导读:本文包含了胞外蛋白酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白酶,细菌,活性,复性,飞蝗,菌株,特性。
胞外蛋白酶论文文献综述
[1]（2019）在《中国研究哈尔滨风干香肠中戊糖片球菌胞外蛋白酶的生化特性》一文中研究指出在发酵肉制品中,乳酸菌是最常用的发酵剂,用于控制发酵过程、提升肉制品风味和质构,发酵肉制品品质也与乳酸菌的酶活性密切相关。在传统发酵香肠中,清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的作用较为突出。乳酸菌生长产生的乳酸能够降低发酵系统的p H值,产生的细菌素也能够抑制其(本文来源于《肉类研究》期刊2019年09期）
唐白露[2]（2019）在《深海沉积物细菌胞外蛋白酶Pseudoalterin的诱导表达与分泌、催化特性、生态功能及其分子机制》一文中研究指出深海环境蕴含着数量巨大、种类丰富的微生物资源。微生物是深海生态系统的最主要成员,深海微生物之间存在着复杂的相互作用。但目前对深海微生物之间的相互作用类型及机制还了解很少。深海有机质大多是高分子量的颗粒有机质(particulate organic matter,POM),因此,深海微生物通过分泌胞外酶对胞外大分子的有机物进行降解并利用,是一种生存和适应环境的方式。来自细菌细胞壁的肽聚糖和来自动物的胶原蛋白是深海颗粒POM的重要成分,它们在深海中被微生物通过分泌蛋白酶降解和利用,进入深海碳氮循环。但目前我们对参与深海肽聚糖和胶原蛋白等有机质降解的微生物及其酶类的种类及降解机制还了解有限。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)是一类广泛分布于海洋环境中的异养细菌。Pseudoalteromonas sp.CF6-2是一株分离自南中国海深海沉积物的产蛋白酶细菌。前期研究表明,该菌分泌的适冷蛋白酶Pseudoalterin是一个M23家族金属蛋白酶,能够降解弹性蛋白和革兰氏阳性菌肽聚糖。在此基础上,本论文首先建立了菌株CF6-2的遗传操作体系和蛋白酶Pseudoalterin的适冷表达体系,然后对蛋白酶Pseudoalterin的诱导表达机制、成熟机制、分泌机制和催化机制进行了研究,揭示了菌株CF6-2利用Pseudoalterin捕食海洋革兰氏阳性细菌的生态学现象,建立了利用CF6-2发酵生产Pseudoalterin的小试和中试工艺。另外,本论文还研究了来自胶州湾沉积物的细菌Photobacterium sp.A5-7分泌的一个新的S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质及其PA结构域的功能。论文取得了如下研究结果:1.在基因组层面上分析海洋细菌胞外蛋白酶多样性为了在基因组层面分析海洋中产蛋白酶细菌的胞外蛋白酶的种类多样性,我们对两株海洋产蛋白酶细菌一深海沉积物细菌P.sp.CF6-2和北极表层海水细菌Flavobacterium arcticum SM1 502T的全基因组进行了测序,在基因组层面上揭示了这两株菌的胞外蛋白酶及其它胞外酶种类多样性。菌株CF6-2的基因组编码50种具有信号肽的肽酶,包括28个丝氨酸肽酶和22个金属肽酶。这些酶分布于9个丝氨酸肽酶家族和15个金属肽酶家族。菌株SM1502T的基因组编码29个具有信号肽的肽酶,包括14个丝氨酸肽酶、11个金属肽酶和4个半胱氨酸肽酶。这些酶分布于7个丝氨酸肽酶家族、5个金属肽酶家族和4个半胱氨酸肽酶家族。这些结果表明,这两株菌都含有大量的胞外蛋白酶基因,可能在海洋沉积物有机氮降解和循环中发挥重要作用。2.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表达的诱导机制海洋细菌胞外蛋白酶大多是受胞外物质诱导表达的,但诱导细菌胞外蛋白酶产生的确切信号分子至今尚未被鉴定出。本文对诱导细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表达的信号分子进行了鉴定。由于蛋白酶Pseudoalterin能够高效地降解革兰氏阳性细菌肽聚糖的肽链部分,因此,我们的科学假设是:肽聚糖中的某些组分可能对Pseudoalterin具有诱导作用。为此,我们尝试从肽聚糖肽链组分中鉴定Pseudoalterin表达的诱导信号分子。首先检测了海洋典型革兰氏阳性菌Staphylococcus warneri MCCC0423的肽聚糖在转录水平上对Pseudoalterin的诱导作用。然后根据MCCC0423肽聚糖肽链的序列合成19种小肽,检测这19种寡肽及其中所含单个氨基酸对Pseudoalterin转录的诱导作用。实验结果表明含Gly寡肽及Gly对Pseudoalterin有诱导作用,为CF6-2表达Pseudoalterin的诱导信号分子。Gly的有效诱导浓度在0.25 mM-20 mM。这是首次揭示了微生物胞外蛋白酶的确切诱导信号分子并确定了其有效诱导浓度。另外,我们还确定了 Pseudoalterin的转录起始位点,为进一步阐明细菌CF6-2对Pseudoalterin合成的胞内调控机制奠定了基础。3.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin的成熟和分泌机制前期研究表明,M23家族蛋白酶Pseudoalterin没有自成熟的能力,需要其他蛋白帮助其切割前导肽。但哪些蛋白辅助Pseudoalterin成熟还不清楚。为了鉴定Pseudoalterin成熟的辅助蛋白和阐明其成熟机制,我们首先建立了菌株CF6-2的遗传操作体系,然后通过分析其他M23家族蛋白酶的成熟过程找出可能在Pseudoalterin成熟过程中起作用的辅助蛋白。利用菌株CF6-2的遗传操作体系对这些辅助蛋白进行基因敲除,然后分析突变对胞外Pseudoalterin的影响,从而确定了叁个对Pseudoalterin成熟有辅助作用的蛋白酶,Lysyl、Serine1和Serine5。信号肽预测结果表明这叁个蛋白酶可能位于周质空间。通过Western blot检测发现,全细胞上清中存在Pseudoalterin的成熟形式,因此推测Pseudoalterin前导肽的切割发生在周质空间。通过分析菌株CF6-2的基因组,发现其具有完整的II型分泌系统(Type II secretion system,T2SS)。我们推测CF6-2可能通过T2SS分泌Pseudoalterin。我们将T2SS中的关键基因gspE缺失突变后,CF6-2的发酵液几乎检测不到Pseudoalterin,回补缺失基因后,Pseudoalterin的分泌得到了恢复。因此可以确定Pseudoalterin是通过T2SS分泌到胞外的。4.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin结合和催化降解肽聚糖的机制前期研究表明,菌株CF6-2分泌的蛋白酶Pseudoalterin有两个功能结构域,含Zn离子的催化结构域能水解肽聚糖的肽链,另一个与催化结构域呈T字形紧密排列的C端结合结构域能结合肽聚糖糖链。Pseudoalterin能够降解革兰氏阳性细菌肽聚糖,但其结合和催化肽聚糖降解的分子机制尚未揭示。为了研究Pseudoalterin结合和催化肽聚糖降解的分子机制,我们通过分子对接的方法,将肽聚糖肽尾AeKaA和肽桥AGGGGG与Pseudoalterin催化腔进行分子共模拟,并结合同源序列分析,预测了 Pseudoalterin参与催化肽聚糖降解的关键氨基酸残基。然后,我们构建了 Pseudoalterin的在海洋适冷细菌中的适冷表达体系,并利用该体系对关键氨基酸残基进行了突变表达和纯化,并构建及纯化了C端结合结构域缺失突变体。通过测定Pseudoalterin突变体对肽聚糖的降解活性和吸附能力的变化,阐明了 Pseudoalterin结合和催化降解肽聚糖的机制。这是首次揭示了一个深海细菌蛋白酶对细菌肽聚糖降解的分子机制。5.深海细菌CF6-2及其胞外蛋白酶Pseudoalterin的生态功能细菌分泌的M23家族蛋白酶可以裂解细菌细胞壁肽聚糖,从而可为细菌获取食物并进行防御和竞争提供优势。为了阐明菌株CF6-2与海洋革兰氏阳性细菌之间的相互作用,我们通过平板实验对菌株CF6-2与海洋革兰氏阳性细菌进行了共培养,发现菌株CF6-2能够裂解多种海洋革兰氏阳性细菌并利用裂解细菌产生的营养物质进行生长,表明菌株CF6-2可能具有捕食海洋革兰氏阳性细菌的能力。然后,以 Staphylococcus warneri MCCC1A00423为对象,研究了P.sp.CF6-2通过分泌蛋白酶Pseudoalterin对革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖进行降解,导致细菌裂解和死亡,从而从中获取营养进行生长和繁殖的机制。根据研究结果提出了海洋革兰氏阴性菌CF6-2捕食海洋革兰氏阳性菌的模型。通过生物信息学分析,我们发现多株来源于海洋的细菌(大多数为革兰氏阴性菌)含有蛋白酶Pseudoalterin的同源序列,因此推测我们揭示的革兰氏阴性菌通过胞外蛋白酶捕食革兰氏阳性细菌的现象在海洋生态环境中可能具有普遍性,这是一种新的存在于海洋细菌之间的相互作用关系。6.深海细菌CF6-2产胞外蛋白酶Pseudoalterin的小试和中试发酵M23家族蛋白酶能够降解肽聚糖和弹性蛋白,因此在生物医学和生物技术上具有一定的应用潜能。为了降低发酵成本并同时提高Pseudoalterin的产量,在前期优化的基础上,我们通过单因子实验对发酵培养基的成分和发酵培养条件进行了进一步优化。以0.5%的蔗糖为碳源,将牛心管粉的用量从1.2%减少到0.6%,将Pseudoalterin的产量提高了 161%(161.2± 3.1 U/mL)。在发酵培养基优化的基础上,对小试5 L发酵罐和中试50 L发酵罐发酵CF6-2生产Pseudoalterin的通气量和搅拌速度进行了优化,建立了深海细菌CF6-2产胞外蛋白酶Pseudoalterin的小试和中试发酵工艺。小试和中试中Pseudoalterin的产量分别达到155.6±10.5 U/mL和103.5±8.6 U/mL。研究结果为Pseudoalterin的工业化生产和其在生物医学和生物技术上的应用奠定了坚实的基础。7.新型S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质和PA结构域的功能在系统开展海洋细菌蛋白酶Pseudoalterin研究的基础上,本论文对海洋细菌分泌的另外新型S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质和PA结构域的功能进行了研究。Photobacterium sp.A5-7是一株分离自胶州湾沉积物的产蛋白酶细菌。本文对Photobacterium sp.A5-7分泌的一个蛋白酶P57进行了纯化和表征。P57是一个新的S8家族枯草杆菌素类蛋白酶,能水解酪蛋白、明胶和胶原蛋白。成熟的P57具有一个催化结构域和一个PA结构域。对异源表达融合蛋白PA-EGFP的分析表明,PA结构域对胶原具有吸附能力。通过Fe3+抑制P57的酶活,检测到了 P57与胶原的结合。通过定点突变分析,发现Phe349和Tyr432是P57结合胶原的关键氨基酸残基。这些结果表明P57能通过PA结构域结合胶原底物。该部分实验结果首次提供了枯草杆菌素类蛋白酶的PA结构域能结合不溶性底物的直接证据,对更好地了解来自海洋沉积物中细菌胞外蛋白酶和枯草杆菌素蛋白酶PA结构域的功能具有重要意义。综上所述,本论文对深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin在海洋肽聚糖降解和海洋生物竞争的生态学功能方面进行了较为深入的研究,同时研究了Pseudoalterin的诱导、成熟、分泌和催化机制,这些研究有助于我们更好地了解细菌及其胞外蛋白酶在深海物质循环和微生物相互关系中的作用。能够降解肽聚糖的蛋白酶Pseudoalterin在生物医学和生物技术上具有很好的应用价值,因此对本文建立的其进行的生产Pseudoalterin的中试发酵工艺为其大规模工业化生产奠定了坚实的基础。另一方面,在研究胞外蛋白酶Pseudoalterin的同时此外,我们本文建立了菌株CF6-2的遗传操作体系和适冷蛋白酶的适冷表达体系,这对研究深海细菌其它适冷菌和适冷蛋白具有重要意义。本文对蛋白酶P57的酶学性质及PA结构域的研究,对更好地了解来自海洋沉积物中细菌胞外蛋白酶和枯草杆菌素蛋白酶PA结构域的功能以及阐明海洋沉积物中颗粒有机氮降解具有重要意义。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-25）
王忠星,党光辉,刘虹秀,臧鑫鑫,崔莹莹[3]（2019）在《副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究》一文中研究指出为研究副结核分枝杆菌(MAP) 1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2019年05期）
郭隆隆[4]（2019）在《绿僵菌胞外蛋白酶对寄主免疫影响》一文中研究指出绿僵菌在各种农业害虫的生物防治方面发挥着非常重要的作用,并具有良好的发展前景。目前的研究主要集中于绿僵菌体表侵染,对于消化道侵染的研究相对较少。胞外蛋白酶作为重要的毒力因子,在绿僵菌侵染过程中发挥着重要的作用。前期研究发现,单独饲喂绿僵菌后,飞蝗中肠微绒毛结构脱落,而饲喂含有绿僵菌和TPCK的饵剂后,中肠表皮微绒毛结构完整。本文为了验证胞外蛋白酶在飞蝗中肠中的破坏作用,揭示胞外蛋白酶对飞蝗中肠免疫反应的影响,克隆表达了绿僵菌胞外蛋白酶Pr1C、Pr1J,通过饵剂饲喂的方式验证了它们对飞蝗中肠免疫反应的影响,为进一步揭示绿僵菌的作用机制提供了理论依据。主要研究结果如下:1.绿僵菌胞外蛋白酶作用分析绿僵菌及胞外蛋白酶抑制剂处理飞蝗后,对飞蝗中肠样本进行转录组测序分析。差异基因分析结果显示,以P<0.05为标准筛选差异基因并对其分析发现,IPPM202和IPPM202+TPCK之间筛选到70个差异基因,有22个基因的表达上调,48个基因下调,上调的差异基因主要与昆虫的生长发育相关,下调的基因富集到PI3K/Akt信号途径,该途径与昆虫先天性免疫反应途径密切相关,表现为飞蝗免疫反应的抑制,从而推断胞外蛋白酶在飞蝗中肠免疫反应中起关键作用。2.胞外蛋白酶基因的克隆表达及对飞蝗生物活性测定从绿僵菌转录组中筛选得到了两种胞外蛋白酶基因Pr1J和Pr1C,对两种胞外蛋白酶基因序列分析结果显示,该基因序列全长分别为1215bp和2124 bp,分别编码含有405个氨基酸和707个氨基酸的蛋白序列,且与类枯草杆菌蛋白酶具有很高的同源性,分别达到99%和97%,对两个基因的相似性分析发现,二者均含有肽酶S8(Peptidase_S8)结构域。通过分离克隆和原核表达获得了两种胞外蛋白酶,饵剂饲喂试验发现两种胞外蛋白酶均能增强绿僵菌毒力,导致飞蝗存活率降低。3.胞外蛋白酶对飞蝗免疫的影响。饲喂含有胞外蛋白酶和绿僵菌的饵剂后,测定了飞蝗中肠保护酶、解毒酶类、以及免疫相关基因表达量的变化。结果发现,绿僵菌胞外蛋白酶Pr1J或Pr1C与绿僵菌混用都能够使飞蝗保护酶及解毒酶活性显着升高;然而,随着处理时间的延长,酶活性逐渐降低。绿僵菌胞外蛋白酶Pr1J、Pr1C与绿僵菌混用后,飞蝗中肠免疫Toll和Imd途径关键基因表达量均呈上升趋势;其中第2、4天,Pr1J、Pr1C与绿僵菌混用处理飞蝗中肠免疫基因表达量明显高于其他处理;第6天,Pr1J、Pr1C与绿僵菌混用飞蝗中肠基因表达量则明显低于绿僵菌单独处理。因此,胞外蛋白酶Pr1J、Pr1C能够诱导蝗虫增加对绿僵菌的免疫力,但随着时间的延长免疫力逐渐降低。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-04-01）
令利军,焦正龙,王军英,马稳霞,李子彬[5]（2019）在《地衣芽孢杆菌TG116胞外蛋白酶产酶条件与酶学性质》一文中研究指出【背景】从独角莲中分离得到的地衣芽孢杆菌TG116是一株对植物病原菌具有广谱抗性作用的生防菌株。【目的】优化TG116的产酶条件并探索其酶学性质,进一步了解其抗菌机制。【方法】采用Folin-Phenol显色法与响应曲面法,优化菌株TG116的产酶条件并研究其蛋白酶的酶学性质。【结果】菌株TG116产酶最适条件为:温度40.83°C,p H 8.01,发酵时间53.74 h,增加通气量可以显着提高酶活力。按照优化后的条件培养48 h后,上清液蛋白酶活力从57.46 U/mL达到了254.07 U/mL。酶学性质研究表明:该酶为碱性蛋白酶,最适反应pH为8.5,最适反应温度为50°C,具有良好的温度和pH稳定性,EDTA对酶活具有强烈的抑制作用,金属离子Mg~(2+)、Ca~(2+)、Na~+、Co~(2+)、K~+等对酶活也具有一定的抑制作用。【结论】菌株TG116具有良好的p H与温度稳定性,在实际应用中蛋白酶不易失活,可以分解真菌的细胞壁蛋白成分,破坏细胞壁结构,从而抑制甚至杀死病原菌,达到抗菌作用。(本文来源于《微生物学通报》期刊2019年10期）
文狄,陈志,丁淑金,褚丹维,袁方倩[6]（2018）在《水中产胞外蛋白酶细菌的筛选及其酶学性质》一文中研究指出为蛋白酶制剂的工业化生产提供新的候选菌株及进一步研发奠定理论基础,从都匀市附近不同水域的20个样品中,采用酪蛋白平板透明圈法筛选产胞外蛋白酶菌株,采用形态学观察结合16SrDNA序列比对酶活性较高的菌株进行鉴定,福林酚法测定其粗蛋白酶液的最佳酶活条件。结果表明:共分离纯化到可形成透明圈的产胞外蛋白酶菌株1 000余株,其中透明圈/菌落直径比(HC)均≥6.0,即蛋白酶活性均较高的菌株5株(S1~S5);经形态学观察结合16SrDNA序列的比对分析鉴定,S1和S3为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),S2为粉虱肠杆菌(Enterobacter tabaci),S4为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),S5为福氏志贺氏菌(Shigella flexneri);粗蛋白酶液最佳酶活的最适温度,S1为50℃,S2、S3和S5为45℃,S4为40℃;最适pH,S2和S4为7.0,S3和S5为7.5,S1为8.0;最适温度和pH条件下S3酶活最高,达44.32U/mL,比市售产蛋白酶地衣芽孢杆菌酶活(37.26U/mL)高18.95%。(本文来源于《贵州农业科学》期刊2018年10期）
侯靖,徐佳琪,崔恒林[7]（2018）在《嗜盐古菌Halorussus sp.XZYJ18产胞外蛋白酶特点及其酶学性质》一文中研究指出通过脱脂牛奶平板从分离自我国西藏芒康盐井古盐田的133株嗜盐古菌中筛选获得11株产胞外蛋白酶菌株,其中XZYJ18产蛋白酶能力最强。16SrRNA基因序列分析表明XZYJ18为Halorussus属的新种。XZYJ18在对数生长后期开始大量合成胞外蛋白酶,营养丰富的培养基抑制胞外蛋白酶合成。XZYJ18胞外蛋白酶在55℃,pH 8.0和0mol/L NaCl的条件下酶活最高,在酸性、碱性、低盐或高盐条件下均具有良好的稳定性,因而能够在不同的环境中催化蛋白质水解。(本文来源于《中国调味品》期刊2018年09期）
李杨[8]（2018）在《大连盐场与茶卡盐湖嗜盐古菌多样性及胞外蛋白酶研究》一文中研究指出虽然我国拥有着数量众多且各具特色的内陆盐湖和海洋盐田,但是仍有许多盐环境中的嗜盐古菌未被系统的研究。相比对嗜盐古菌物种的研究和认识,对嗜盐古菌胞外蛋白酶的研究和了解更为空缺,于是开展以下研究工作:(1)对大连营城子盐场与茶卡天然盐碱湖进行了可培养嗜盐古菌多样性的研究,获得了丰富的嗜盐古菌菌种资源。从大连营城子盐场中分离到的126株嗜盐古菌分属于16个属的39个分类单元。值得提出的是,在可能为新物种的菌株中,DL47与DL50比较特殊,两菌为同一物种的两株,它们都存在序列差异性大于9%的16S rRNA多拷贝基因,且极性脂成分中都缺少磷脂酰甘油,将它们建立为一个新的属级分类单元。茶卡天然盐碱湖中共分离得到148株菌分属于8个属的27个分类单元。菌株C46鉴定为Halobaculum属的一个新种。(2)以来自多种盐环境的产胞外蛋白酶的菌株及其胞外粗酶液为研究对象,从菌株的种属多样性、胞外蛋白酶水解底物特异性和催化类型等角度揭示胞外蛋白酶多样性,发现嗜盐古菌胞外蛋白酶的多样性较高。筛选到一株酶活高的嗜盐古菌DL61,克隆出一条由526个氨基酸组成的胞外蛋白酶C450_13147基因。通过构建C450_13147的嗜盐古菌异源表达体系证明了它是有活性的胞外蛋白酶,构建大肠杆菌异源表达体系初步探讨了C450_13147的成熟机制和提高复性速率的方法,为后续嗜盐古菌胞外蛋白酶的理论和应用研究提供帮助。(3)将构建的嗜盐古菌异源表达C450_13147的Haloferax volcanii H1424作为出发菌株进行为期30 d的鱼露发酵。多项鱼露发酵指标显示,C450_13147在高盐食品发酵中的酶解优势明显,该研究为嗜盐古菌胞外蛋白酶的的实际应用奠定理论基础。(本文来源于《江苏大学》期刊2018-06-01）
周瑶[9]（2018）在《新疆地区盐碱环境嗜盐古菌多样性与产胞外蛋白酶研究》一文中研究指出嗜盐古菌生长在高盐环境中,通常需要15%-30%的NaCl来维持最适生长条件。环境中的一些嗜盐古菌类群可以分泌蛋白酶降解环境中的蛋白质,形成小分子的肽和氨基酸用于自身的新陈代谢。目前国内嗜盐古菌资源研究主要集中在西部地区广泛存在的天然盐湖、盐碱湖中嗜盐古菌的调查,对盐碱地环境中嗜盐古菌多样性调查研究甚少。塔里木盆地位于我国新疆地区,是我国面积最大的内陆盆地,土壤极度盐碱化,这种盐环境必定蕴藏着丰富的嗜盐古菌资源。因此,本研究从新疆塔里木盆地盐碱地采集土样,分离纯化嗜盐古菌,阐明可培养嗜盐古菌多样性,鉴定潜在的新类群;筛选产胞外蛋白酶的菌株,进行胞外蛋白酶编码基因研究,揭示胞外蛋白酶结构域的功能。用NOM培养基从新疆塔里木盆地盐碱地样品中共获得68株嗜盐古菌。基于16S rRNA基因序列分析与系统发育分析结果显示:新疆塔里木盆地盐碱环境中的68株嗜盐古菌分属于20个属的28个种。多相分类学研究结果表明,来自新疆塔里木盆地盐碱地的四个菌株代表四个新的分类单元,分别命名为:Halobaculum rubrum NJ-3-1~T、Halogranum salinum SQT-7-1~T、Natrinema rubrum SQT-13-1~T和Halovivax salinus SQT-29-1~T。从前期分离的68株嗜盐古菌中,筛选到10株产胞外蛋白酶菌株,分属于3个属的5个种,其中Halococcus salifodinae EEST14产胞外蛋白酶水平较高,用于后续胞外蛋白酶编码基因的研究。结果表明:C450_13147为Halococcus salifodinae EEST14的胞外蛋白酶,活性位点定点突变实验确证C450_13147是丝氨酸蛋白酶,含有信号肽、原肽、催化结构域和CTE四个结构域。CTE在相似的胞外蛋白酶之间可以实现功能互换。截短实验结果表明:CTE截短会使胞外蛋白酶的活性大大降低。C450_13147中存在的叁个半胱氨酸,对于酶活具有重要的作用。(本文来源于《江苏大学》期刊2018-06-01）
钱远超[10]（2018）在《里氏木霉胞外蛋白酶的表达调控及纤维素酶的酶系改良》一文中研究指出植物生物质资源是地球上分布最广和储量最大的可再生资源。生物炼制能够将植物生物质转化为化学燃料等高附加值化学品,从而降低人类对化石能源的依赖。生物质炼制过程中,木质纤维素酶催化生物质生成可发酵糖是决定生物基化学品成本的关键因素,也是制约生物乙醇工业化和规模化的瓶颈。丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是目前木质纤维素降解酶工业生产主要的菌株。由于其具有强大的蛋白分泌能力,也常作为异源蛋白表达的宿主菌株。虽然里氏木霉纤维素酶分泌水平能够超过40 g/L,但高水平产酶条件下发酵后期纤维素酶的活力会显着降低,这是困扰酶制剂生产的共性问题,其原因可能与胞外蛋白酶的降解作用有关。另一方面,蛋白酶的存在能够给菌株的生长和蛋白质的合成提供大量氮源。因此,两种需求之间的矛盾促使我们对里氏木霉胞外蛋白酶和氮源利用展开研究。目前,该领域的研究在曲霉属和脉孢菌属中比较深入,但里氏木霉胞外蛋白酶与氮源利用的表达调控及其对纤维素酶生产的影响的研究还比较少。因此针对这些问题,我们本论文开展了以下的研究:一、利用蛋白质组技术分离鉴定了 12个里氏木霉蛋白酶,并对其进行敲除和功能分析。里氏木霉在进行纤维素酶生产时,发酵后期,纤维素酶活力往往出现明显下降,这可能与胞外蛋白酶的降解作用有关。通过比较分析3d和7 d的发酵液的蛋白质组成,我们共鉴定并基因敲除了 12个蛋白酶。除蛋白ID为123244的蛋白酶敲除菌株不能够正常生孢,随后被鉴定为胞内蛋白酶外,其余的11个蛋白酶基因的敲除基本不影响菌株对氮源的利用。蛋白水解能力和蛋白酶活力分析发现,分别敲除蛋白酶Tr80170、Tr120998和Tr123234后,胞外蛋白酶活力明显降低,而其余9个蛋白酶基因的敲除对蛋白酶活力的影响不大。进一步以潮霉素抗性为筛选标记开展了多基因敲除研究,实现了对蛋白酶Tr80170、Tr120998和Tr123234同步敲除,构建了叁个蛋白酶基因敲除的菌株ΔP57和AP70。脱脂奶粉平板和蛋白酶活力测定显示,叁蛋白酶基因敲除菌株的蛋白水解能力显着降低。二、鉴定里氏木霉氮源广域调控因子Are1,证明该因子在氮源代谢、孢子形成、蛋白酶分泌及纤维素酶表达中发挥重要功能。为了研究里氏木霉胞外蛋白酶和氮源调控机制,首先分析了碳源和氮源对里氏木霉胞外蛋白酶产生的影响。脱脂奶粉平板分析发现,里氏木霉胞外蛋白酶的产生基本不受碳源的影响,而受氮源的影响较大,即胞外蛋白酶受到优先氮源(铵盐)的阻遏和次级氮源(如硝酸盐)诱导。接着,我们对里氏木霉氮源调控因子Are1展开了以下研究。鉴定了里氏木霉氮源调控因子Are1并构建了其缺失菌株,发现are1的敲除导致菌株不能够分泌胞外蛋白酶,且纤维素酶活力显着降低,主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、eg1、eg2和bgl1的表达水平也显着降低。进一步对纤维素酶基因启动子区的Are1潜在结合位点(5'-HGATAR-3',其中H代表A、T和C,R代表A或G)预测发现纤维素酶基因启动子上含有大量的Are1结合位点。因此,Are1可能直接调控了纤维素酶的表达。里氏木霉are1的敲除导致菌株不能利用硝酸盐,这与其他丝状真菌Are1同源物的功能相似,但里氏木霉are1敲除菌株也不能利用铵盐,这与其他丝状真菌显着不同。表达谱测序发现,are1正向调控了里氏木霉铵盐代谢途径中相关基因的表达。are1敲除菌株中的铵盐通透酶基因mep1和mep2、谷氨酸脱氢酶基因gdh1、谷氨酰胺合成酶基因gs1的表达量显着降低。进一步,在are1敲除菌株中过表达mep1、mep2、gdh1和gs1,发现mep1、mep2和gdh1的过表达能够恢复are1敲除菌株对铵盐的利用,而gs1的过表达不能恢复铵盐的利用。上述结果说明,里氏木霉are1特异性地调控了里氏木霉对铵盐的利用。因此,本论文的研究初步阐明了氮源调控因子are1调控了里氏木霉蛋白酶的合成和纤维素酶的表达,并发现are1能够调控铵盐和氨基酸的利用。这对于氮源调控因子Are1在丝状真菌中氮源调控功能的完善具有重要意义。叁、鉴定里氏木霉类p53调控因子Vib1,证明该因子在蛋白酶合成、菌体自溶及纤维素酶诱导信号的形成中发挥重要功能。构巢曲霉胞外蛋白酶的表达不仅受到广域调控因子AreA的调控,而且还受到类p53调控因子XprG的调控。鉴于此,本论文对里氏木霉XprG的同源物vib1基因进行了系统的遗传功能分析。敲除vib1不仅导致菌株胞外蛋白酶活力显着降低,而且其纤维素酶分泌能力丧失。而vib1过表达菌株的FPA、EG、CBH、BGL活力和蛋白量分别增加170%、80%、77%、110%和40%。进一步分析Vib1缺失菌株的主要纤维素酶转录调控因子的表达量,发现纤维素酶转录激活因子xyr1的表达量显着降低,但在Vib1缺失菌株过表达xyr1不能够恢复纤维素酶分泌能力。这表明Vib1可能还通过其他途径调控纤维素酶的表达。表达谱数据分析发现,are1敲除菌株中纤维二糖转运蛋白Crt1的表达量显着降低。有文献报道里氏木霉Crt1的缺失导致菌株不能产生纤维素酶,并且xyr1的表达量也显着降低,这暗示了 Vib1可能通过调控crt1的表达量继而调控纤维素酶的表达。四、鉴定里氏木霉工业菌株SN1并遗传改良纤维索酶系。本论文也鉴定了一株里氏木霉纤维素酶高产突变菌株SN1。纤维素酶活力分析发现,SN1具有较高的纤维素酶内切酶活力和较低的p-葡萄糖苷酶活力。然后,利用基因敲除策略构建了 SN1的尿嘧啶营养缺陷型菌株SP4,建立了高效率的遗传转化体系。接着,本源过表达了β-葡萄糖苷酶。工程菌的BGL酶活力比出发菌株提高了 17.1倍。改良的纤维素酶系成功用于高效降解不同预处理的玉米芯底物。本部分研究对里氏木霉工业菌株的遗传改良进行了有益探索,并为纤维素酶效率提升和纤维素转化成本降低提供了借鉴。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-25）
胞外蛋白酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
深海环境蕴含着数量巨大、种类丰富的微生物资源。微生物是深海生态系统的最主要成员,深海微生物之间存在着复杂的相互作用。但目前对深海微生物之间的相互作用类型及机制还了解很少。深海有机质大多是高分子量的颗粒有机质(particulate organic matter,POM),因此,深海微生物通过分泌胞外酶对胞外大分子的有机物进行降解并利用,是一种生存和适应环境的方式。来自细菌细胞壁的肽聚糖和来自动物的胶原蛋白是深海颗粒POM的重要成分,它们在深海中被微生物通过分泌蛋白酶降解和利用,进入深海碳氮循环。但目前我们对参与深海肽聚糖和胶原蛋白等有机质降解的微生物及其酶类的种类及降解机制还了解有限。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)是一类广泛分布于海洋环境中的异养细菌。Pseudoalteromonas sp.CF6-2是一株分离自南中国海深海沉积物的产蛋白酶细菌。前期研究表明,该菌分泌的适冷蛋白酶Pseudoalterin是一个M23家族金属蛋白酶,能够降解弹性蛋白和革兰氏阳性菌肽聚糖。在此基础上,本论文首先建立了菌株CF6-2的遗传操作体系和蛋白酶Pseudoalterin的适冷表达体系,然后对蛋白酶Pseudoalterin的诱导表达机制、成熟机制、分泌机制和催化机制进行了研究,揭示了菌株CF6-2利用Pseudoalterin捕食海洋革兰氏阳性细菌的生态学现象,建立了利用CF6-2发酵生产Pseudoalterin的小试和中试工艺。另外,本论文还研究了来自胶州湾沉积物的细菌Photobacterium sp.A5-7分泌的一个新的S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质及其PA结构域的功能。论文取得了如下研究结果:1.在基因组层面上分析海洋细菌胞外蛋白酶多样性为了在基因组层面分析海洋中产蛋白酶细菌的胞外蛋白酶的种类多样性,我们对两株海洋产蛋白酶细菌一深海沉积物细菌P.sp.CF6-2和北极表层海水细菌Flavobacterium arcticum SM1 502T的全基因组进行了测序,在基因组层面上揭示了这两株菌的胞外蛋白酶及其它胞外酶种类多样性。菌株CF6-2的基因组编码50种具有信号肽的肽酶,包括28个丝氨酸肽酶和22个金属肽酶。这些酶分布于9个丝氨酸肽酶家族和15个金属肽酶家族。菌株SM1502T的基因组编码29个具有信号肽的肽酶,包括14个丝氨酸肽酶、11个金属肽酶和4个半胱氨酸肽酶。这些酶分布于7个丝氨酸肽酶家族、5个金属肽酶家族和4个半胱氨酸肽酶家族。这些结果表明,这两株菌都含有大量的胞外蛋白酶基因,可能在海洋沉积物有机氮降解和循环中发挥重要作用。2.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表达的诱导机制海洋细菌胞外蛋白酶大多是受胞外物质诱导表达的,但诱导细菌胞外蛋白酶产生的确切信号分子至今尚未被鉴定出。本文对诱导细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin表达的信号分子进行了鉴定。由于蛋白酶Pseudoalterin能够高效地降解革兰氏阳性细菌肽聚糖的肽链部分,因此,我们的科学假设是:肽聚糖中的某些组分可能对Pseudoalterin具有诱导作用。为此,我们尝试从肽聚糖肽链组分中鉴定Pseudoalterin表达的诱导信号分子。首先检测了海洋典型革兰氏阳性菌Staphylococcus warneri MCCC0423的肽聚糖在转录水平上对Pseudoalterin的诱导作用。然后根据MCCC0423肽聚糖肽链的序列合成19种小肽,检测这19种寡肽及其中所含单个氨基酸对Pseudoalterin转录的诱导作用。实验结果表明含Gly寡肽及Gly对Pseudoalterin有诱导作用,为CF6-2表达Pseudoalterin的诱导信号分子。Gly的有效诱导浓度在0.25 mM-20 mM。这是首次揭示了微生物胞外蛋白酶的确切诱导信号分子并确定了其有效诱导浓度。另外,我们还确定了 Pseudoalterin的转录起始位点,为进一步阐明细菌CF6-2对Pseudoalterin合成的胞内调控机制奠定了基础。3.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin的成熟和分泌机制前期研究表明,M23家族蛋白酶Pseudoalterin没有自成熟的能力,需要其他蛋白帮助其切割前导肽。但哪些蛋白辅助Pseudoalterin成熟还不清楚。为了鉴定Pseudoalterin成熟的辅助蛋白和阐明其成熟机制,我们首先建立了菌株CF6-2的遗传操作体系,然后通过分析其他M23家族蛋白酶的成熟过程找出可能在Pseudoalterin成熟过程中起作用的辅助蛋白。利用菌株CF6-2的遗传操作体系对这些辅助蛋白进行基因敲除,然后分析突变对胞外Pseudoalterin的影响,从而确定了叁个对Pseudoalterin成熟有辅助作用的蛋白酶,Lysyl、Serine1和Serine5。信号肽预测结果表明这叁个蛋白酶可能位于周质空间。通过Western blot检测发现,全细胞上清中存在Pseudoalterin的成熟形式,因此推测Pseudoalterin前导肽的切割发生在周质空间。通过分析菌株CF6-2的基因组,发现其具有完整的II型分泌系统(Type II secretion system,T2SS)。我们推测CF6-2可能通过T2SS分泌Pseudoalterin。我们将T2SS中的关键基因gspE缺失突变后,CF6-2的发酵液几乎检测不到Pseudoalterin,回补缺失基因后,Pseudoalterin的分泌得到了恢复。因此可以确定Pseudoalterin是通过T2SS分泌到胞外的。4.深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin结合和催化降解肽聚糖的机制前期研究表明,菌株CF6-2分泌的蛋白酶Pseudoalterin有两个功能结构域,含Zn离子的催化结构域能水解肽聚糖的肽链,另一个与催化结构域呈T字形紧密排列的C端结合结构域能结合肽聚糖糖链。Pseudoalterin能够降解革兰氏阳性细菌肽聚糖,但其结合和催化肽聚糖降解的分子机制尚未揭示。为了研究Pseudoalterin结合和催化肽聚糖降解的分子机制,我们通过分子对接的方法,将肽聚糖肽尾AeKaA和肽桥AGGGGG与Pseudoalterin催化腔进行分子共模拟,并结合同源序列分析,预测了 Pseudoalterin参与催化肽聚糖降解的关键氨基酸残基。然后,我们构建了 Pseudoalterin的在海洋适冷细菌中的适冷表达体系,并利用该体系对关键氨基酸残基进行了突变表达和纯化,并构建及纯化了C端结合结构域缺失突变体。通过测定Pseudoalterin突变体对肽聚糖的降解活性和吸附能力的变化,阐明了 Pseudoalterin结合和催化降解肽聚糖的机制。这是首次揭示了一个深海细菌蛋白酶对细菌肽聚糖降解的分子机制。5.深海细菌CF6-2及其胞外蛋白酶Pseudoalterin的生态功能细菌分泌的M23家族蛋白酶可以裂解细菌细胞壁肽聚糖,从而可为细菌获取食物并进行防御和竞争提供优势。为了阐明菌株CF6-2与海洋革兰氏阳性细菌之间的相互作用,我们通过平板实验对菌株CF6-2与海洋革兰氏阳性细菌进行了共培养,发现菌株CF6-2能够裂解多种海洋革兰氏阳性细菌并利用裂解细菌产生的营养物质进行生长,表明菌株CF6-2可能具有捕食海洋革兰氏阳性细菌的能力。然后,以 Staphylococcus warneri MCCC1A00423为对象,研究了P.sp.CF6-2通过分泌蛋白酶Pseudoalterin对革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖进行降解,导致细菌裂解和死亡,从而从中获取营养进行生长和繁殖的机制。根据研究结果提出了海洋革兰氏阴性菌CF6-2捕食海洋革兰氏阳性菌的模型。通过生物信息学分析,我们发现多株来源于海洋的细菌(大多数为革兰氏阴性菌)含有蛋白酶Pseudoalterin的同源序列,因此推测我们揭示的革兰氏阴性菌通过胞外蛋白酶捕食革兰氏阳性细菌的现象在海洋生态环境中可能具有普遍性,这是一种新的存在于海洋细菌之间的相互作用关系。6.深海细菌CF6-2产胞外蛋白酶Pseudoalterin的小试和中试发酵M23家族蛋白酶能够降解肽聚糖和弹性蛋白,因此在生物医学和生物技术上具有一定的应用潜能。为了降低发酵成本并同时提高Pseudoalterin的产量,在前期优化的基础上,我们通过单因子实验对发酵培养基的成分和发酵培养条件进行了进一步优化。以0.5%的蔗糖为碳源,将牛心管粉的用量从1.2%减少到0.6%,将Pseudoalterin的产量提高了 161%(161.2± 3.1 U/mL)。在发酵培养基优化的基础上,对小试5 L发酵罐和中试50 L发酵罐发酵CF6-2生产Pseudoalterin的通气量和搅拌速度进行了优化,建立了深海细菌CF6-2产胞外蛋白酶Pseudoalterin的小试和中试发酵工艺。小试和中试中Pseudoalterin的产量分别达到155.6±10.5 U/mL和103.5±8.6 U/mL。研究结果为Pseudoalterin的工业化生产和其在生物医学和生物技术上的应用奠定了坚实的基础。7.新型S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质和PA结构域的功能在系统开展海洋细菌蛋白酶Pseudoalterin研究的基础上,本论文对海洋细菌分泌的另外新型S8家族丝氨酸蛋白酶P57的酶学性质和PA结构域的功能进行了研究。Photobacterium sp.A5-7是一株分离自胶州湾沉积物的产蛋白酶细菌。本文对Photobacterium sp.A5-7分泌的一个蛋白酶P57进行了纯化和表征。P57是一个新的S8家族枯草杆菌素类蛋白酶,能水解酪蛋白、明胶和胶原蛋白。成熟的P57具有一个催化结构域和一个PA结构域。对异源表达融合蛋白PA-EGFP的分析表明,PA结构域对胶原具有吸附能力。通过Fe3+抑制P57的酶活,检测到了 P57与胶原的结合。通过定点突变分析,发现Phe349和Tyr432是P57结合胶原的关键氨基酸残基。这些结果表明P57能通过PA结构域结合胶原底物。该部分实验结果首次提供了枯草杆菌素类蛋白酶的PA结构域能结合不溶性底物的直接证据,对更好地了解来自海洋沉积物中细菌胞外蛋白酶和枯草杆菌素蛋白酶PA结构域的功能具有重要意义。综上所述,本论文对深海细菌CF6-2胞外蛋白酶Pseudoalterin在海洋肽聚糖降解和海洋生物竞争的生态学功能方面进行了较为深入的研究,同时研究了Pseudoalterin的诱导、成熟、分泌和催化机制,这些研究有助于我们更好地了解细菌及其胞外蛋白酶在深海物质循环和微生物相互关系中的作用。能够降解肽聚糖的蛋白酶Pseudoalterin在生物医学和生物技术上具有很好的应用价值,因此对本文建立的其进行的生产Pseudoalterin的中试发酵工艺为其大规模工业化生产奠定了坚实的基础。另一方面,在研究胞外蛋白酶Pseudoalterin的同时此外,我们本文建立了菌株CF6-2的遗传操作体系和适冷蛋白酶的适冷表达体系,这对研究深海细菌其它适冷菌和适冷蛋白具有重要意义。本文对蛋白酶P57的酶学性质及PA结构域的研究,对更好地了解来自海洋沉积物中细菌胞外蛋白酶和枯草杆菌素蛋白酶PA结构域的功能以及阐明海洋沉积物中颗粒有机氮降解具有重要意义。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胞外蛋白酶论文参考文献
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[8].李杨.大连盐场与茶卡盐湖嗜盐古菌多样性及胞外蛋白酶研究[D].江苏大学.2018
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[10].钱远超.里氏木霉胞外蛋白酶的表达调控及纤维素酶的酶系改良[D].山东大学.2018
论文知识图
