何正权[1]2003年在《应用转基因技术提高稻谷耐贮藏特性的研究》文中提出粮食安全是一个全球性的战略问题，是关系到国家乃至世界政治稳定和经济发展的大事。我国有65％以上的人口以大米为主食，水稻担当着我国粮食安全的第一重任，而粮食贮备又是其中重要的一环。我国每年因稻谷陈化问题损失的包括作为食用和种用的稻谷占总产量的3％，造成几十亿元的经济损失。稻谷在一般贮藏条件下第二年就会产生陈化变质现象，高温高湿地区则更快。为此，我国储备粮通常采用分散分批、定期推陈储新、轮流更新的方法，耗费了大量的人力、物力和财力。 近年来的研究表明，稻谷贮藏期间脂质的降解是导致其品质下降并产生陈味的主要原因之一，其中脂氧合酶是脂质降解的关键酶。因此从理论上讲，lox的缺失可以明显地阻止脂质过氧化作用，减缓贮藏粮食氧化变质的速度，保持清新气味，提高耐贮性。上述推论已经在水稻LOX-3缺失体与耐贮性关系的研究中得到了证实。另外，水稻中lox的叁个同工酶基因已被成功克隆。这些研究为利用基因工程的方法提高稻谷自身的耐贮藏遗传特性铺平了道路。本研究利用基因工程新近研究进展，分别采用反义RNA及RNA干涉技术在水稻胚乳中特异沉默内源lox基因，以期提高稻谷自身的耐贮藏遗传特性。 另外，基于对转基因安全的考虑，特别是本试验的目的器官是作为粮食的水稻胚乳，我们从Syngenta公司引进了甘露糖选择标记基因，以期能初步建立水稻遗传转化的甘露糖选择标记系统，为今后能在水稻转基因研究中利用这一安全的选择标记系统打下基础。 主要研究结果如下： 1) 构建了叁个用于转化的双元表达载体：A：p13W4H，含胚乳特异表达启动子、lox cDNA发夹结构及潮霉素选择标记基因hpt；B：p13W8AP，含胚乳特异表达启动子、lox cDNA反义结构及甘露糖选择标记基因manA；C：p13WSHP，含胚乳特异表达启动子、lox cDNA发夹结构及甘露糖选择标记基因manA。 2) 以农杆菌介导用表达载体p13W4H对粳稻品种石狩白毛(Ishikari-shiroge)和T162进行了转化，分别获得158个和56个独立转化株系。经PCR检测，石狩白毛转基因植株的PCR阳性率为94.3％(149/158)，T162转基因植株的PCR阳性率为98.2％(55/56)。Southern检测结果表明，外源DNA片段已完整整合到水稻基因浙江人学博士学位论文中文摘要组中，多数为单拷贝插入，拷贝数最多的有4个。对部分Tl代种子进行了潮霉素抗性遗传分析，证明外源基因在转基因后代中发生了分离。本研究获得的幼胚转化效率为13.49%，而转化成熟胚的效率为11.%%。与本实验室获得的结果相比较，幼胚转化效率相对较低，文中对此进行了讨论。 3)以幼胚为转化受体，农杆菌介导分别用p13WSAP和p13WSHP对粳稻品种石狩白毛进行了转化，经过在含不同甘露糖和蔗糖浓度组合的培养基上筛选，分别获得13个和27个独立转化株系。在15岁L甘露糖结合5留L蔗糖使用时，获得了最高转化效率(6 .9%)。经PCR、Southem检测以及甘露糖抗性遗传分析，证明外源基因已经完整整合到水稻基因组中，并在转基因后代发生了分离。转pl3w8AP的平均转化效率为2.4%，大大低于转P13WSHP的平均转化效率(4 .7%)，这表明转基因效率可能与外源目的基因结构有很大关系。本研究初步建立了水稻遗传转化的甘露糖选择标记系统。文中还对该体系的各种影响因素及存在的问题分别进行了分析讨论。 4)分别对转p一3W4H的9个、转pl3ws解的2个和转pl3w8HP的4个株系的Tl代种子进行了人工陈化以及LOX酶活测定，并将它们分别与潮霉素或甘露糖抗性遗传分析结果以及Southem杂交结果进行了对比。对于多数单拷贝插入的转基因株系，人工陈化后发芽呈现的分离情况与潮霉素或甘露糖筛选后出现的分离情况一致，即成3:1分离，但也有例外。对于双拷贝或多拷贝插入的株系，潮霉素或甘露糖筛选时的抗性率较高，而人工陈化后的发芽情况却普遍偏低。人工陈化后的发芽率与LOX酶活呈现负相关关系。发夹结构对内源LOX酶活最高抑制效率达92%，明显高于反义结构的抑制效率(65%)。选择TZ代中性状较好的株系进行了人工陈化试验，并从中选出了3个纯合耐贮藏株系。文中还对lox cDNA不同结构及其拷贝数对水稻内源基因的沉默或阻抑效果以及可能的机制进行了讨论。
李俊卿[2]2008年在《水稻脂肪氧化酶RNA干扰载体的构建及转化水稻进行耐储藏的研究》文中提出粮食安全是一个全球性的战略问题,是关系到国家乃至世界政治稳定和经济发展的大事。我国有65%以上的人口以大米为主食,水稻担当着我国粮食安全的第一重任,而粮食贮备又是其中重要的一环。我国每年因稻谷陈化问题损失的包括作为食用和种用的稻谷占总产量的3},造成几十亿元的经济损失。稻谷在一般贮藏条件下第二年就会产生陈化变质现象,高温高湿地区则更快。为此,我国储备粮通常采用分散分批、定期推陈储新、轮流更新的方法,耗费了大量的人力、物力和财力。近年来的研究表明,稻谷贮藏期间脂质的降解是导致其品质下降并产生陈味的主要原因之一,其中脂氧合酶是脂质降解的关键酶。因此从理论上讲,lox的缺失可以明显地阻止脂质过氧化作用,减缓贮藏粮食氧化变质的速度,保持清新气味,提高耐贮性。通过搜索genbank数据库,设计引物。通过PCR技术从玉米和水稻DNA中分别克隆了玉米泛素启动子(Ubi组成型)和水稻种子脂肪氧化酶基因的特异启动子(SL特异型)、玉米泛素第一个内含子(IN)。从植物真核表达载体PBI121上克隆终止子NOS。克隆的玉米泛素启动子与已知的序列同源性为99.6%,其它序列同源性均为100%。通过比对多种植物的LOX基因,找到同源性比较高的序列。利用RT-PCR技术从水稻总RNA中克隆得到了一对反向互补序列的LOX基因片段(G1和G2)。为了确定我们克隆的玉米泛素启动子是否有活性。我们用玉米泛素启动子替代了植物真核表达载体PBI121中的35S启动子, GUS染色结果显示此启动子的活性很高。利用植物真核表达载体PCAMBIA1301和上述片段,通过构建中间载体的方法,使构建过程简单化,构建了两个植物RNAi表达载体,并通过酶切检测可知构建成功,两个载体含有如下部分:1) p13UL,含玉米泛素启动子、含内含子的lox cDNA发夹结构及潮霉素选择标记基因hpt; 2) p13SL,含水稻种胚脂肪氧化酶基因的特异启动子、含内含子的lox cDNA发夹结构及潮霉素选择标记基因hpt。利用农杆菌转化法将p13UL和p13SL两个载体分别转化到水稻愈伤组织中。得到再生植株,得到的再生植株品系均为中花16号。PCR检测基因组DNA显示,转p13SL载体的14株转基因植株中得到4株阳性植株,转p13UL载体的6株转基因植株中得到3株阳性植株。这说明两个载体都插入水稻基因组中。为了研究插入基因组的RNAi片段是否可以表达并起到基因敲除的作用,我们利用了伤害可以诱导LOX基因大量表达这一特性,对转入p13UL的阳性转基因植株进行伤害诱导,并利用半定量RT-PCR分析其表达量,结果显示,对照组在进过伤害诱导后LOX基因表达水平明显增加。而实验组进过伤害诱导后LOX基因表达水平也有所增加,但是增加量明显比对照组少。以上试验说明我们插入水稻中LOX发卡结构起到了RNA干扰的作用。
白苏阳[3]2015年在《通过RNA干扰技术沉默OsLOXs在贮藏期间提高水稻种子活力》文中进行了进一步梳理科学与技术的创新使现代农业加速发展,粮食产量也在逐渐增加,但粮食安全仍然是一个亟待解决的全球性战略问题,粮食储备问题则是其中的重中之重。水稻是我国主要的粮食作物,但据农业部统计,每年我国因稻米陈化而引起的粮食损失约占其总贮藏量的8%,为了延长贮藏时间,我国通常采用适合的包装材料,修建低温库等方法,但耗费了大量的资源和能源并且不适宜在广大农户中推广使用。以往的研究表明,稻谷的陈化是由于存放过程中脂质大量降解造成的,而脂氧合酶则是影响脂质降解的关键酶。目前,已有四种脂氧合酶被分离出来,即LOX-1(DQ389164),L-2(X64396),LOX-3(Os03g0700400)和 r9-LOX1(AB099850),本实验室曾将脂氧合:酶敲除或是过表达来探究其在水稻生长发育过程中所起的功能,结果发现OsLOX1代谢途径中的产物在植物创伤应激及病毒侵害方面有防御作用;OsLOX2从3天大的幼苗中被克隆出来,可以促进水稻种子萌发,适当降低OsLOX2的表达量,可以提高种子的活性;OsLOX3可以催化水稻种子中脂质的降解,并产生不良的气味。因此,利用基因工程从水稻本身解决其陈化变质问题无疑是一个合理且经济的方法。本研究构建了 12种干扰载体并通过分子鉴定得到了阳性转基因植株,分别利用人工老化和自然老化处理得到的转基因种子,通过发芽率测定,发现只有NPF1(L3-100)、NPF2(L3-0)、X03(L2-L3)、X06(L2)这四类干扰植株与野生型相比贮藏性有所提高,其中NPF1的贮藏性最好。Southern blot实验表明NPF1干扰株系有两个拷贝,分别位于2799bp和1953bp及1953bp和1515bp之间,并能稳定遗传给后代。时空表达分析表明,OsLOX3基因在这四个干扰品系的不同植物组织中均有表达,其中根中表达量最高,但与野生型比,干扰家系中OsLOX3表达量均有下降,而种子作为贮藏的主要器官,其OsLOX3表达量较野生型也明显下降。改良的TTC实验表明,干扰品系中NPF1中TTCH的含量明显高于野生型。亚油酸为底物进行LOX酶活性测定结果也显示NPF1的种子活力高于野生型。干扰品系中MDA的含量显着低于W001。直链淀粉、总淀粉及蛋白质含量的测定结果也表明NPF1与W001相比,贮藏物质含量变化趋势更为稳定,这均说明通过RNAi技术特异性沉默OsLOXs基因,干扰品系的贮藏性得到了提高。我们也对这4个干扰品系的农艺性状进行考察,发现其农艺性状较为优异。我们将会进一步对OsLOX及干扰品系进行筛选,以期获得具有优异农艺性状且具有良好耐贮性的水稻新品种。
高家东[4]2012年在《杂交水稻种子耐贮藏生理基础和蛋白质组学研究》文中研究表明利用广东金稻种业有限公司生产的广东大面积推广应用的杂交籼稻种子,进行种子贮藏试验,筛选出耐储藏组合博优998和不耐储藏的组合Ⅱ优998。然后测定两个组合种子贮藏前后的生理指标,包括可溶性糖和丙二醛含量、超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性等；进而提取两个组合贮藏前后的种胚蛋白质进行双向电泳(2-DE),并联用MOLDI-TOF/TOF质谱对博优998和Ⅱ优998贮藏前后的种子胚进行蛋白质组学分析。同时采用iTRAQ定量技术对提取的蛋白通过串联质谱及多维液相色谱联用进行蛋白质组学分析。试验结果表明：1.贮藏2年后,博优998发芽率仍有80.25%,而Ⅱ优998发芽率仅为50.25%,差异极显着。从可溶性糖含量测定结果来看,贮藏前后博优998种子可溶性糖含量均极显着低于Ⅱ优998。且博优998贮藏2年前后差异不显着,Ⅱ优998则显着下降。博优998在贮藏过程中种子内储藏物质变化小,SOD、CAT活性与Ⅱ优998相近而POD活性弱,表明其种子生理代谢较Ⅱ优998弱,可能与种子活力保持密切相关。丙二醛(MDA)含量博优998和Ⅱ优998种子贮藏前两组合差异不显着,贮藏2年后Ⅱ优998的MDA含量极显着高于博优998。推测在贮藏过程中博优998产生的MDA少,其膜脂过氧化程度较低,有害物质的积累少,也与博优998耐贮藏有关。2.通过2D-PAGE结合质谱与生物信息学分析获得耐贮藏相关蛋白。双向电泳后扫描凝胶,用PDQuest8.0分析软件对2-D图象进行分析,通过(T-test95%)差异分析找到3倍以上差异点为94个,通过MOLDI-TOF/TOF质谱分析鉴定的点为74个,除出其中23个重复点,共鉴定出51个差异蛋白。种子贮藏过程中,博优998在贮藏前后比较的差异点少(6个),得到鉴定点为2个,占总鉴定数(74)的百分率为2.70%；Ⅱ优998在贮藏前后比较的差异点多(40个),得到鉴定点为32个,占总鉴定数(74个)的43.24%。也表明不耐贮藏品种在贮藏前后发生变化较大,其生命活动旺盛,使得物质消耗大。3.贮藏前博优998与Ⅱ优998种子中共鉴定到差异蛋白28个,其中在贮藏前博优998上调蛋白数为19个,下调的蛋白为9个。贮藏后鉴定到的差异蛋白28个,其中在贮藏后博优998上调的蛋白数为9个,下调蛋白3个。进而对这些差异蛋白GO富集分析来描述相关基因和基因产物的属性,包括基因的分子功能(MolecularFunction)、所处的细胞位置(Cellular Component)、参与的生物过程(Biological Process)。确定了LEA蛋白、蛋白酶抑制剂、DNA损伤修复类蛋白、谷氧还蛋白(glutaredoxin)、类萌发素蛋白、Cupin家族蛋白、磷酸激酶等主要差异蛋白。4.通过iTRAQ技术与串联质谱及多维液相色谱联用进行蛋白质组学分析,鉴定出蛋白1557个。种子贮藏过程中博优998种子3倍以上的差异蛋白仅有5个(其中1个上调,4个下调),Ⅱ优998中3倍差异以上的蛋白有20个(其中2个下调,18个上调),贮藏过程中Ⅱ优998的差异蛋白数大于博优998,这与2-D鉴定结果趋势一致。不同耐贮藏性品种之间贮藏前3倍以上的差异蛋白有30个(其中26个上调,4个下调),贮藏后3倍差异以上的蛋白有22个(其中21个上调,1个下调)。但iTRAQ与2-D电泳技术鉴定的差异蛋白质不尽相同。通过GO功能显着性富集分析给出与所有鉴定到的蛋白质背景相比,差异蛋白质中显着富集的GO功能条目,确定了差异蛋白质行使的主要生物学功能。同时,以KEGG Pathway为单位,应用超几何检验,找出与所有鉴定到蛋白背景相比,在差异蛋白中显着性富集的Pathway。确定了耐贮藏相关差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。5.结合2-DE技术和iTRAQ定量蛋白质组学初步探索耐贮藏机理：博优998种子LEA蛋白、蛋白酶抑制剂、DNA损伤修复类蛋白等含量较高,提高种子抗劣变能力,减少DNA损伤,通过抑制蛋白酶的活性降低物质消耗速度,提高耐贮藏性；高含量谷氧还蛋白(glutaredoxin)及类萌发素蛋白等也保证了博优998受活性氧(ROS)危害较轻。而Ⅱ优998中,较高含量的Cupin家族蛋白以及凝集素等可诱导细胞程序性死亡(凋亡),而且DNA损伤修复类蛋白显着降低,与抗逆有关的SGT1蛋白以及碱基修复蛋白等含量也较低,使种子劣变损伤严重。Ⅱ优998种子中差异蛋白多,且与糖代谢、嘌呤代谢以及脂肪酸代谢的各种酶含量高,生理活动旺盛,消耗物质多,可能也与Ⅱ优998种子不耐贮藏有关。6.比较2-D电泳蛋白质组学和iTRAQ定量蛋白质组学的结果,可以看出,iTRAQ技术鉴定的蛋白有1557个,定量精度较高。另外,iTRAQ技术可以在一次实验中,进行多达8个样品的比较,效率也高。但2-D电泳蛋白质组学也不可忽视,2-DE技术在分析差异大的蛋白(100倍以上质的差异)有直观、可靠的优势,关于GO功能显着性富集分析确定的差异蛋白质行使的主要生物学功能以及显着性富集的Pathway分析确定得耐贮藏相关差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径,两种技术之间也不尽相同。因此,在进行差异蛋白质组学分析时,2-DE技术和iTRAQ技术可以互补,不可偏废。
黎泉[5]2013年在《施氮量对功能稻产量、品质与功能特性的影响》文中提出“功能稻”是指稻米中富含的一种或几种营养元素,食用后能改善人体生理功能的特种用途的水稻品种,简称功能稻。随着我国经济的快速发展,人民开始进入小康生活,对稻米的要求也越来越高。为满足人们对稻米营养保健的要求,功能稻的研究成为一个热点。2010-2011年在丹阳试验基地,以巨胚稻、低谷蛋白水稻、富铁水稻、耐贮藏水稻等6个功能稻为材料,设置5个氮肥处理,研究了氮肥水平对不同功能稻产量及其产量构成要素、碾米品质、外观品质、营养品质和功能特性等指标的影响,为功能稻高产优质栽培提供理论依据和技术参考。主要研究结果如下：(1)在产量及产量构成要素上,随着施氮量的增加,6个功能稻产量均呈先升后降低趋势,处理间达显着水平,在270kg.hm-2施氮量下产量最高,施氮主要影响了功能稻的穗数和穗粒数,而对结实率和千粒重的影响较小。不同功能稻产量对氮素的响应差异显着,其中低谷蛋白品种W1240和富铁品种H9405产量对氮肥较为敏感,而低谷蛋白水稻W1721和W3660、巨胚稻W025、耐贮藏水稻W017产量对氮肥的响应上较为钝感。随着施氮量增加,抽穗期LAI、百公斤籽粒需氮量、成熟期干物质量和植株总吸氮量显着增加,氮素收获指数和氮素利用率呈下降的趋势。(2)在碾米品质和外观品质上,随施氮量增加,出糙率、精米率和整精米率呈增加的趋势。碾米品质呈现显着的基因型差异：出糙率、精米率和整精米率低谷蛋白水稻W1240最大,富铁水稻H9405最小。随施氮量增加,粒长、粒宽和垩白率均呈下降的趋势,长宽比略有增加；施氮主要影响了垩白率,而对粒型(粒长、粒宽、长宽比)的影响较小,垩白率对氮素的响应低谷蛋白水稻W1240、W3660和耐贮藏水稻W017最大,而低谷蛋白水稻W1721和富铁水稻H9405对氮素较为钝感。(3)在营养品质上,随着施氮量增加,精米中直链淀粉含量下降,其中低谷蛋白水稻W1721和巨胚稻W025降幅最大,而富铁水稻H9405对氮素较钝感。增施氮肥,糙米和精米中蛋白质含量显着增加,在糙米中,低谷蛋白水稻W3660和耐贮藏水稻W017增幅较大,低谷蛋白水稻W1240和巨胚稻W025增幅较小；在精米中,富铁水稻H9405和耐贮藏水稻W017增幅最大,而低谷蛋白水稻W1240和巨胚稻W025增幅最小。(4)在低谷蛋白水稻蛋白组分上,与常规稻比,低谷蛋白水稻糙米和精米中醇溶蛋白含量较高,而谷蛋白含量较低。随着施氮量增加,低谷蛋白水稻4种蛋白组分显着增加,施氮主要影响了低谷蛋白水稻醇溶蛋白和谷蛋白含量,对清蛋白和球蛋白含量的影响较小。蛋白组分对氮素的响应存在显着的基因型差异：糙米中醇溶蛋白和谷蛋白、精米中谷蛋白低谷蛋白水稻受到氮肥的影响均比常规稻小,叁个低谷蛋白水稻糙米和精米中谷蛋白含量及对氮素响应大小均表现为W1240<W1721<W3660。由产量和谷蛋白含量的氮肥效应方程可得本实验条件下叁个低谷蛋白水稻W1240、W1721和W3660的最高施氮量分别在342kg/hm2、265kg/hm2和47kg/hm2左右。(5)在Fe吸收与分配上,富铁水稻H9405成熟期整个植株,穗部枝梗、颖壳、米糠和精米等各部分铁含量及铁在籽粒中的分配均极显着高于对照W1240。随着施氮量增加,富铁水稻H9405和对照W1240成熟期植株和枝梗、颖壳、米糠和精米中铁含量、抽穗期和成熟期植株铁总吸收量均增加。施氮对富铁水稻和低富铁水稻籽粒铁的分配影响表现不一致,随着施氮量增加,在富铁水稻H9405中,富铁品系H9405穗中Fe的分配呈下降的趋势,而对照W1240穗中Fe的分配先增加后下降。精米中Fe含量两品系均随施氮量增加而增加,其中富铁水稻H9405在270kg·hm-2施氮量下增加达显着水平。
汪仁[6]2006年在《水稻脂氧合酶基因OsLOX1的克隆功能分析》文中进行了进一步梳理本研究通过设计简并引物、RT-PCR扩增并结合RACE方法克隆得到水稻脂氧合酶基因OsLOX1，原核表达并结合生化分析方法测定OsLOX1的酶学特性，对该基因的结构特点、表达特性进行了研究。在此基础上，利用农杆菌介导将正义和反义OsLOX1基因导入水稻植株，探讨OsLOX1在植物体内的生理功能及其与抗虫性的关系。研究结果如下：1水稻种子成熟和萌发过程中脂氧合酶同工酶活力分析利用本实验室筛选到的LOX-3缺失突变体北陆PL2和正常的水稻品种越光，研究种子成熟及萌发过程中LOX活性的变化规律，发现2个水稻品种在种子成熟及萌发过程中LOX活性变化规律基本一致，即开花后的10—25天活性持续升高，以后趋于下降，但在LOX-3缺失的品种(北陆PL2)中变化很小；在萌发初期LOX活性迅速升高，浸水萌发后2天达到峰值，然后随萌发时间的延长而下降。同工酶分析显示，在水稻成熟过程中种子LOX-3表达水平及活性都显着高于其它两种酶，而在种子萌发过程中LOX-2表达水平和活性占优势，LOX-1则在两种情况下都显示较低的表达水平和活性。研究也进一步证明北陆PL2是LOX-3缺失的水稻品种。2水稻成熟过程种胚RNA提取方法的建立建立了一种全新、简单的提取水稻种胚RNA的CTAB-LiCl提取法，可在不用液氮的室温下有效地排种胚中大量带有的多糖和本身脂质的干扰，所得RNA样品经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析证明具有较高的纯度和完整性，并可进一步满足RT-PCR、Northern印迹以及cDNA文库构建的实验需要，适用于富含多糖和脂质的植物组织RNA的提取。3水稻种子脂氧合酶基因OsLOX1的克隆、序列分析与表达规律研究根据脂氧合酶的保守序列设计简并引物，利用RT-PCR方法，从水稻种胚中克隆了一个新的脂氧合酶基因cDNA片段。进一步用5'-RACE和3'-RACE的方法得到该基因3154bp的全长cDNA(OsLOX1，GenBank登录号：DQ389164)。进一步克隆了OsLOX1的基因组DNA，OsLOX1基因具有9个外元，8个内元。Southern分析显示该基因在基因组中是单拷贝克隆。分析了该基因启动子序列，发现该启动子含有种子特异表达的顺式元件和多个受伤害以及茉莉酸诱导的顺式作用元件。组织表达谱分析表明，OsLOX1在未成熟胚、萌发过程中的种子及幼苗都以较低的水平表达，在正常的根、茎和叶中都不表达，而叁叶期的幼苗经过伤害诱导3小时后OsLOX1表达量最高，且褐飞虱取食后其转录物表达量也急剧升高，至6小时达到最高值。这些结果都表明，OsLOX1的表达受生物和非生物逆境胁迫诱导，参与水稻的防御反应；另外，该酶还参与水稻的生长发育过程。4水稻种子脂氧合酶OsLOX1在大肠杆菌中的表达与蛋白特性研究以本实验室克隆到的水稻种子脂氧合酶OsLOX1全长cDNA为模板，用含有特异酶切位点的P1、P2为引物，通过PCR方法得到该基因的编码框全长。将其构建到大肠杆菌表达载体pET30(+)上，转化进BL21(DE3)菌株，获得含OsLOX1的重组工程菌。经过IPTG诱导，水稻脂氧合酶基因OsLOX1的表达产物在表达菌株中大量积累。诱导16小时后用超声波破碎仪裂解表达菌株，裂解液用组氨酸标签试剂盒进行纯化和复性。复性后的蛋白以亚油酸为底物进行酶活测定，结果显示，该蛋白具有明显的脂氧合酶催化活性。利用比色法测得该酶的最适温度为30℃及最适PH值4.8。本实验以原核表达的方法得到、并使用组氨酸标记试剂盒纯化出具有生理活性的水稻种子脂氧合酶OsLOX1，为植物种子脂氧合酶的研究提供了一种可靠的供选择方法，也为更好地研究水稻种子脂氧合酶OsLOX1的结构与功能的关系提供了良好的材料和方法。研究的结果也进一步表明本试验所克隆的基因OsLOX1编码的蛋白可能是水稻脂氧合酶-1(LOX-1)。5农杆菌介导获得转正义和反义OsLOX1基因水稻植株及其抗虫性鉴定利用农杆菌介导的方法，将含有水稻脂氧合酶基因OsLOX1的两个双元载体pLOX1S(35SPro．5’+OsLOX1 cDNA+NosTer3’)，pLOX1A(35SPro．5’+antisene-OsLOX1 cDNA+NosTer3’)，转入粳稻栽培品种北陆PL2中，共得到46个独立的转基因植株。经过潮霉素筛选叶片和PCR验证确定得到32个阳性的转基因水稻植株，阳性率为69.6％。潮霉素筛选叶片、种子和Southern blot等检测都表明，目的基因已经整合到水稻基因组中。RT-PCR、酶活测定的结果都表明，目的基因在转基因水稻中有不同程度的表达。对部分转基因植株进行褐飞虱的鉴定发现，与未转化的对照植株相比，转反义基因的水稻植株降低对褐飞虱的抗性；一部分转正义基因水稻植株能提高对褐飞虱的抗性，而另一部分转正义基因植株由于共抑制的结果也表现降低对褐飞虱的抗性。
黄洁雪[7]2011年在《水稻种胚脂氧合酶基因OsLOX2的克隆与功能分析》文中研究说明延缓陈化是稻谷安全储藏的重要任务。脂肪过氧化是稻谷陈化变质的重要原因,而脂氧合酶是脂肪过氧化的关键酶,所以对水稻种胚脂氧合酶进行研究对于种子耐储藏具有重大意义。研究表明,水稻种胚脂氧合酶家族中脂氧合酶-3(OsLOX3)被认为与稻谷的耐贮藏相关,脂氧合酶-1(OsLOX1)与幼苗抗虫性相关,而脂氧合酶-2(OsLOX2)的生理功能目前仍不清楚。本研究通过克隆水稻种胚OsLOX2基因,旨在通过该基因的一系列功能分析,探讨脂氧合酶-2对种子老化和萌发的影响,为开发耐储藏水稻新品系奠定理论基础。时空表达分析表明,OsLOX2基因在开花后7天的成熟植株的不同组织中均有表达,其中根与茎中表达量最高,穗较低,叶片中极低；开花后种胚开始形成,自开花后6天至21天内,每3天取种胚进行表达分析,发现OsLOX2的表达量呈先上升后下降的趋势,在开花后第18天达到峰值；成熟种子浸水后种胚开始萌动再发育,OsLOX2基因在萌动早期的胚中表达量显着增高,4天时的幼叶及幼根中持续高表达,随后迅速降低,直至12天时表达量已趋于本底水平。综合这些结果表明,OsLOX2基因在种胚的形成及萌动后再发育初期阶段均特异性地表达,该基因与这两个发育阶段中至关重要。为了进一步分析OsLOX2基因的功能,我们从萌动的日本晴种胚中克隆OsLOX2的全长cDNA,并由此展开功能分析。利用35S::GFP:OsLOX2融合表达载体在水稻原生质体中的瞬时表达确定OsLOX2蛋白在细胞质中起作用。利用T7pro::His:OsLOX2:His载体原核表达并纯化获得OsLOX2重组蛋白,酶活性测定结果显示OsLOX2对底物亚油酸的酶活显着高于亚麻酸,对温度具有较宽的适应范围(20-50℃)。此外,利用农杆菌介导获得了OsLOX2基因过表达及RNA干扰的转基因纯合株系,结合从CIRAD突变体库索取到日本晴Tos17插入突变体材料CU313865,综合分析了基因表达水平与种子萌发及老化的关系。结果显示,过表达转基因株系相比于对照受体材料的OsLOX2基因的表达量显着增加,表现出种子萌发速率提高,老化加快(老化处理后种子的发芽率下降)；反之,在OsLOX2基因表达降低的RNA干扰株系及Tos17突变体中,均表现出较对照低的发芽速率；有趣的是,OsLOX2基因表达减弱的株系老化减缓,表现在老化处理后发芽率较对照高,而当OsLOX2基因表达过低时,老化处理后发芽率反而降低,即造成萌发障碍。说明OsLOX2基因能够促进萌发,加速老化,但在种子萌发过程中必不可少。适量降低该基因的表达将有助于在不阻碍种子萌发的前提下延长种子寿命,增加耐储藏性,在种子生产和储存上具有重要意义。
沈文飚, 郑天清, 翟虎渠, 万建民[8]2002年在《水稻种胚脂氧合酶-3和耐贮性关系的研究现状与策略》文中提出稻谷贮藏期间脂质的降解是导致其品质下降并产生令人不快气味的主要原因之一。已经发现 ,约占水稻种胚LOX总活性 80 %～ 90 %的脂氧合酶 3(LOX 3)是脂质降解并导致产生令人不快气味的主要关键酶 ,缺失体 (DawDam)的研究还表明 ,其活性缺失可以降低贮藏期间稻谷不饱和脂肪酸的过氧化水平 ,减少包括己醛、戊醛和戊醇等令人不快的陈化气味的累积 ;遗传分析的研究则证实LOX 3的缺失由单隐性基因控制。另一方面 ,从酶学特性来看 ,种胚LOX 3与已纯化的水稻叶片LOX和克隆的 3种水稻叶片Lox的编码蛋白是明显相异的。今后需进一步加强水稻种胚LOX 3缺失对耐贮性影响的研究 ;同时由于仍未克隆到编码稻谷种胚LOX 3的基因 ,更不太清楚其缺失的分子机理 ,而诸如大豆和豌豆等其它粮食作物种子中脂氧合酶缺失的表型则涉及结构基因中编码序列的单碱基颠换以及启动子区域的替代、插入和删除等 ,因此有必要克隆控制水稻种胚LOX 3缺失的隐性基因和相应的显性基因 ,阐明它们基因表达和调控的机制差异 ;最后进一步提出耐贮藏水稻新品种选育的理论和实践概念。
于永红, 朱智伟, 程方民[9]2006年在《稻米的脂肪》文中认为本文综述了稻米中脂肪的种类及与品质和陈化的关系,讨论了利用分子标记辅助选择技术和转基因技术手段改良稻米中脂肪含量的前景。
沈圣泉[10]2003年在《水稻（Oryza sativa L.）若干重要性状的QTL主效应、上位性效应及GE互作效应分析》文中指出本研究利用珍汕97B／密阳46和协青早B／密阳46所构建的两个RIL群体(简称ZM-RIL和XM-RIL)及其相应分子遗传图谱，通过设置多环境或多处理的遗传试验，应用可以同时检测QTL主效应、上位性效应和G×E互作效应的遗传分析方法，对涉及水稻农艺、品质、抗逆等11个重要性状进行QTL定位和GE分析，并对结果进行了分析和讨论，旨在从分子水平上更深入地了解其遗传本质。主要研究内容和结果如下： 1、分蘖松散度：用XM-RIL及其遗传图谱，进行海南和杭州两地试验，以分蘖夹角为松散度(弧度)指标，对该性状的两个环境下表现数据进行联合分析。共检测到2个主效应QTL和3对显着的加性×加性双基因互作。在主效应QTL中，qTA8-2的LOD值为21.7，贡献率为23.2％；qTA9-2的LOD值为22.0，贡献率为19.5％；增加松散度基因前者来自母本、后者则来自父本；这2个QTL不存在显着的GE互作。而所检测到的3对显着双基因互作，对该性状表型变异的总贡献率仅为7.69％，显得较为次要。 2、落粒性：用ZM-RIL群体及其遗传图谱，在海南和杭州两地试验，以稻穗下落法测到的落粒率(％)为指标，进行两地数据QTL联合分析。结果表明，ZM-RIL群体的不同株系在两地间落粒率变化很大。在海南，该性状呈近似正态分布；在杭州，则呈明显偏态分布。试验共检测到8个主效应QTL，位于第1、2、3(2个)、6(2个)、7和11等6条染色体上，每个QTL影响落粒率的加性效应均不太大，其幅度为1.7％-3.9％，共解释群体落粒性性状变异的9.05％。其中，有3个主效应QTL(qSH3-1、qSH3-2和qSH6-1)存在显着的GE互作，它们均使海南增加落粒率和杭降低落粒率，且GE总贡献率几乎接近加性效应总贡献率，表明GE互作对落粒率具有重要影响。此外，试验还检测到5对上位性互作QTL，这些互作共解释群体落粒性性状变异的3.39％，单个互作的贡献率为0.47％-0.85％，未检测到上位性与环境的显着互作。 3、柱头外露率:用XM一RIL及其遗传图谱，在海南和杭州两地试验，以柱头外露率(%)的考察指标，进行有关QTL联合分析。该性状明显表现出海南较高(21 .83%)而杭州较低(S .35%)的趋势。试验检测到1个主效应QTL(qSE6一1)，其LOD值高达28.16，对性状表型的贡献率为14.14%，增效等位基因来自于母本，加性效应为5.10%，不存在显着的GE互作。试验还检测到3对显着的加性x加性双基因互作，上位性互作性效应和贡献率相对较小，且与环境不存在显着的互作。 4、稻米透明度:用Z旅RIL及其遗传图谱，在海南和杭州两地试验，以精米透光率(%)作为考察稻米透明度指标，进行有关QTL联合分析。共检测到5个控制该性状的主效应QTL，分别位于第2、6(2个)、8、10染色体上，总的遗传贡献率19.15%。其中，qTRZ一2的增加透明度有效基因来源于母本;其余4个(qTR6一z、qTR6一2、qTRS一2、qTR10)则来自于父本。qTR6吐还与环境存在显着的GE互作效应。此外，还检测到2对控制稻米透明度的加性上位性互作基因，但它们均未与环境存在显着互作。 5、稻米延伸性:用XM--RIL及其遗传图谱，在海南和杭州两地试验，以延伸率(%)作为米粒延伸性考察指标，进行有关QTL联合分析。结果表明，该性状两地间的平均表现和群体分布特征较为相似，但两地间各系表型值相关系数却较小。试验检测到1个控制该性状的QTL基因qCRE6，其增效基因来自于父本，可提高3.99%的米粒延伸率，它不存在与环境间显着互作。还检测到2对上位性互作基因，即qcREZ与qCRES一1、qCRES一2与qCRE7间互作，前者与环境间存在有显着有GE互作，其作用使在杭州有增加米粒延性效果。 6、稻米淀粉粘滞性:用Z卜RIL及其遗传图谱，经海南和杭州两地试验，以精米粉的RVA谱中5个参数特征值PKV、HPV、CPV、BDV和SBV作为研究稻米淀粉粘滞性的指标，进行有关QTL联合分析。结果表现:1)在所检测到涉及5个性状的9个主效应QTL中，除PKV存在有第5染色体qPKVS外，其余8个QTL均位于第6染色体上;2)每个性状均检测到1个位于第6染色体RM197~RZ516区间的主效应QTL，并认为该基因即是Wx基因，表明所有性状均与Wx基因有关;3)检测到的与PKV、HPV、BDV、CPv等4个性状有关的wx基因均表现有GE互作，且方向一致，表现为在海南有增效作用。试验还检测到涉及5个性状的10对上位性互作效应，但均未检测到显着的上位性x环境互作效应。 7、耐辐射损伤:用ZM一RIL及其遗传图谱，经2个丫射线剂量(35OGy和55OGy)辐射处理，以处理后RIL群体的相对发芽率(%)和相对成苗率(%)作为考察该材料耐辐射损伤指标，进行QTL定位和上位性分析。结果表明，RIL群体受不同剂量照射后，表现出株系间耐辐射损伤的差异。以相对发芽率为指标，共检测到3个耐辐射主效应QTL，其中，qRR(g)8一1在350Gy处理时检测到，有效基因来自于父本，其遗传贡献率为6.53%;qRR(g)1一2和qRR(g)8一2则是在550Gy辐照时检测到，有效基因分别存在于母本和父本中，共可解释14.38%变异。以相对成苗率为指标，也检测到3个主效应QTL，它们是qRR(s)2一2(350Gy剂量)、qRR(s)5一6和qRR(s)10(550Gy剂量)，共解释19.65%变异。
参考文献：
[1]. 应用转基因技术提高稻谷耐贮藏特性的研究[D]. 何正权. 浙江大学. 2003
[2]. 水稻脂肪氧化酶RNA干扰载体的构建及转化水稻进行耐储藏的研究[D]. 李俊卿. 重庆大学. 2008
[3]. 通过RNA干扰技术沉默OsLOXs在贮藏期间提高水稻种子活力[D]. 白苏阳. 南京农业大学. 2015
[4]. 杂交水稻种子耐贮藏生理基础和蛋白质组学研究[D]. 高家东. 湖南农业大学. 2012
[5]. 施氮量对功能稻产量、品质与功能特性的影响[D]. 黎泉. 南京农业大学. 2013
[6]. 水稻脂氧合酶基因OsLOX1的克隆功能分析[D]. 汪仁. 南京农业大学. 2006
[7]. 水稻种胚脂氧合酶基因OsLOX2的克隆与功能分析[D]. 黄洁雪. 南京农业大学. 2011
[8]. 水稻种胚脂氧合酶-3和耐贮性关系的研究现状与策略[J]. 沈文飚, 郑天清, 翟虎渠, 万建民. 中国农业科学. 2002
[9]. 稻米的脂肪[J]. 于永红, 朱智伟, 程方民. 中国稻米. 2006
[10]. 水稻（Oryza sativa L.）若干重要性状的QTL主效应、上位性效应及GE互作效应分析[D]. 沈圣泉. 浙江大学. 2003
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