论文摘要
布鲁氏菌的致病能力取决于其在宿主细胞内的存活和繁殖能力,铁离子摄取系统是布鲁氏菌致病能力的关键毒力因子之一,其在布鲁氏菌致病过程中为布鲁氏菌提供着一套精准的铁应答调控通路。铁转录调控因子已在根瘤菌（与布鲁氏菌同属α-变形菌）中被报道,其在根瘤菌铁代谢调控过程中发挥着关键作用。已有文献报道Irr和RirA基因在布鲁氏菌的致病能力以及胞内生存过程中发挥着重要作用。因此,研究布鲁氏菌Irr和RirA基因的功能将为揭示布鲁氏菌致病机制提供新的线索和思路。目的:为了揭示羊种布鲁氏菌M5-90铁转录调控因子irr和rirA的功能,构建羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株的铁应答调控因子irr和rirA基因缺失株M5-90-△irr和△rirA,探究铁应答调控因子irr和rirA基因在细菌体外繁殖过程中的作用,探讨铁应答调控因子irr和rirA基因对布鲁氏菌胞内寄生的影响。方法:以羊种布鲁氏菌M5-90转录调控因子irr和rirA为研究对象,以羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90基因组为模板,分别扩增irr和rirA基因的3’端、5’端同源片段,以pUC19K质粒为模板扩增卡那霉素抗性基因片段。利用Overlap PCR技术分别将卡那霉素抗性基因与目的基因上5’端同源片段进行融合扩增,将融合产物进行胶回收,胶回收产物连接至pMD19-T载体。将连接产物电转化到羊种布鲁氏菌M5-90感受态细胞中,经卡那抗性筛选阳性克隆,将阳性克隆连续传代并通过PCR检测其遗传稳定性;将亲本株及其缺失株分别在相同起始浓度和相同营养条件下震荡培养,测定并观察其振荡培养过程中的生长变化趋势;利用抑菌圈法检测各菌株对不同抗生素的耐药性;在相同起始浓度下检测各菌株暴露于强酸、强碱、高盐、热休克、氧化应激等环境后的生存率变化;将各菌株以MOI:200:1感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,定点收集被感染细胞并将其裂解,将裂解液稀释至合适的浓度后均匀涂布于布鲁氏菌固体培养板,计算培养板表面的菌落数,分析各菌株对细胞的黏附侵袭能力和胞内生存能力变化。结果:成功扩增出irr和rirA基因上5’端同源片段及卡那基因片段,成功地将卡那霉素抗性基因片段与目的基因上下同源片段进行了融合;将重组质粒电转化至布鲁氏菌细胞后相继成功获得了布鲁氏菌irr和rirA基因缺失株M5-90-Δirr和M5-90-ΔrirA,经连续传代20代内未发生缺失回复现象;与亲本株相比,缺失株M5-90Δirr和ΔrirA在体外同等繁殖环境中的生长趋势没有明显的变化,但缺失株浓度总体上低于亲本株;抗生素耐药性试验显示irr和rirA基因缺失后对相应抗生素的耐药性有所降低,但对新霉素的敏感性消失;相比于亲本株M5-90,缺失株M5-90-Δirr和M5-90-ΔrirA在强酸、强碱、高盐、热休克环境中的生存率显著下降,但在氧化环境中的生存率显著升高;黏附侵袭试验显示,在感染15min、45min和60min时,缺失株M5-90Δirr和ΔrirA对小鼠巨噬细胞RAW264.7的黏附侵袭能力显著弱于亲本株;胞内生存研究发现,与亲本株相比,缺失株M5-90Δirr、ΔrirA在RAW264.7细胞内的存活能力均有所降低,在感染24 h后缺失株M5-90Δirr、ΔrirA在细胞内的存活能力逐渐呈上升趋势,而此时亲本株已基本全部被小鼠巨噬细胞RAW264.7清除。结论:成功构建出可稳定遗传的羊种布鲁氏菌M5-90-Δirr和ΔrirA基因缺失株,铁应答调控因子irr和rirA基因影响了羊种布鲁氏菌M5-90的体外繁殖过程,调控着羊种布鲁氏菌M5-90在宿主细胞内的寄生能力,为揭示目的基因的功能奠定了基础,为揭示布鲁氏菌致病机制提供了新的线索和思路。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 王奔奔
导师: 陈创夫,王远志
关键词: 布鲁氏菌,巨噬细胞,基因,电转化,同源重组
来源: 石河子大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 石河子大学
基金: 国家自然科学基金:Irr和RirA基因对布鲁氏菌铁离子代谢的分子调控机制研究,编号:3176010491
分类号: S852.614
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