李丹[1]2004年在《脾阴虚大鼠模型MAPK信号转导与调控的研究》文中研究说明脾阴虚证是脾的阴液亏虚，运化失常，精微无源，散精不足的病理变化，表现为饥不欲食，口唇干燥，大便秘结，形体消瘦，舌红少苔等。目前对脾的研究已深入到分子水平，现发现脾虚证与信号转导的关系十分密切。在多条信号通路中，MAPK信号转导通路是多种信号转导途径的共同作用部位。 有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK)是一组分布于胞浆中、具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶，是丝／苏氨酸激酶。迄今已证明真核细胞中MAPK家族有四个成员。MAPK广泛分布于胞浆，也分布在核区。在细胞受有丝分裂原激活后，胞质内合成的MAPK可转到核区，通过磷酸化多种底物来调节细胞生理过程。凡是兴奋G蛋白耦联受体的物质(如血管紧张素、加压素、儿茶酚胺和内皮素等)和激活酪氨酸激酶的物质(如生长因子和其它细胞因子等)刺激细胞分裂时，都要通过MAPK激活。MAPK信号转导通路采用高度保守的叁级激酶级联反应传递信号。MAPK被激活后可以移至细胞核内，通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和其它酶类等多种蛋白底物而参与细胞生长发育、增殖、分裂、凋亡及应激反应等多种细胞功能的调控。 目的：本项研究旨在通过观察脾阴虚证大鼠模型MAPK活性变化，探讨在脾阴虚状态下大鼠脑、肝、心组织MAPK活性变化规律及其调控机制，进一步揭示脾阴虚证的病理实质和滋脾阴法的作用，从而为脾实质的研究提供客观依据。 方法：根据中医学的病因发病学理论，本项研究采用饮食不节、疲劳过度和药物损伤等综合因素，成功建立脾阴虚证大鼠模型，在此基础上对治疗组应用滋脾阴方药进行治疗，与脾阴虚证模型组、正常对照组对比。实验第90天，对所有大鼠禁食24小时后，施行20％乌拉坦腹腔注射麻醉，断头取脑、心、肝，置于-70℃低温冰箱中保存备检。 MAPK活性测定：免疫沉淀法。 结果： 1．脾阴虚证大鼠肝脏、心脏、脑组织的MAPK活性变化的比较 脾阴虚证大鼠心脏组织的细胞浆MAPK活性有明显升高：肝脏组织、脑组织的细胞浆MAPK活性虽有变化趋势，但无统计学意义。 2．滋脾阴法对脾阴虚证大鼠肝脏、心脏、脑组织的MAPK活性变化的影响 滋脾阴方药能明显升高脾阴虚证治疗组大鼠心脏组织的细胞浆MAPK活性，并使其显着高于正常水平。滋脾阴方药对脾阴虚证治疗组大鼠肝脏、脑组织的细胞浆MAPK活性虽有影响，但无统计学意义。 结论：脾阴虚证大鼠心脏、肝脏、脑组织的MAPK活性发生变化，滋脾阴方药能影响MAPK信号转导通路。
李丹, 李德新, 崔家鹏, 刘进, 朱爱松[2]2007年在《脾阴虚证大鼠模型心脏组织MAPK信号转导与调控的研究》文中研究表明目的:通过观察脾阴虚证大鼠模型MAPK活性变化,探讨在脾阴虚状态下大鼠心脏组织MAPK活性变化规律及其调控机制,进一步揭示脾阴虚证的病理实质和滋脾阴法的作用,从而为脾实质的研究提供客观依据。方法:采用饮食不节、疲劳过度和药物损伤复合造模法塑造脾阴虚证动物模型。采用免疫沉淀法检测心脏组织中MAPK活性。结果:脾阴虚证模型组与正常对照组相比,心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P<0.05),脾阴虚证治疗组与正常对照组相比,心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P<0.01),与脾阴虚证模型组相比,心脏组织的细胞浆MAPK活性升高(P<0.01)。结论:脾阴虚证状态下,大鼠心脏组织MAPK参与的细胞信号转导发生改变。滋脾阴方药能有效调控脾阴虚证大鼠心脏组织MAPK活性变化,可能为滋脾阴方药作用机制之一。
崔家鹏[3]2003年在《脾虚证大鼠心、肺、空肠组织PKC和心、肝、脑组织MAPK活性变化及补益脾胃方药作用机制的实验研究》文中认为随着时代的前进，中医现代化已经成为中医药学发展的主要方向，而证的实质的研究是中医迈向现代化的起点。现代科学认为，细胞是生物体的结构和功能的基本单位，生物细胞具有极其复杂的生命活动，这些生命活动都与生物信号分子所携带的信息在细胞内的传递有关。因此从中医证的细胞信号转导系统的变化规律入手来探讨中医证的实质，具有重要的意义。 脾在五行中属土，在五脏阴阳中属阴中之至阴。脾主运化，统血，升清，输布水谷精微，为气血生化之源、后天之本。脾虚证主要指脾气、脾阳或脾阴不足所呈现之各种证候，分为脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证。中国历代医家对脾的位置、形态、重量和生理功能进行了描述，并且对脾虚证的病因和病机进行了探讨。对脾虚证信号转导系统方面的研究已为学术界所关注。虽然近几年有一些脾虚证信号转导系统方面的研究报道，但是大多集中在信号转导的某一个孤立的环节上，并且其中以信号转导通路作为目的的研究非常少。 本项研究在已往研究的基础上，通过对脾虚动物心、肝、脾、肺、肾等主要脏器组织及空肠、脑组织蛋白激酶C(PKC)及分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)活性变化的研究，探讨脾虚状态下细胞信号转导的规律，进一步揭示脾虚的病理实质和健脾方药的作用机制，从而为脾实质的研究提供客观依据。 主要的研究内容包括： 1．观察了脾虚证大鼠心脏、肺脏及空肠组织的PKC活性及其部分亚型表达的变化。 采用底物磷酸化法和免疫印迹法，检测了脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证大鼠心脏、肺脏及空肠组织的细胞浆PKC、细胞膜PKC、细胞总PKC活性及细胞膜PKC／细胞总PKC的比值，同时观察了脾阳虚证大鼠上述叁种组织PKCα、PKCβ-Ⅰ和PKCε三种亚型的表达。经统计学处理，比较脾虚证不同证候不同组织PKC活性。通过摘要观察探讨脾阳虚证不同组织PKC。、PKCp一I和PKC。叁种亚型的表达的变化趋势。 2.观察了补益脾胃方药对脾虚证大鼠心脏、肺脏及空肠组织的PKC活性及其部分亚型表达的影响 应用导师李德新教授拟定的补脾气、温脾阳和滋脾阴方药分别对脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证大鼠进行治疗，并观察其对心脏、肺脏和空肠组织PKC活性和亚型表达的影响。 3.观察了脾虚证大鼠心脏、肝脏及脑组织的MAPK活性及MAP刀ERKI，2亚型表达的变化。 采用免疫沉淀法和免疫印迹法，检测了脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证大鼠心脏、肝脏及脑组织的MAPK活性及脾阳虚证、脾阴虚证大鼠ERKI和ERKZ两种亚型的表达，同时观察了叁种证候大鼠心脏及脑组织中此两种亚型的表达。经统计学处理，比较脾虚证叁种证候不同组织MAPK活性。通过观察探讨亚型表达的变化趋势。 4.观察了补益脾胃方药对脾虚证大鼠心脏、肝脏及脑组织的MAPK‘活性及MAPK了ERK 1，2亚型表达的影响 5.观察了脾虚证大鼠心脏组织的PKC活性与MAPK活性变化的相互关系。 6.观察了补益脾胃方药对脾虚证大鼠心脏组织的PKC活性与MAPK活性变化相互关系的影响。 研究结果表明:脾虚证大鼠各组织PKC和MAPK活性发生一系列改变，补脾方药对其的影响亦很显着。具体如下: 1.各模型组不同组织PKC活性存在不同变化: (1)叁种脾虚证模型中心脏组织的细胞浆PKC活性均明显升高，升高程度依次为:脾阳虚证模型组>脾阴虚证模型组>脾气虚证模型组，其升高程度无显着性差异。脾气虚证模型组和脾阴虚证模型组大鼠心脏组织的细胞膜PKC活性均显着升高，其中脾阴虚证模型组升高程度有大于脾气虚证模型组的趋势。各模型组心脏组织的细胞总PKC活性均明显升高，升高程度依次为:脾阴虚证模型组>脾气虚证模型组>脾阳虚证模型组，升高程度无显着性差异。正常对照组细胞浆明显高于细胞膜，叁种脾虚证模型组细胞膜PKC活性与细胞浆PKC活性之间均无显着性差异。脾气虚证组和脾阴虚证模型组PKCm用Kq的比值均显着升高。脾阴虚证模型组增高程度有大于脾气虚证模型组的趋势。脾阳虚证模型组无明显变化。 (2)脾阳虚证模型组和脾阴虚证模型组肺脏组织的细胞浆PKC活性均显着降低。脾阳虚证模型组降低程度有大于脾阴虚证模型组的趋势。脾阳虚证模型组和脾阴虚证模型组细胞膜PKC活性均显着性升高，脾阳虚证模型组升高程度有大于脾阴虚证模型组的趋势。脾气虚证模型组有升高趋势。叁种脾虚模型组肺组织细胞总PKC活性均有降低趋势。正常对照组细胞膜PKC活性显着低于细胞浆。脾阳虚证和脾阴虚证大鼠细胞膜PKc活性均显着高于细胞浆。脾阳虚证和脾阴虚证PKcm/P Kct比值均显一7一摘要着升高，脾阳虚证模型组升高程度有大于脾阴虚证模型组的趋势。 ③叁种脾虚模型组空肠组织的细胞浆PKC活性均无改变。叁种脾虚模型组细胞膜PKC活性均显着升高。其中脾气虚证模型组升高程度有大于脾阴虚证模型组的趋势，脾阴虚证模型组升高程度有大于脾阳虚证模型组的趋势，而脾气虚证模型组升高程度显着大于脾阳虚证模型组。叁种脾虚模型组空肠组织的细胞总PKC活性均明显升高。其中脾气虚证模型组升高程度有大
马慧利[4]2007年在《MAPK、NF-κB、AP-1的表达水平和恶性肿瘤阴虚证关系的研究》文中研究指明根据现代医学理论，阴虚证是机体在致病因素的作用下体内发生的一种基本病理过程和综合征，在它的发生和发展过程中体内必然存在和发生着一系列的级联病理生理反应。也就是说，阴虚证时体内发生的病理变化是广泛而全面的，机体的每个系统、器官、组织和细胞的结构和／或功能都发生了程度不同的改变(原发性改变和／或继发性改变)。申维玺等运用现代医学理论和方法进行研究，在国内外首先提出了：阴虚证的本质是细胞因子，其基本发病学机理是由于机体在各种致病因素的损害作用下，导致细胞因子基因表达调控失调，白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等炎性细胞因子的基因表达增强、生物学活性相对升高，引起细胞因子网络紊乱的结果。目前的理论研究得出的“阴虚证的本质是细胞因子”只是一个理论模型和理论框架，要研究清楚阴虚证时细胞因子网络变化的具体内容、信号转导及核转录因子对阴虚证炎性细胞因子的调控等问题，只能是依靠实验研究才能解决。由于阴虚证发生的复杂性，以往对其发病机制的研究尚无定论，加之国内外对阴虚证时信号传导、核转录因子对阴虚证炎性细胞因子的调控研究甚少，因此我们在应用传统实验方法的基础上，需要结合新的技术手段来阐述。基因芯片技术(genechip technology)，又称cDNA微阵列(cDNA microarray)，是分析瞬间基因表达全貌的很有价值的工具，它可以剖析基因间相互作用的复杂网络体系。目前有关基因芯片技术研究阴虚证发病学机理的报道较少，故应用该技术寻找阴虚证候差异表达的基因，将有助于阐述阴虚证信号转导机制及核转录因子对阴虚证炎性细胞因子的调控机制，探讨阴虚证的发病学机理，并为诊断和治疗阴虚证候提供新的策略。为此，对丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号传导通路、核因子(nuclear factor，NF)-κB、激活蛋白(activatorprotein,AP-1)和恶性肿瘤阴虚证炎性细胞因子的表达调控的关系方面进行了以下实验研究。实验研究方法和结果一、应用免疫组化方法检测肺癌阴虚证患者肺组织非瘤细胞MAPK、NF-κB、AP-1蛋白的表达水平方法：选取20例肺癌阴虚证患者和20例肺癌无阴虚患者，其中肺癌阴虚证患者男性9例，女性11例，年龄41-70岁；肺癌无阴虚证患者男性10例，女性10例，年龄37-70岁，分为两组：肺癌阴虚证组和肺癌无阴虚组。以两组患者手术后大体肺石蜡包埋组织为材料，应用免疫组织化学方法对两组患者肺组织非瘤细胞内MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达情况进行检测分析，采用X~2检验对数据进行统计学处理。结果：免疫组化结果显示肺癌阴虚证患者非瘤细胞内MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达水平较肺癌无阴虚证患者明显升高。非瘤细胞内MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达差异在两组之间有统计学意义(P＜0.05)。二、应用基因表达谱芯片检测恶性肿瘤阴虚证患者MAPK、NF-κB、AP-1基因的表达水平方法：选取3例阴虚证患者和3例无阴虚证患者。其中肺癌2例，均为女性，肺癌阴虚证患者64岁，肺癌无阴虚证患者60岁；结肠癌2例，均为男性，结肠癌阴虚证患者58岁，结肠癌无阴虚证患者55岁；胃癌患者2例，均为女性，阴虚证患者61岁，无阴虚证患者58岁。将上述病人总RNA提取后，分别逆转录成cDNA。再进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果再杂交表达谱芯片，芯片采用高分辨率扫描仪(Gene Tech公司)进行扫描，将扫描图像信号转化为数字信号，得到他们之间基因表达的差异信息。结果：基因表达谱芯片结果显示阴虚证患者MAPK、NF-κB、AP-1基因表达信号值明显高于无阴虚证组，两组间基因表达差异有统计学意义。结论综合分析阴虚证本质理论研究结果和MAPK、NF-κB、AP-1信号传导通路对炎性细胞因子的调控机制，结合本实验的研究结果，得出以下初步结论：1．肺癌阴虚证患者肺组织非瘤细胞MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达较无阴虚组升高，MAPK、NF-κB、AP-1和肺癌阴虚证相关。2．恶性肿瘤阴虚证患者和无阴虚证患者相比MAPK、NF-κB、AP-1基因表达发生变化。3．MAPK、NF-κB、AP-1参与阴虚状态下的细胞信号传导，可能是阴虚证发生发展的分子机理。
王洪海[5]2007年在《四君子汤 柴疏四君汤 柴胡疏肝散作用于脾虚证大鼠模型的生物效应比较》文中研究表明“方证相关”是中医辨证论治和方剂学中的重要逻辑命题。方剂的功用不仅与方药配伍有关,还与其所作用的证之间具有一定的适配性,即方剂效用大小在相当程度上取决于所作用对象的病机与其方药配伍关系之间的针对性,方与证之间存在有关联程度大小的问题。但到目前为止,还没有人能从实证意义上为“方证相关”提供系统的科学证据。基于上述背景,本文以在内涵上具有一定关联的方剂和证候为切入点,运用关联排他和异方同证的研究方法较为系统地探查了中医“方证相关”命题的客观真实性。本研究首先依据中医关于脾虚证的病因病机学说、临床表现和其涉及到现代相关疾病的病理生理的变化特点,采用复合病因造模法复制脾虚证大鼠模型,通过神经-内分泌-免疫系统中的多指标观察,以获得模型的中医证候及部分生物学特点;在此基础上,比较观察具有健脾、疏肝和疏肝健脾功用的四君子汤、柴胡疏肝散和柴疏四君汤叁方对该模型的作用异同,探讨同一脾虚证条件下叁方效用的差异,以获得叁方与脾虚证之间可能存在的关联性及其关联性现代内涵。之后,观察了四君子汤对脾虚证模型甲状腺轴、血液流变学、能量代谢等其它方面的效应,了解方证相应条件下的四君子汤的作用效应谱其可能涉及到的生物学基础。最后,运用基因芯片技术探查了脾虚证模型及四君子汤对模型作用的全基因表达,进一步分析探讨脾虚模型和四君子汤作用的分子机制。全文分为文献综述和实验研究两大部分。文献综述部分主要对脾虚证动物模型复制研究进展及存在问题、四君子汤的实验研究与临床应用、基因芯片技术在中医药领域中的研究与应用现况等叁个方面进行综述。实验研究部分主要包括脾虚证大鼠模型的复制及评价;四君子汤、柴胡疏肝散及柴疏四君汤对脾虚模型的影响;四君子汤对模型中甲状腺轴、能量代谢、血液流变学的调节作用;脾虚证大鼠模型相关基因表达谱及四君子汤对其影响的初步探查四方面。研究一脾虚证大鼠模型的建立方法:将大鼠随机分为对照组和脾虚模型组,每组40只。模型组大鼠采用过度劳倦加饮食失节的方法。模型大鼠每日下午2:00置于盛有温水的塑料钢化桶中游泳10min;隔日喂食(隔日禁食,隔日足量给食),连续3w。于造模第22d开始,停止上述造模因素,自然饲养条件下观察1w。分别于造模的第1、2、3、4w取材,用间苯叁酚法测尿D-木糖排泄率,用高效液相色谱-电化学法检测单胺神经递质,用试剂盒放免法检测血清GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα;血浆MTL、SS、VIP、NPY、SP、β-EP、ACTH、CORT;下丘脑CRH的含量。结果:1.外观行为学观察:脾虚模型组大鼠造模2w后开始出现毛发不泽、枯乱;少动、拱背、眯眼、扎堆、兴奋性差;嗜睡、倦卧;饮食明显减少;便溏;体重显着降低。造模第3w变化最为明显,停止造模1w后上述变化未见明显改善。2.胃肠功能:脾虚模型大鼠尿D-木糖排泄率于第2w开始明显降低,3w时降低最为明显,第4w虽有恢复,仍显着低于对照组;与对照组相比,脾虚模型大鼠血清GAS水平于第1、2w无明显变化,第3w明显下降,第4w明显升高;血浆MTL水平第1、4w明显升高,第2、3w明显降低;血浆SS水平3w时明显升高,4w时恢复原来水平;血浆VIP水平第2w明显升高,第3w徒然降低,4w时无明显差异;血浆NPY水平于2、3w时明显降低,4w时无明显差异;血浆SP水平3w时显着升高,4w时有降低趋势;血浆β-EP水平前叁周与对照组相比无明显差异,4w时明显降低。3.免疫系统:脾虚模型组大鼠胸腺重量于第1-3w均显着低于对照组,4w时虽有回升,但仍明显降低;脾重量于第1-4w均明显低于对照组;胸腺指数第1-3w均降低,其中第1w显着降低,4w时升至对照组水平;脾指数自造模1w后呈逐渐增加趋势,3、4w时明显高于对照组;与对照组相比,脾虚模型组大鼠血清IL-1β水平第1w明显升高,3w、4w时均显着降低;血清IL-2水平3w时明显降低,第4w明显升高;血清IL-6水平3w时明显升高,第4w明显降低;血清TNFα水平3w时明显升高,第4w明显降低。4.神经递质:与对照组相比,脾虚模型组大鼠海马5-HT水平3w时明显降低,自然恢复期显着升高;海马DA水平第1、2、3、4w均明显升高;海马NE3w时明显降低,余未见明显差异;海马HIAA3w时明显降低;海马HVA2w时明显降低;海马DOPAC从第1-4w逐渐下降,3w时明显降低。5.HPA轴:脾虚模型组大鼠肾上腺重量第1、2w与对照组接近,3、4w时显着低于对照组;肾上腺指数第1-3w上升,4w时降低至原水平,其中3w时明显升高;与对照组相比,脾虚模型组大鼠下丘脑CRH3w时明显降低,第4w显着升高;血浆ACTH第1-3w逐渐降低,3w时明显降低,4w时有所回升;血浆CORT第1-3w持续降低,4w时迅速回升,1w、3w、4w时均明显降低。结论:该模型大鼠表现出部分类似脾虚证的症状,存在小肠吸收功能障碍、胃肠功能、免疫系统、神经递质、HPA轴功能的紊乱。结果提示本模型符合中医脾虚证的表现,且存在胃肠功能紊乱和神经-内分泌-免疫网络中多环节的调节障碍。研究二四君子汤、柴疏四君汤和柴胡疏肝散对脾虚证大鼠模型的作用方法:将大鼠随机分为2组:对照组(20只),模型组(50只),模型组大鼠按上述制模方法处理3w,于造模第3w末分别从对照组和模型组随机各取大鼠10只取材。第22d停止造模,模型组大鼠随机分成脾虚模型(model)、柴胡疏肝散(CHSGS),四君子汤(SJZT)、柴疏四君汤(CSSJT)四组,每组10只。中药叁组分别按1mL/100g体重给予柴胡疏肝散、四君子汤、柴疏四君汤灌胃,连续7d,每日1次。模型组和对照组分别给予等量蒸馏水。4w末剖杀取材,用上述方法测定相关指标,并用MTT法测定脾T淋巴细胞增殖转化功能。结果:1.胃肠功能:与对照组相比,造模3w时模型组大鼠尿D-木糖排泄率显着降低,第4w时脾虚模型组大鼠尿D-木糖排泄率仍显着降低。与脾虚模型组相比,四君子汤组和柴疏四君汤组大鼠尿D-木糖排泄率显着升高,且四君子汤组显着高于柴疏四君汤组,柴胡疏肝散组无明显变化。与对照组相比,造模3w时模型组大鼠血清GAS、血浆MTL、VIP水平明显降低,血浆SS水平显着升高;第4w时脾虚模型组大鼠血清GAS、血浆MTL水平明显升高,血浆SS、VIP水平明显降低。与脾虚模型组相比,四君子汤组、柴疏四君汤组血清GAS水平显着升高,两方无明显差异,柴胡疏肝散组无明显变化。四君子汤组血浆MTL水平明显降低,柴胡疏肝散组、柴疏四君汤组无明显变化;四君子汤组、柴疏四君汤组血浆SS水平明显升高,柴胡疏肝散组无明显作用;四君子汤组血浆VIP明显升高,柴疏四君汤组无明显变化,柴胡疏肝散组明显降低;与柴胡疏肝散组比较,四君子汤组大鼠血浆VIP显着升高。2.免疫系统:与对照组相比,造模3w时模型组大鼠血清IL-1β、IL-2水平明显降低,而血清IL-6、TNFα水平明显升高。第4w时脾虚模型组大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα均明显降低。与脾虚模型组相比,四君子汤组、柴疏四君汤组血清IL-1β均明显升高,两方之间无明显差异,柴胡疏肝散组无明显变化;柴胡疏肝散组血清IL-2明显降低,而四君子汤组明显升高,柴疏四君汤组未见明显变化;四君子汤组血清IL-6明显升高,柴胡疏肝散组、柴疏四君汤组有升高趋势;四君子汤组血清TNFα明显升高,柴胡疏肝散组和柴疏四君汤组均无明显变化。脾虚模型大鼠脾T淋巴细胞增殖转化功能显着低于对照组;与脾虚模型组相比,柴胡疏肝散组和柴疏四君汤组大鼠脾T淋巴细胞增殖转化功能均显着降低,四君子汤组显着升高,并显着高于柴胡疏肝散组和柴疏四君汤组。3.神经递质:与对照组比较,造模3w时模型组大鼠海马5-HT、NE含量明显降低,而海马DA含量显着升高。第4w时脾虚模型组大鼠海马5-HT、NE含量明显降低,而海马DA含量明显升高。与脾虚模型组相比,四君子汤组大鼠海马5-HT的含量明显升高,柴胡疏肝散组、柴疏四君汤组有升高的趋势,但作用不及四君子汤组明显;叁组大鼠海马DA的含量明显降低,以四君子汤组降低的值接近对照组DA水平,以柴疏四君汤组的降幅最明显;叁组大鼠海马NE水平均明显升高,叁组之间无明显差异。4.HPA轴:与对照组相比,造模3w时模型组大鼠垂体ACTH、血浆ACTH、CORT水平明显降低。第4w时脾虚模型组大鼠垂体ACTH水平有降低趋势,血浆ACTH、CORT明显降低。与脾虚模型组相比,叁组垂体ACTH水平无明显变化,四君子汤组、柴疏四君汤组血浆ACTH明显升高,以柴疏四君汤组作用最明显,但四君子汤组升高值接近对照组水平,柴胡疏肝散组无明显变化;叁组血浆CORT水平明显升高,以柴疏四君汤组作用明显。结论:脾虚模型大鼠表现有胃肠功能、免疫系统、神经递质、HPA轴等方面的异常变化;被观察的叁方均具有不同程度的调节作用,其中四君子汤能明显降低模型大鼠血浆MTL、海马DA;升高模型大鼠血清GAS、IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα、海马5-HT、NE、血浆SS、VIP、ACTH、CORT及脾T淋巴细胞增殖转化功能。柴胡疏肝散能明显降低模型大鼠血浆VIP、血清IL-2、海马DA及脾T淋巴细胞增殖转化功能;能明显升高模型大鼠海马NE、血浆CORT。柴疏四君汤能明显升高模型大鼠血清GAS、IL-1β、血浆SS、ACTH、CORT、海马NE;能明显降低模型大鼠海马DA及脾T淋巴细胞增殖转化功能。结果提示,四君子汤在调节脾虚模型胃肠功能、神经-内分泌-免疫网络异常改变方面优于柴胡疏肝散、柴疏四君汤;较之于柴胡疏肝散和柴疏四君汤二方,四君子汤与中医脾虚证之间具有更大的关联性。研究叁四君子汤对脾虚证大鼠模型的其他作用方法:将大鼠随机分为对照组(20只)和模型组(30只)。模型组按上述方法制模,于造模第3w末分别从对照组和模型组随机各取大鼠10只取材,第4w停止造模,模型组大鼠随机分成脾虚模型组(model)、四君子汤(SJZT)两组,每组各10只。四君子汤组按1mL/100g体重给予灌胃,连续7d,每日1次。脾虚模型组和对照组分别给予等量蒸馏水。于4w末剖杀取材,放免法检测血清TSH、T3、T4和血浆TXB2、6-keto-PGF1a;高效液相法检测肝组织能荷;全自动生化分析仪检测血清LDL、CK、P-AMY;比色法检测肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase;血液粘度测试仪测定血流变。结果:1.甲状腺轴:与对照组相比,造模3w时模型组大鼠血清TSH、T3、T4均明显降低。4w时脾虚模型组大鼠血清TSH、T3、T4仍均明显降低;与脾虚模型组相比,四君子汤组大鼠血清TSH、T3、T4均明显升高。2.肝组织能荷:与对照组相比,模型组大鼠3w时肝组织ATP、ADP、EC显着升高,AMP显着降低;4w时脾虚模型组肝组织ATP、ADP、EC和AMP值仍明显升高或降低。与脾虚模型组相比,四君子汤组大鼠肝组织EC明显升高,AMP明显降低。3.血清及肝组织酶:与对照组比较,3w时模型组大鼠血清LDH、CK显着降低,P-AMY显着升高,肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活力均显着降低;4w时脾虚模型组血清LDH明显降低,P-AMY仍明显升高,CK有回升趋势,肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活力仍明显降低。与脾虚模型组相比,四君子汤组大鼠血清LDH明显升高,P-AMY明显降低,CK无明显变化,肝组织Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活力均显着升高,Na+-K+-ATPase活力无明显变化。4.血液流变学及TXB2、6-keto-PGF1a:与对照组相比,模型组大鼠3w时150/s、38/s、10/s、5/s切变率下的全血粘度和还原粘度均呈不同程度显着升高,红细胞压积显着升高,聚集指数显着降低,血浆TXB2、6-keto-PGF1a及其比值均明显升高;4w时各切变率下的全血粘度和还原粘度仍显着升高,聚集指数显着降低,红细胞压积和变形指数均无明显差异,血浆TXB2、6-keto-PGF1a均较3w时升高,其中6-keto-PGF1a明显升高,其比值明显降低。与脾虚模型组相比,四君子汤组大鼠150/s、10/s、5/s切变率下的全血粘度明显降低,150/s切变率下的还原粘度明显降低;红细胞压积、聚集指数、变形指数均无明显差异;血浆TXB2明显降低,6-keto-PGF1a显着降低,TXB2/6-keto-PGF1a明显升高。结论:脾虚证模型存在甲状腺功能、能量代谢、血液流变学及TXB2/6-Keto-PGF1a的异常改变;四君子汤可明显升高脾虚模型组大鼠血清TSH、T3、T4、LDH、肝组织EC、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活力及TXB2/6-keto-PGF1a,明显降低模型大鼠血清P-AMY、肝组织AMP、全血粘度、还原粘度、血浆TXB2、6-keto-PGF1a。结果表明,四君子对脾虚模型大鼠出现的甲状腺功能、酶学、血液流变学异常具有一定的调节作用。研究四脾虚证大鼠模型相关基因表达及四君子汤对其的影响方法:将大鼠随机分为对照组(20只)和模型组(30只)。模型组按上述方法制模,于造模第3w末分别从对照组和模型组随机各取大鼠10只在无菌条件下取脾脏。第4w停止造模,造模组动物随机分成脾虚模型(model)、四君子汤(SJZT)两组,每组各10只。四君子汤组按1mL/100g体重给予四君子汤灌胃,连续7d,每日1次。模型组和对照组分别给予等量蒸馏水。同前法于第4w末在无菌条件下剖取脾脏,进行脾脏RNA的提取、样品RNA荧光标记、杂交与清洗、芯片扫描、图像采集与数据分析;主要利用http://www.biorag.org/中的功能基因库对获得的差异基因进行功能查询。结果:与对照组相比,造模3w时脾虚模型组大鼠差异表达基因有70条,其中上调基因有6条,下调基因有64条;其中涉及到已知功能基因有RSK、Mpo、Epx_predicted、Ear11、Rn30000067、Rn30023859、Rn30000254、Hsd17b2、Serpinb10、Serpinb2、Rn30014199、Ppbp、Rn30003138、Rhag、Rn30014371、Ngp_predicted、Arl4、Gnaz、Depdc1_predicted、Gp5、Neu2、Rn30016562。与脾虚模型组比较,四君子汤组差异表达基因有446条,其中上调基因有201条,下调基因有245条;其中涉及到已知功能基因主要有Map3k1、Pla2g1b、Gprk2l、IL9、Akt2、Pik3r1、Nfkbia、Abcb9、Abcb3、Pnlip、Pnliprp1、Pnliprp2、Gp2、RGD1310132、RGD1565722、Iiig9。结论:脾虚证模型存在部分基因的异常表达,涉及细胞因子调节、细胞内信号转导、酶催化活性、能量代谢、蛋白质合成等多个方面;四君子汤对脾虚的基因表达具有广泛作用,其中涉及到对MAPK信号通路、甘油磷脂代谢、G蛋白偶联受体信号系统、JAK-STAT信号通路等多个方面。结果提示,多个基因的异常表达可能是中医脾虚证的分子基础,而脾虚证治方则对包括与脾虚证相关的基因在内的多个基因发挥复杂的调节作用。综上,采用游泳劳倦和饮食失节复合法复制出的脾虚证模型,表现出少动、乏力、食欲减退、消瘦、大便稀溏等脾虚证的类似症状,伴有胃肠功能、神经-内分泌-免疫、血液流变学、能量代谢等多系统的功能紊乱,并存在部分基因的异常表达。结果提示,中医脾虚证可能是一个以多组基因表达异常为基础、涉及神经-内分泌-免疫网络中多环节调节障碍的综合征。四君子汤、柴胡疏肝散和柴疏四君汤叁方对脾虚证模型的神经-内分泌-免疫方面有一定的调节作用,其中四君子汤对脾虚模型胃肠激素、免疫因子、神经递质方面均有很好的调节作用;柴胡疏肝散对神经递质有调节作用,能使降低的VIP、IL-2、脾T淋巴细胞增殖转化功能再度降低;柴疏四君汤主要对神经递质、HPA轴有调节作用。四君子汤在调节脾虚模型神经-内分泌-免疫、胃肠功能方面明显优于柴胡疏肝散和柴疏四君汤。对叁方治疗效应谱和作用强度的综合评价表明,四君子汤对脾虚模型的疗效最好,柴疏四君汤次之,柴胡疏肝散较差,四君子汤与脾虚证的关联性最大。四君子汤还对模型中存在的甲状腺功能、血液流变学、能量代谢等方面的异常有一定的改善作用,对模型的多个基因的表达具有广泛影响。结果提示,四君子汤可能在多系统不同功能纬度和整体-组织-细胞-基因不同结构层次上对脾虚证发挥调节作用而呈现出中医的整体综合功效。本课题从同证异方的角度对中医脾虚证及相关方剂作用的生物学基础进行了较为全面的探查,不仅为揭示中医“方证相关”这一逻辑命题进行了有益的方法学探索,而且为认识“方证相关”及其科学内涵提供了一定的客观实证。
梁丽娜[6]2012年在《脾阴虚糖尿病认知功能障碍的发病机制及滋补脾阴方药的调控作用研究》文中研究表明目前，糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）和阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的发病率正以惊人的速度增加，已成为许多国家重大的公共健康问题。据报道2010年全球糖尿病患者高达2.85亿，2030年将增加到4.39亿，其中95%为T2DM。我国糖尿病的发病率更是增长迅速，据统计中国的成人糖尿病患者已达9200万，糖尿病前期患者人数高达1.48亿，位居世界第二。随着对糖尿病研究的逐步深入，人们逐渐认识到糖尿病患者可出现认知功能障碍，甚至发生AD。流行病学研究也表明糖尿病患者罹患AD的风险更高。调查发现受试者人群中糖尿病患者形成痴呆的比例是普通人群的两倍，糖尿病患者可提前3年出现痴呆。对此，科学界提出了“糖尿病相关认知下降（diabetes-associated cognitive decline，DACD）”这一概念，或称为糖尿病认知功能障碍。DACD的发病机制极其复杂，可能与脑胰岛素抵抗、脑血管及血管内皮功能损伤、氧化应激、非酶性蛋白糖基化、炎性反应以及钙离子稳态失衡等多种因素有关。虽然传统观念认为胰岛素的敏感器官主要是肝脏、脂肪以及骨骼肌等外周组织，但是在海马和皮质这些与学习记忆形成密切相关的部位也发现了胰岛素受体。虽然脑内胰岛素的来源尚不完全清楚，但已经证明来自外周循环的胰岛素可通过血脑屏障进入脑内，脑内也可内源性地产生胰岛素。胰岛素通过与脑内广泛分布的胰岛素受体结合激活PI3K/Akt通路，引导胰岛素信号向下传导。正常情况下，胰岛素与胰岛素受体结合后，引起胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1， IRS-1）的酪氨酸磷酸化增强，继而激活其下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol kinase-3， PI3K），诱导蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/Akt）的磷酸化，这一途径中任一分子发生异常都可能阻碍胰岛素信号向下传导，引起胰岛素信号转导障碍，导致胰岛素效能下降，诱发胰岛素抵抗。引起胰岛素抵抗的原因是多方面的。据报道能量代谢紊乱、氧化应激等因素都可能引起胰岛素信号转导障碍，诱发胰岛素抵抗。此外，内质网应激（endoplasmicreticulum stress，ERS）也可以通过引起JNK的活化抑制胰岛素信号转导。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是位于细胞核附近的胞质区域，是哺乳动物细胞重要的Ca2+贮存器，同时也是蛋白质合成与翻译后修饰，多肽链正确折迭与装配的重要场所。ERS是细胞的一种应激反应过程。糖饥饿、钙平衡紊乱、糖基化抑制、二硫键合成减少时，内质网微环境改变，蛋白质折迭受到影响，导致大量未折迭或错误折迭的蛋白质堆积于内质网内，引起未折迭蛋白反应（unfolded proteinresponse，UPR）。但是，关于ERS在DACD发病机制中的作用尚未见报道。DACD的确切病理变化尚不清楚。但已有研究表明DACD脑中病理变化与AD相似。T2DM患者脑组织存在淀粉样斑块和神经纤维缠结，淀粉样斑块的密度与T2DM病程密切相关。动物实验研究也证实糖尿病鼠不但存在学习、记忆障碍，其脑部神经元也出现了AD的特异性病理学改变： 淀粉样蛋白（β-amyloid peptide,Aβ）沉积及tau的异常磷酸化，及由其导致的神经元细胞退化。在自发性糖尿病大鼠脑组织中发现额皮质APP、β-分泌酶和Aβ蛋白表达增加，并在大鼠神经元胞浆中发现Aβ沉积增加。有研究表明胰岛素信号转导障碍可以影响Aβ的产生和降解。胰岛素信号通路的下游效应器之一雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)作为自噬的抑制剂，在淀粉样蛋白β（Aβ）的代谢中发挥重要作用。胰岛素降解酶（insulindegrading enzyme, IDE）是Aβ的主要降解酶之一，它在降解胰岛素的同时可降解Aβ。课题组前期研究发现，糖尿病大鼠及脾阴虚糖尿病大鼠海马中发生ERS，胰岛素信号通路关键分子IRS-1丝氨酸磷酸化水平增加，说明胰岛素信号转导受阻，糖尿病大鼠及脾阴虚糖尿病大鼠海马中发生了胰岛素抵抗。但是，胰岛素抵抗是否是由ERS诱导的仍需进一步研究。同时，我们发现糖尿病大鼠及脾阴虚糖尿病大鼠海马中总Aβ增加，虽然已有证据表明胰岛素与Aβ代谢之间密切相关，但是在我们的研究中Aβ增加是否与胰岛素信号转导障碍有关仍需进一步证实。因此，本研究在前期工作基础上，通过观察与学习记忆密切相关的皮质、与机体代谢密切相关的下丘脑中ERS及胰岛素信号通路的变化，结合体外实验，进一步深入探讨ERS与胰岛素信号转导障碍之间的关系，以及胰岛素信号转导障碍对Aβ代谢的影响。目的：以脑内质网应激激活JNK诱导脑胰岛素信号转导障碍为切入点，探讨糖尿病认知功能障碍的发病机制；通过观察ZBPYR对内质网应激、胰岛素信号转导通路关键分子及Aβ的影响探讨ZBPYR的作用机制，明确ZBPYR的作用靶点，为从脾论治糖尿病认知功能障碍提供理论依据。通过中医学理论与现代医学的交融，丰富完善脾藏象理论及脾本质研究，为糖尿病认知功能障碍的防治提供新线索和新思路。方法：将健康成年雄性SD大鼠随机分为空白对照组（cont）、糖尿病组（DM）、脾阴虚组（pi）、脾阴虚糖尿病组（piDM）和滋补脾阴方药组（ZBPYR），共5组。1.在成功建立各种模型后，首先通过western blotting方法及RT-PCR方法观察各组大鼠皮质、下丘脑中内质网应激标志分子p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、GRP78蛋白表达变化及GRP78mRNA水平变化，以验证各组大鼠皮质和下丘脑中是否发生内质网应激。2.通过western blotting方法观察各组大鼠皮质、下丘脑中ERS与胰岛素信号通路桥梁分子JNK的变化及胰岛素信号转导通路关键分子p-IRS-1、IRS-1、p-Akt、Akt的变化，以验证各组大鼠皮质和下丘脑中是否发生胰岛素信号转导障碍。3.以SH-SY5Y细胞为研究对象，给予内质网应激诱导剂衣霉素、毒胡萝卜素刺激诱导内质网应激的发生，然后再给予JNK抑制剂SP600125，观察胰岛素信号转导通路关键分子p-IRS-1、IRS-1、p-Akt、Akt的变化，以验证内质网应激是否可通过激活JNK诱导胰岛素信号转导障碍。4.观察各组大鼠海马、皮质Aβ1-42及Aβ1-40的变化，及p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K、自噬标志分子LC3Ⅱ以及IDE的变化寻找Aβ1-42及Aβ1-40的变化的原因。结果：1. DM组、piDM组大鼠皮质、下丘脑p-PERK、p-eIF2α蛋白表达较cont组均增强（P<0.05），ZBPYR组较DM组、piDM组减弱（P<0.05）；DM组、piDM组GRP78蛋白表达及mRNA表达较cont组增加（P<0.05），ZBPYR组较DM组、piDM组减弱（P<0.05），eIF2α蛋白水平各组间差异无统计学意义。2. DM组、piDM组大鼠皮质、下丘脑内质网应激标志分子p-IRE1α、p-JNK1、p-JNK2以及胰岛素信号转导通路关键分子p-IRS-1、p-Akt蛋白表达较cont组均增加（P<0.05），ZBPYR组较DM组、piDM组均减弱（P<0.05），IRS-1、Akt蛋白水平各组间差异无统计学意义。3.体外实验结果显示Tm处理4h、Tg处理12h时p-IRE1α、p-JNK1、p-JNK2表达达到峰值，给予Tm处理4h或Tg处理12h时胰岛素信号转导通路中的p-IRS-1增加、再给予JNK抑制剂SP600125处理后抑制p-IRS-1的表达，p-Akt蛋白表达增加。4. DM组、piDM组大鼠海马、皮质可溶性与不可溶Aβ1-42均高于cont组，ZBPYR降低了DM组和或piDM组海马、皮质可溶性与不可溶Aβ1-42的表达，DM组、pi组、piDM组大鼠皮质不可溶Aβ1-42均高于cont组，ZBPYR降低了DM组和piDM组皮质不可溶Aβ1-42的表达。各组大鼠海马、皮质p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K表达差异无统计学意义，但DM组、piDM组各组大鼠海马、皮质自噬标志分子LC3Ⅱ蛋白表达降低，IDE蛋白表达降低，而ZBPYR则抑制LC3Ⅱ以及IDE的降低。结论：1.内质网应激的发生是糖尿病、脾阴虚、脾阴虚糖尿病大鼠脑组织变化的特征之一，是诱导脑内胰岛素信号转导障碍的始动因素。滋补脾阴方药通过干扰PERK信号途径减轻脑内质网应激。2.内质网应激通过激活JNK诱导胰岛素信号转导障碍促进糖尿病大鼠及脾阴虚糖尿病组大鼠认知功能障碍的发生。滋补脾阴方药通过调节内质网应激抑制JNK活化改善胰岛素信号转导障碍提高学习记忆能力。3.脑组织中Aβ1-42增加可能是糖尿病大鼠、脾阴虚糖尿病大鼠认知功能障碍的主要病理变化，自噬及胰岛素降解酶可能参与调控Aβ1-42的降解。滋补脾阴方药能够减少Aβ1-42，其机制可能与调节自噬及IDE的表达有关。
李琳[7]2017年在《衰老海马Notch、Wnt和MAPK信号通路的关键蛋白表达变化及补肾方作用机理研究》文中进行了进一步梳理目的:观察自然衰老大鼠海马相关信号通路的关键分子蛋白Notch-1、Wnt3a及ERK1/2表达变化及补肾方的作用,探索衰老的机制及补肾方的作用机理。方法:以自然衰老24月龄SD雄性大鼠为模型。雄性Sprauge-Dawley(SD)大鼠30只,随机分为老年组、左归丸组和右归丸组,共叁组,每组10只;另设青年组(5月龄)10只。左归丸、右归丸组大鼠从20月龄开始,按左归丸、右归丸0.675g/100g/d(相当于成人临床用量的15倍)的剂量灌胃,每周连续停药两天,连续4个月。各组大鼠正常饮食、饮水。Western blot法检测大鼠海马组织Notch-1、Wnt3a及ERK1/2的蛋白表达;免疫组化法检测大鼠海马齿状回Notch-1及ERK1/2的蛋白表达。结果:1与青年组相比,老年组大鼠海马组织Notch-1、Wnt3a及ERK1/2蛋白表达下调(P<0.05)。与老年组相比,左归丸组和右归丸组大鼠海马组织Notch-1及Wnt3a蛋白表达有上调的趋势(P>0.05);左归丸组ERK1/2的蛋白表达有上调的趋势;右归丸组ERK1/2的蛋白表达有下调的趋势。2与青年组相比,老年组大鼠海马齿状回Notch-1和ERK1/2蛋白的表达下调(P<0.05);与老年组相比,左归丸、右归丸组大鼠海马齿状回Notch-1和ERK1/2的蛋白表达上调(P<0.05)。结论:1老年大鼠海马组织Notch-1、Wnt3a及ERK1/2蛋白的表达下调,左归丸和右归丸能上调海马组织Notch-1和ERK1/2蛋白的表达;2补肾方左归丸和右归丸延缓衰老的机制可能与调节Notch和MAPK信号通路有关。
胡守玉[8]2009年在《滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病脑病大鼠海马胰岛素抵抗影响的研究》文中认为目的:糖尿病脑病(diabetic encephalopathy,DE)是糖尿病中枢神经系统并发症之一,是一种常见的慢性进展性疾病。临床主要表现为轻、中度认知功能障碍,学习、记忆、解决问题的能力下降。出现糖尿病脑病时,大脑无论是在形态学、神经电生理学还是在分子生物学上都存在着相应的变化。虽然研究者们已从多方面、多角度地去研究糖尿病脑病,但是至今为止,糖尿病脑病的发病机制还不是很清楚。最近的研究发现,胰岛素(insulin)对神经细胞来说是一种神经营养因子,脑内胰岛素生物效能的变化对糖尿病患者中枢神经系统有着重要的影响。胰岛素生物效能的发挥是通过胰岛素与胰岛素受体底物相结合激活胰岛素信号途径来实现的。当胰岛素信号通路受到影响时,就会出现胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的状态。本课题组既往的研究表明,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病及病理产物的形成有着重要的影响。而在阿尔茨海默病患者的脑脊液中胰岛素浓度有所升高,枕叶区域胰岛素受体密度增加,酪氨酸激酶活性减少。而且大量的研究证明了内质网应激与胰岛素抵抗也存在着密切的关系。故本实验以内质网应激为切入点,对深入探讨糖尿病脑病的发病机制和防治具有十分重要意义。祖国医学将糖尿病称为消渴病。其基本病机为阴虚燥热。虽与肺、脾、肾有关。但脾虚致消的论点越来越受到重视。滋补脾阴方药(Zibu Piyin Recipe,ZBPYR)是战丽彬教授以清代吴澄《不居集》的资成汤为基础并结合多年实践化裁而成,以培补后天、滋补脾阴为立方原则。以往的研究表明,ZBPYR具有保护原代海马神经元对抗Aβ毒性,减轻内质网应激,促进蛋白质折迭,改善衰老个体学习记忆能力等神经保护及延缓脑衰老进程作用。因此,本实验将探讨滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病脑病大鼠海马胰岛素信号通路改变的调节作用及其可能的机制。方法:1.SPF级健康成年雄性SD大鼠适应性喂养3d后随机分为空白对照组、脾阴虚组、糖尿病脑病组、脾阴虚糖尿病脑病组和脾阴虚糖尿病脑病+ZBPYR治疗组5组,每组4只。2.适应性喂养结束后,空白对照组和脾阴虚组仍以普通饲料喂养,糖尿病脑病组、脾阴虚糖尿病脑病组和脾阴虚糖尿病脑病+ZBPYR治疗组改高脂饲料喂养,4w后糖尿病模型大鼠按30mg/kg的剂量一次性腹腔注射1%的链脲佐菌素(streptozocin,STZ)溶液。72h后尾静脉采血测量随机血糖,随机血糖>16.7mmol/L的大鼠确定为糖尿病模型,并在STZ注射后的第4、8、12d分别检测空腹血清胰岛素水平(FSI),做口服葡萄糖耐量实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT)。糖尿病模型成功建立后,在此基础上用18d的时间通过疲劳加饥饱饮食失常的复合因素造模的方法建立脾气虚证候模型,再在脾气虚证候模型的基础上通过灌服伤阴药9d最终建立脾阴虚糖尿病脑病病证结合模型。之后停止施加任何造模因素后,对脾阴虚糖尿病脑病+ZBPYR治疗组给予ZBPYR治疗16d,断头取海马。造模期间观察各组大鼠的体征变化。3.通过跳台实验和Morris水迷宫实验进行行为学测试,比较各组大鼠空间学习记忆能力的改变。4.通过Western blotting方法检测各组大鼠海马IRS-1、JNK和IRE1α蛋白表达的变化。结果:1.STZ注射后糖尿病模型大鼠随机血糖明显高于非糖尿病模型大鼠(P<0.01)。在口服葡萄糖耐量实验(OGTT)中,糖尿病模型大鼠出现糖耐量异常;在胰岛素耐量实验(ITT)中糖尿病模型大鼠血糖下降速率比非糖尿病模型大鼠血糖下降的速率要慢,说明糖尿病模型大鼠存在胰岛素抵抗现象。但空腹血清胰岛素水平糖尿病模型大鼠与非糖尿病模型大鼠无明显差异(P>0.05)。2.脾阴虚组表现出饮水量增加(P<0.01),肛温升高(P<0.05)等阴虚内热症状;行为学结果显示糖尿病脑病组和脾阴虚糖尿病脑病组学习记忆能力降低(P<0.05);脾阴虚糖尿病脑病+ZBPYR治疗组学习记忆能力有所改善(P<0.05)。3.Western Blotting结果显示:与空白对照组、脾阴虚组相比,糖尿病脑病组、脾阴虚糖尿病脑病组海马的磷酸化IRS-1、磷酸化JNK和总IRE1α蛋白表达增强(P<0.05),经滋补脾阴方药治疗后磷酸化IRS-1、磷酸化JNK和总IRE1α蛋白表达减弱。结论:1.通过先病后证的造模方法成功建立了脾阴虚糖尿病脑病动物模型,行为学测试糖尿病脑病组、脾阴虚糖尿病脑病组大鼠出现学习记忆障碍。2.ZBPYR可显着改善脾阴虚糖尿病脑病大鼠的学习记忆障碍。3.ZBPYR改善脾阴虚糖尿病脑病大鼠的学习记忆障碍的作用可能与海马胰岛素信号通路有关,ZBPYR具有保护和维持胰岛素信号通路正常传导的作用。4.ZBPYR可以降低磷酸化JNK和IRE1α水平,从而通过改善内质网应激来调节胰岛素信号通路的变化。
易杰[9]2001年在《脾虚证（脾气虚证、脾阳虚证、脾阴虚证）大鼠肝、脾、肾PKC活性和亚型变化及补益脾胃方药调节作用的实验研究》文中研究表明生命现象，是机体内细胞对胞外信息的传导，并最终在胞内产生特定效应的一系列复杂的信号转导和调控的过程。细胞信息传递和调控是研究生命现象的基础。细胞信息传递包括胞外、胞浆和核内信息传递叁部分。胞外第一信使（包括激素、神经递质、细胞因子、生长因子等）与其特异受体结合后，被激活的受体通过刺激特定的效应酶或离子通道，而在胞浆内产生第二信使（包括cAMP，cGMP；IP_3，DAG；Ca~(2+)等）；第二信使诱导核蛋白，调节基因的转录，完成核内外信息传递，而产生核内第叁信使。第二信使调控的蛋白激酶和蛋白磷酸酶，其底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸（抑或酪氨酸）残基的磷酸化或脱磷酸化，导致其构象或功能的改变，从而引起细胞一系列生理生化反应。蛋白质的磷酸化是各种信使物质发挥作用的公共通路，同时也是各种信使分子进行调节的枢纽。大多数第一信使是通过增加胞内第二信使水平而激活蛋白激酶，改变底物磷酸化状态而介导细胞功能的。细胞信号转导在应答环境刺激和调节基因表达、生理反应的同时，不仅维持着细胞的正常代谢，而且最终决定了细胞的增殖、生长、分化、衰老和死亡等生命的基本现象。细胞信息传递任一环节出现障碍或发生信息传递的时、空、量的倒错，都会导致病理过程而引起疾病。 中医学认为，五脏是人体有机整体的核心，在人体生命活动中起着重要的作用，与生命科学中许多基本问题有着密切关系。脾主运化，为后天之本，气血生化之源，在五脏中具有重要地位。中医脏象学说的脏腑是一个结构与功能辨证统一的综合概念。现代研究表明，中医学的脾不仅包括现代解剖学所指的脾，而且也包括现代解剖学所指的胰、淋巴等。脾是以消化系统为主的多系统的功能综合单位，涉及到机体多系统、多器官。脾的病理变化主要表现为饮食水谷运化机能减退，血液的生成和运行障碍，以及水液代谢失调等。脾的病理变化又可累及心、肝、肺、肾等脏腑。因此，脾虚时可以出现多脏器的功能改变，导致许多疾病的发生。 脾与细胞信息传递在生命活动中的作用有着密切联系。生理情况下，二者在人体生命活动中均起着重要作用；病理情况下，二者均可引起基本生命现象的异常，导致各种疾病的发生。 基于这样的思想，本项研究在既往研究基础上，进一步深入研究脾虚证细胞信号传导及其补脾方药的调节作用。具体完成了不同类型脾虚证不同组织蛋 博 士学位 论 文 一 白激酶C活性和亚型变化及补脾方药调控作用的研究。旨在揭示脾虚的病理实 质，以及脾的生理功能与细胞信息传递的内在联系。 主要研究内容有： 1．建立大鼠脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证动物模型。，本项研究采用饮食不节、疲劳过度和药物损伤等复合因素，延长造模周期， 成功地建立了脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证的大鼠动物模型。 2．观察了脾虚证脾组织、肝组织和肾组织PKC活性和亚型的变化 采用底物磷酸化法和免疫印迹法，检测了脾气虚证组和脾阴虚证组脾组织 和肝组织细胞膜和细胞浆PKC活性以及脾阳虚证组脾组织、肝组织和肾组织细 胞膜和细胞浆PKC活性和亚型，经统计学处理，比较不同类型脾虚证不同组织 PKC活性和亚型的变化。 3．观察了补脾方药对脾虚证脾组织、肝组织和肾组织PKC活性及其亚型 的调控作用 应用导师李德新教授拟定的健脾益气、温运脾阳和滋补脾阴方药分别对脾 气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证进行一个月疗程的治疗。 研究结果表明：脾虚证大鼠蛋白激酶C活性发生一系列改变，补脾方药能 有效地调控其PKC活性及亚型。具体如下： 1．各模型组不同组织PKC活性有着不同的变化 脾虚证大鼠脾细胞膜PKC活性，叁种模型组均下降，其降低次序为：脾阴 虚证组＞脾气虚证组＞脾阳虚证组，但叁组中每两组之间无明显差异。脾虚证大 鼠脾细胞浆PKC活性，除脾气虚证组无明显变化外，其它两种模型组均升高， 脾阴虚证组大于脾阳虚证组。其中，除脾阳虚证组和脾阴虚证组之间无明显差 异外，其它每两组之间均存在明显差异。脾虚证大鼠肝细胞膜和细胞浆PKC活 性，除脾气虚证组肝细胞膜PKC活性无明显变化外，其它各组肝细胞膜和细胞 浆PKC活性均升高。肝细胞膜PKC活性升高次序为：脾阳虚证组大于脾阴虚 证组。每两组之间均存在明显差异；肝细胞浆升高次序为：脾阳虚证组＞脾气 虚证组＞脾阴虚证组，脾气虚证组与脾阳虚证组之间存在明显差异，但与
衣雪洁[10]2006年在《健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌GLUT4和相关信号转导的影响》文中研究表明目的：不同的运动项目其运动疲劳的机制不同，中西医对运动疲劳的机制做出了各自的解释，西医认为长时间大负荷耐力运动引起的过度疲劳与肌糖原的恢复关系密切。而中医则认为“劳倦过度则脾病”。为此各自采用的恢复手段也截然不同，西医以补糖为主加快机体的恢复，而中医则采用健脾的方法改善脾胃的功能。两种方法各有优缺点。我们将两者有机的结合起来通过健脾补糖改善胃肠功能，提高能源物质的储备，增强骨骼肌的供能能力。 通过该项研究我们将从胃肠功能、骨骼肌的糖和自由基代谢以及骨骼肌的信号转导系统4个方面验证“长时间大负荷的耐力训练导致脾虚”的假说。并将着重探讨健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌MAPK信号转导系统中的P38、ERK和PI3转导通路中PKB的影响，同时进一步探讨其与糖代谢和自由基代谢的关系。这将为验证“脾主肌肉”和“劳倦过度则脾病”的中医理论提供实验依据，也为寻找中西医结合加快运动疲劳的恢复手段提供新的思路。 方法：我们将75只Wistar雄性大鼠随机分为5组，即安静对照组、运动对照组、运动健脾组、运动补糖组和运动健脾补糖组。安静对照组常规饲养，各运动组将进行为期6周递增大负荷游泳训练，在每次训练结束后1h内分别灌胃蒸馏水、四君子汤3.4g／KgBW)、葡萄糖(3.0／KgBW)和四君子汤糖溶液(3.4+3.0Kg／BW)，在末次训练后24h取材，采用分光光度、放射免疫和分子生物学等方法测定相关的指标，实验数据经SPSS11.5软件包进行统计学处理。 结果： ① 6周大负荷的训练使大鼠血浆D-木糖、胃泌素显着下降(P＜0.05；P＜0.01)，胃动素显着升高(P＜0.01)；健脾和健脾补糖能使训练大鼠血浆D-木糖含量均显着的回升(P＜0.01)；且运动健脾补糖组还显着高于运动补糖组(P＜0.05)。 ② 与运动对照组相比，运动补糖能明显提高肌糖原的储备(P＜0.05)；运动健脾补糖组的肌糖原含量极显着高于其它各组(P＜0.01)。 ③ 6周大负荷的训练引起大鼠的骨骼肌LDH和PK活性均显着下降(P＜0.05)；健脾组和补糖均能显着提高训练大鼠的的骨骼肌PK的活性(P＜0.05)；而健脾补糖能显着提高训练大鼠骨骼肌LDH、PK和ICDH活性
参考文献：
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[8]. 滋补脾阴方药对脾阴虚糖尿病脑病大鼠海马胰岛素抵抗影响的研究[D]. 胡守玉. 大连医科大学. 2009
[9]. 脾虚证（脾气虚证、脾阳虚证、脾阴虚证）大鼠肝、脾、肾PKC活性和亚型变化及补益脾胃方药调节作用的实验研究[D]. 易杰. 辽宁中医学院. 2001
[10]. 健脾补糖对过度训练脾虚大鼠骨骼肌GLUT4和相关信号转导的影响[D]. 衣雪洁. 辽宁中医药大学. 2006