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抗PRRSV ISGs的鉴定及其抗PRRSV复制机制的研究

2020-12-02阅读(747)

抗PRRSV ISGs的鉴定及其抗PRRSV复制机制的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus,PRRSV）引起的一种接触性传染病。自1987年PRRS爆发以来,一直威胁着世界养猪业的发展,2006年爆发的高致病性蓝耳病（highly pathogenic PRRS,HP-PRRS）,对世界养猪业造成了巨大经济损失。近年来,随着疫苗的开发与使用,PRRS疫情得到了一定程度的控制,但是在免疫压力作用下,加速了PRRSV自身的变异与演化,亟需寻找和开发新的抗PRRSV药物。因此,本研究构建了多个表达干扰素刺激基因（ISGs）的真核表达载体,筛选鉴定出3个具有抗PRRSV作用的ISGs,分别为MOV10、TRIM25和cGAS。MOV10为RNA解旋酶超家族-1成员,是RNA诱导沉默复合体的组成成分之一,具有广泛的抗病毒作用。本研究构建了稳定表达猪源MOV10的MARC-145细胞系,通过病毒感染实验发现,稳定表达MOV10的MARC-145-MOV10细胞降低了PRRSV N蛋白的表达水平,同时MARC-145-MOV10细胞上清中的病毒滴度以及细胞中病毒RNA拷贝数明显低于野生型MARC-145,所以MOV10是一种具有抗PRRSV作用的ISG。初步研究表明,MOV10不影响PRRSV的吸附与进入过程。通过免疫共沉淀发现,MOV10与PRRSV的N蛋白之间存在相互作用,并且二者共定位于细胞质。进一步研究发现,MOV10通过与N蛋白结合阻碍了N蛋白的入核,进而影响PRRSV的复制,发挥抗PRRSV作用。TRIM25是一种E3泛素化连接酶,在天然免疫过程中发挥着重要作用。病毒感染细胞后,TRIM25调节宿主的多个抗病毒天然免疫过程,当病毒RNA被RIG-I识别后,RIG-I的2CARD与TRIM25的C端SPRY结构域结合,激活RIG-I使其发生泛素化,促进IFN-β的产生。在本研究中,过表达以及siRNA干扰实验表明TRIM25是一种抑制PRRSV复制的宿主限制性因子。免疫共沉淀结果显示,PRRSV N蛋白能够与TRIM25相结合,竞争性阻碍TRIM25与RIG-I之间的相互作用,从而抑制TRIM25介导的RIG-I泛素化,拮抗TRIM25的抗病毒作用。进一步研究发现,PRRSV感染以及N蛋白积累能够抑制TRIM25的表达以及IFN-β的产生,拮抗TRIM25的抗病毒作用。随着TRIM25表达量的升高,N蛋白对RIG-I泛素化的抑制作用减弱。本研究首次阐明了TRIM25是一种抗PRRSV的ISG,同时PRRSV N蛋白通过抑制TRIM25表达以及干扰TRIM25介导的RIG-I泛素化发挥拮抗TRIM25的抗病毒作用。cGAS作为细胞质中的一种DNA感受器,不仅在DNA病毒感染诱导的天然免疫过程中扮演着主要角色,而且在抗RNA病毒过程中也发挥着重要作用。本研究通过过表达cGAS以及构建缺失cGAS基因的MARC-145细胞系发现,cGAS能够明显抑制PRRSV在MARC-145细胞上的复制,并且过表达cGAS可以刺激IFN-β、ISG15以及OASL的表达。cGAMP刺激MARC-145细胞后感染病毒,能够抑制PRRSV复制。此外,过表达cGAS后感染病毒可以明显提高细胞内cGAMP活性。通过电镜和间接免疫荧光实验发现,PRRSV感染能够造成线粒体损伤,释放线粒体DNA到细胞质。进一步研究发现,释放到细胞质中的线粒体DNA与cGAS结合,从而激活宿主的天然免疫系统,活化cGAMP活性,发挥抗病毒作用。cGAS不仅能够抑制HP-PRRSV复制,而且对于欧洲型PRRSV以及经典PRRSV均有抑制作用。综上所述,本研究鉴定了3种具有抗PRRSV作用的ISGs,并阐明了这三种ISGs发挥抗PRRSV作用的机制。这不仅为开发防控PRRSV的药物提供了理论基础,也进一步解析了宿主拮抗PRRSV复制的新机制。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  •   1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述
  •   1.2 PRRS的病原学
  •     1.2.1 PRRSV的分类及理化特性
  •     1.2.2 PRRSV的基因组成及特性
  •     1.2.3 PRRSV基因组的翻译和复制
  •     1.2.4 PRRSV蛋白结构与功能
  •   1.3 宿主蛋白与PRRSV蛋白相互作用的研究
  •   1.4 干扰素刺激基因（ISG）及其研究方法
  •     1.4.1 干扰素刺激基因（ISG）
  •     1.4.2 ISG筛选方法
  •     1.4.3 抗病毒ISG鉴定方法
  •   1.5 抗病毒ISGs的研究进展
  •     1.5.1 胆固醇25 羟化酶（CH25H）和25 羟基胆固醇（25HC）
  •     1.5.2 2 ’,5’寡腺苷酸合成酶（OAS）
  •     1.5.3 ISG15
  •     1.5.4 MOV10 研究进展
  •     1.5.5 TRIM25 研究进展
  •     1.5.6 cGAS研究进展
  •   1.6 研究目的与意义
  • 第二章 抗PRRSV ISGs的筛选与鉴定
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 病毒与细胞
  •     2.1.2 质粒、菌种及主要试剂
  •     2.1.3 主要设备仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 猪源ISGs基因的获取
  •     2.2.2 真核表达载体的构建
  •     2.2.3 初步筛选抗PRRSV的 ISGs
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 带有ISGs真核表达载体的构建
  •     2.3.2 抗PRRSV ISGs的筛选
  •   2.4 讨论
  • 第三章 MOV10 抑制PRRSV复制机制的研究
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 病毒与细胞
  •     3.1.2 质粒与菌种
  •     3.1.3 抗体与试剂
  •     3.1.4 主要设备仪器
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 稳定表达猪源MOV10 MARC-145 细胞系的构建
  •     3.2.2 制备含有MOV10 基因的慢病毒颗粒
  •     3.2.3 表达MOV10 基因的MARC-145 细胞系的制备
  •     3.2.4 稳定表达MOV10 MARC-145 细胞系的鉴定
  •     3.2.5 MOV10 抑制PRRSV复制的研究
  •     3.2.6 MOV10 对病毒吸附和进入的影响
  •     3.2.7 MOV10与N蛋白互作的研究
  •     3.2.8 激光共聚焦实验
  •     3.2.9 MOV10 影响N蛋白在细胞中的定位
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 pLO-CMV-MOV10 的构建
  •     3.3.2 MARC-145-MOV10 的筛选鉴定
  •     3.3.3 MOV10 抑制PRRSV复制
  •     3.3.4 MOV10 不影响PRRSV对细胞的吸附和进入
  •     3.3.5 体外真核表达N蛋白与MOV10 相互作用
  •     3.3.6 PRRSV N蛋白与宿主MOV10 相互作用
  •     3.3.7 MOV10与N蛋白共定位于细胞质
  •     3.3.8 MOV10 影响N蛋白的细胞定位
  •     3.3.9 MARC-145-MOV10对PRRSV N蛋白细胞定位的影响
  •   3.4 讨论
  • 第四章 TRIM25 抑制PRRSV复制及PRRSV拮抗TRIM25 抗病毒作用机制的研究
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 病毒与细胞
  •     4.1.2 质粒与菌种
  •     4.1.3 抗体与试剂
  •     4.1.4 主要设备仪器
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 TRIM25 及RIG-I真核表达载体的构建
  •     4.2.2 过表达TRIM25 对PRRSV复制的影响
  •     4.2.3 干扰TRIM25 对PRRSV复制的影响
  •     4.2.4 PRRSV感染对TRIM25 表达的影响
  •     4.2.5 N蛋白积累对TRIM25 表达的影响
  •     4.2.6 TRIM25 与N蛋白互作验证
  •     4.2.7 TRIM25 与RIG-I互作验证
  •     4.2.8 N蛋白对TRIM25 与RIG-I互作的影响
  •     4.2.9 TRIM25 以及N蛋白对RIG-I泛素化的影响
  •     4.2.10 双荧光素酶报告实验
  •   4.3 实验结果
  •     4.3.1 过表达TRIM25 抑制PRRSV复制
  •     4.3.2 沉默TRIM25 促进PRRSV复制
  •     4.3.3 PRRSV感染与N蛋白积累抑制TRIM25 表达
  •     4.3.4 TRIM25 与N蛋白互作
  •     4.3.5 TRIM25 与RIG-I互作
  •     4.3.6 N蛋白影响TRIM25 与RIG-I互作
  •     4.3.7 N蛋白抑制RIG-I泛素化
  •     4.3.8 N蛋白抑制IFN-β 启动子活性
  •     4.3.9 TRIM25 拮抗N蛋白对RIG-I信号通路的抑制
  •   4.4 讨论
  • 第五章 cGAS抑制PRRSV复制机制的研究
  •   5.1 实验材料
  •     5.1.1 病毒与细胞
  •     5.1.2 抗体与试剂
  •     5.1.3 主要设备仪器
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 p3XFLAG-cGAS载体的构建
  •     5.2.2 过表达p3XFLAG-cGAS对PRRSV复制的影响
  •     5.2.3 过表达cGAS对IFN-β 产生的影响
  •     5.2.5 cGAS对ISGs产生的影响
  •     5.2.6 缺失cGAS基因MARC-145 细胞系的构建
  •     5.2.7 缺失cGAS对PRRSV复制的影响
  •     5.2.8 缺失cGAS对IFN-β 以及ISGs产生的影响
  •     5.2.9 线粒体损伤鉴定
  •     5.2.10 cGAMP对PRRSV复制的影响
  •     5.2.11 cGAMP活性的检测
  •     5.2.12 细胞质线粒体DNA的检测
  •     5.2.13 cGAS与ds DNA共定位
  •     5.2.14 过表达cGAS对不同PRRSV株复制的影响
  •   5.3 实验结果
  •     5.3.0 过表达cGAS抑制PRRSV复制
  •     5.3.1 过表达cGAS促进IFN-β 以及ISGs的表达
  •     5.3.2 缺失cGAS促进PRRSV复制
  •     5.3.3 缺失cGAS不影响IFN-β 以及ISGs
  •     5.3.4 cGAMP抑制PRRSV复制
  •     5.3.5 cGAMP活性
  •     5.3.6 PRRSV感染损伤线粒体
  •     5.3.7 PRRSV感染促进线粒体DNA释放到细胞质
  •     5.3.8 cGAS与线粒体DNA共定位
  •     5.3.9 cGAS抑制不同基因型的PRRSV复制
  •   5.4 讨论
  • 第六章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 赵款

    导师: 童光志

    关键词: 猪繁殖与呼吸综合征

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: S852.651

    总页数: 96

    文件大小: 9756K

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