄色葡萄球菌随后用TSPpgh对局部进行治疗,探索裂解酶在治疗多重耐药金黄色葡萄球菌在外伤感染中的作用。结果表明,栖热菌噬菌体TSP4裂解酶TSPpgh属于M23肽酶家族,推测motif HXXXD和HXH为TSPpgh的活性位点,并进行了突变验证。将裂解酶基因TSPpgh克隆表达后,得到分子量19 KDa的重组蛋白。通过对诱导表达后的发酵液升温至55℃并维持20分钟,能使细胞破裂并变性沉淀去除掉绝大多数表达菌株大肠杆菌的蛋白,从而实现裂解酶的快速纯化,结合高密度发酵技术,发酵液中裂解酶浓度可达2 mg/mL。裂解酶对金黄色葡萄球菌ATCC 6538的杀菌效率最高,可达90%。通过AFM观察表明,TSPpgh裂解了大肠杆菌BL21（含TSPpgh质粒）和金黄色葡萄球菌的细胞壁,制备的酶制剂在20℃保存一年其酶活能保持75%。裂解酶TSPpgh能够吸附和水解革兰氏阴性菌和阳性菌的肽聚糖,并且能够水解弹性蛋白。通过液质联用分析TSPpgh水解肽聚糖的位点表明,TSPpgh还能够水解糖苷键Glcp-β-1’-6’-Glcp-β-1’-1’,具有糖苷酶的活性。抑菌实验表明,TSPpgh在37℃、酶浓度为68μg/mL的浓度下,裂解酶TSPpgh对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌CMCC（B）50094和大肠杆菌CMCC（B）44102菌株的致死率达90%,对多重耐药肺炎克雷伯氏菌的致死率高达80%以上,部分致死率可达100%;通过SEM观察表明,裂解酶TSPpgh通过裂解作用而实现其杀菌功能。本研究在小鼠身上制造了皮肤伤口,定殖耐药金黄色葡萄球菌2612-1606BL1486,随后用TSPpgh对局部进行治疗。在为期9天的治疗期间,TSPpgh和卡那霉素均快速的促进了伤口愈合。验证了裂解酶TSPpgh在治疗多重耐药金黄色葡萄球菌在外伤感染中的作用。本文建立了高温裂解酶的高效表达和快速纯化方法,结合此裂解酶较广泛的细菌裂解谱、较高的裂解酶活性以及热稳定性,使其具有较好的生产应用前景,其对多重耐药菌良好的杀灭效果,有助于其作为新型的酶抗生素应用于医药研发。
论文目录
摘要Abstract第一章 前言 1.1 研究背景 1.1.1 栖热噬菌体 1.1.2 噬菌体裂解酶 1.1.3 M23 家族蛋白酶 1.1.4 裂解酶TSPpgh 1.1.5 耐药性细菌 1.1.5.1 广泛耐药伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi） 1.1.5.2 耐药性金黄色葡萄球菌（Multi-drug resistant Staphylococcusaureus） 1.1.5.3 广泛耐药肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae） 1.1.6 细菌肽聚糖 1.1.6.1 革兰氏阴性菌的肽聚糖 1.1.6.2 革兰氏阳性菌的肽聚糖 1.1.7 裂解酶对肽聚糖的降解机制 1.2 研究内容第二章 TSPpgh的快速纯化、肽聚糖的吸附与降解、活性位点验证以及酶学性质探索 2.1 TSPpgh的快速纯化 2.1.1 菌株和质粒 2.1.2 利用热裂解快速纯化重组裂解酶TSPpgh 2.1.2.1 优化热裂解温度以及热裂解与超声破碎对TSPpgh释放的影响 2.1.2.2 利用热裂解快速纯化重组裂解酶TSPpgh的放大实验 2.1.3 快速纯化的TSPpgh酶活验证 2.1.3.1 快速纯化的TSPpgh对细菌细胞的破坏作用 2.1.3.2 快速纯化的TSPpgh对细菌裂解效果的AFM观察 2.1.4 TSPpgh酶制剂的制备与保质期跟踪 2.2 TSPpgh对肽聚糖的吸附与降解 2.2.1 肽聚糖的制备 2.2.2 TSPpgh对不同浓度肽聚糖吸附作用的检测 2.2.3 不同反应时间对吸附作用的影响 2.2.4 不同肽聚糖底物吸附效率的检测 2.3 TSPpgh的活性位点验证 2.3.1 序列比对 2.3.2 TSPpgh突变方案设计 2.3.2.1 突变试剂盒 2.3.2.2 突变引物设计 2.3.2.3 突变反应 2.3.2.4 Dpn I消化 2.3.2.5 突变质粒化学转化至E.coli DH5α感受态细胞 2.3.2.6 菌落PCR鉴定阳性克隆 2.3.2.7 突变质粒转化至E.coli BL21 2.3.2.8 突变体重组蛋白的表达与纯化 2.3.2.9 突变体的酶活验证 2.4 TSPpgh的酶学性质探索 2.4.1 裂解酶TSPpgh的最适作用温度 2.4.2 裂解酶TSPpgh的最适pH 2.4.3 不同金属离子对TSPpgh的影响 2.4.4 糖苷键水解活性 2.5 结果 2.5.1 2.5.1.1 优化热裂解温度 2.5.1.2 热裂解与超声破碎对大肠杆菌细胞分裂及TSPpgh释放的影响分析 2.5.1.3 利用热裂解快速纯化重组裂解酶TSPpgh的放大实验 2.5.1.4 快速纯化的TSPpgh对细菌细胞的破坏作用及AFM观察 2.5.1.5 TSPpgh酶制剂的制备与保质期跟踪结果 2.5.2 2.5.2.1 TSPpgh对不同浓度肽聚糖吸附作用的检测 2.5.2.2 不同反应时间对肽聚糖吸附作用的影响 2.5.2.3 不同肽聚糖底物吸附效率的检测 2.5.3 2.5.3.1 突变体的转化、挑克隆鉴定 2.5.3.2 突变体TSP-1-11 与突变体TSP-2 重组蛋白的表达 2.5.3.3 突变体TSP-1-11 与突变体TSP-24 重组蛋白的纯化 2.5.3.4 突变体TSP-1-11 与突变TSP-24 酶活验证 2.5.4 2.5.4.1 裂解酶TSPpgh的最适作用温度 2.5.4.2 裂解酶TSPpgh的最适pH 2.5.4.3 不同金属离子的裂解酶TSPpgh的影响 2.5.4.4 糖苷键水解活性第三章 TSPpgh抑菌活性测定 3.1 TSPpgh对典型革兰氏阳性、阴性菌株的致死活性分析 3.1.1 菌株 3.1.2 菌株的培养 3.1.3 反应时间对TSPpgh抑菌效率的影响 3.1.4 反应浓度对TSPpgh抑菌效率的影响 3.1.5 TSPpgh与卡那霉素抑菌效率比较 3.1.6 TSPpgh抑菌效果的SEM观察 3.1.7 TSPpgh最小抑菌浓度（MIC）的测定 3.2 TSPpgh对肺炎克雷伯菌的致死活性分析 3.2.1 菌株及培养 3.2.2 TSPpgh对肺炎克雷伯菌的抑菌效率验证 3.2.3 反应时间和浓度对TSPpgh作用肺炎克雷伯菌效率的影响 3.2.3.1 反应时间对TSPpgh作用肺炎克雷伯菌效率的影响 3.2.3.2 反应浓度对TSPpgh作用肺炎克雷伯菌效率的影响 3.3 TSPpgh治疗小鼠伤口感染实验验证 3.4 结果和讨论 3.4.1 3.4.1.1 反应时间对TSPpgh抑菌效率的影响 3.4.1.2 反应浓度对TSPpgh抑菌效率的影响 3.4.1.3 TSPpgh与卡那霉素抑菌效率比较 3.4.1.4 TSPpgh抑菌效果SEM观察结果 3.4.1.5 TSPpgh最小抑菌浓度（MIC）的测定 3.4.2 3.4.2.1 TSPpgh对肺炎克雷伯菌的抑菌效率验证 3.4.2.2 反应时间和浓度对TSPpgh作用肺炎克雷伯菌效率的影响 3.4.2.2.1 反应时间对TSPpgh作用肺炎克雷伯菌效率的影响 3.4.2.2.2 反应浓度对TSPpgh作用肺炎克雷伯菌效率的影响 3.4.3 TSPpgh治疗小鼠伤口实验结果第四章 总结与展望 4.1 总结 4.1.1 裂解酶的应用 4.1.2 与常温裂解酶相比,裂解酶TSPpgh拥有的优势 4.2 展望致谢参考文献附录 A攻读学位其间发表论文目录附录 B培养基及药品配制附录 C微生物菌株编号
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 嵇歆彧
导师: 林连兵
关键词: 噬菌体,裂解酶,多重耐药性细菌,杀菌活性,肽聚糖降解
来源: 昆明理工大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 昆明理工大学
基金: 国家自然科学基金项目:“高温噬菌体M23家族蛋白酶对肽聚糖降解的机制研究”(31760042)
分类号: Q55
DOI: 10.27200/d.cnki.gkmlu.2019.001193
总页数: 88
文件大小: 4548K
下载量: 55
相关论文文献
标签：噬菌体论文; 裂解酶论文; 多重耐药性细菌论文; 杀菌活性论文; 肽聚糖降解论文;
