袁泉[1]2004年在《双向凝胶电泳技术研究及其在蛋白质组学中的应用》文中指出虽然固相凝胶 IPGtrip 的商品化使得双向电泳在分离蛋白质上重复性得到很大提高并且已经成研究蛋白质组的支撑技术之一。但是由于影响分辨率和重复性的诸多因素仍然存在,而在蛋白质组研究中首先要对蛋白质进行高分辨率,高重复的分离,然后才是分析鉴定这些蛋白质,所以掌握和建立适合于研究对象的双向电泳技术成为进行蛋白质组研究的关键问题。而能够一次可分离几千个蛋白质的双向电泳就成为进行蛋白质组研究的首选技术。 作者在国内较早地建立和完善了高分辨率、重复性好及高通量的双向凝胶电泳技术基础上,又发展了多根胶条在一块凝胶上进行双向电泳新方法(Multi-stripon one gel MSOG),该方法进一步的提高了 2-DE 的重复性、分辨率和通量。基于该方法具有特别适合于差异蛋白质组研究的特点,我们用它对人肝癌细胞SMMC7721 及其良性回复突变细胞 CL1 进行了差异蛋白质组学研究,并发现了19 个蛋白质点呈现显着性表达差异;分析鉴定结果表明这些蛋白质都直接或间接的与人肝癌细胞 SMMC7721 的良性回复突变相关。一些蛋白质如 maspin 或组织蛋白酶 D(cathepsin D)将有可能发展为肝癌诊断或治疗的潜在标记分子。 用血清蛋白质组对疾病诊断和疗效的评价是医学上里程碑式的事件。血清蛋白质组学是蛋白质组学研究中最引人注目的领域。本文还把在细胞水平上的研究(蛋白质学)转移到血清蛋白质组学的研究,从而把蛋白质组的研究更为直接与重大疾病和临床医学联系起来。通过长期运动对 Cpefat/fat(由于羧肽酶 E 突变而导致肥胖的)小鼠的血清蛋白质组学的研究,发现在长期运动前后的小鼠,发生了包括不同翻译后修饰形式的触珠蛋白(haptoglobin)及一系列的血管舒缓素(kallikrein)等小鼠血清蛋白表达的变化。这一研究不仅建立了高重复性的血清蛋白质组的 2-DE 技术,还发现一些与肥胖相关的重要蛋白质,对在蛋白质翻译水平上揭示运动与肥胖的关系的分子机制,发现与肥胖等疾病候选的标记分子开辟了新的研究途径。
魏黎明[2]2011年在《基于纳米金刚石的蛋白质组学新技术和新方法研究》文中认为本博士论文针对目前蛋白质组学研究中面临的分离富集及鉴定方面的热点与难点问题,将纳米金刚石材料与蛋白质分析结合起来,开展了一系列研究工作,发展了相关的新技术和新方法并进行了实际的应用研究：利用纳米金刚石成功实现了低丰度蛋白质/多肽的高效、快速、高回收率富集,并应用于宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常可能机制中差异蛋白质组学研究以及在肝癌血清肽组学中的实际应用；将纳米金刚石应用于MALDI靶上前处理中的研究,提高了多肽检出限,同时实现了靶上点样富集,提高了低丰度蛋白质的鉴定效率；利用该体系成功完成了蛋白酶的固定以及实际应用,提高了蛋白质的酶解效率；利用纳米金刚石表面多活性位点,成功实现了对其氨基苯硼酸的表面改性,从而完成了糖基化多肽的分离富集,在鼠肝蛋白液相单流份中鉴定了36个糖蛋白,确定了40条糖基化肽段；随后将纳米金刚石与磁性功能材料实现整合,使蛋白多肽的富集更快速、高效,提高了低分子量蛋白的鉴定与检出,并利用纳米金刚石磁性功能材料富集了经四环素刺激前后诱导乙肝病毒产生的HepAD38细胞分泌蛋白质组,研究了乙肝病毒改变免疫微环境在免疫耐受和病毒致病机制中的影响。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下：第一章绪论概述了蛋白质组学分离分析研究的主要技术手段和应用。对分离分析研究的新技术发展趋势,包括低丰度蛋白质或多肽分离富集、翻译后修饰蛋白质或多肽分离富集进展进行了简单的综述；详细概述了纳米金刚石的制备、性质等及其在分析化学、生物医药领域中的应用；提出了本论文选题的目的和意义。第二章针对低丰度蛋白及多肽的分离富集鉴定,利用爆炸法制备纳米金刚石表面多官能团的性能对低浓度多肽溶液进行了富集分析。表征了富集前后纳米金刚石的表面官能团改变,证明了对多肽或蛋白的充分富集能力。通过富集时间、富集容量、耐盐量、耐表面活性剂评价了纳米金刚石对多肽或蛋白的富集效率。通过不同pH值缓冲液进行了多肽富集实验,证明了该材料对多肽富集无pH值偏向性。通过实际样本胶内酶解多肽抽提液的直接冻干、zip-tip富集、纳米金刚石富集比较实验,纳米金刚石在低丰度蛋白质鉴定方面具有更好的表现。随后采用纳米金刚石辅助质谱鉴定应用于血清游离肽分离分析以及探索宫内生长迟缓大鼠肾脏发育异常的可能机制。我们在肝癌血清中寻找到了蛋白血纤维蛋白肽A(fibrinopeptide A)异常高表达,为后续的肝癌血清肽组学提供了参考数据。在IUGR新生鼠和正常新生鼠的肾脏蛋白质差异表达蛋白中寻找了可探索研究的波形蛋白以及串珠素蛋白。同时,证实能量代谢异常、氧化还原和凋亡的失衡以及信号转导和细胞增殖的异常可能参与了IUGR大鼠肾单位数目的减少和肾脏发育的异常。第叁章针对提高质谱灵敏度与鉴定成功率问题,利用纳米金刚石对多肽或蛋白质的富集能力以及超细小颗粒特性,将其置于基质辅助激光解析质谱(MALDI)靶板作为MALDI靶上前处理基质提高了肽段的离子化效率。通过纳米金刚石作为辅助基质,使得肽段与基质更好的结合形成均匀分布样本层,无需MALDI激光寻找“hotspot"分析肽段,同一样本点从内到外激光定点分析肽段的重现性为11.8%,相对不锈钢靶板18.8%有较好的表现力。同时肽段的响应信号比直接点样分析提高约5倍,可以检测到0.1fmol肌红蛋白酶切肽段,以及62.5amol的标准肽。纳米金刚石除可进行辅助肽段离子化外,也可以实现靶上富集分析肽段,灵敏度较直接分析提高1个数量级,而且可以耐受500mN aCl,因此纳米金刚石在实际样品分析中比其他肽段前处理方法方便、灵敏。dNDs可以直接用于MALDI无机基质对小分子化合物的分析,同时亦可通过辅助涂层提高分析物的结晶均匀性、分析物的离子化效率从而进一步提高低丰度蛋白鉴定的成功率、可信度。因此dNDs辅助涂层在低丰度蛋白的鉴定过程中有着广阔的应用前景。第四章利用纳米金刚石的材料特性采用化学修饰进行了生物酶的固定,通过傅立叶变换红外光谱仪以及透射电镜等手段进行表征。生物酶在纳米金刚石固定化后,其耐热性、耐有机溶剂、耐酸性以及稳定性都有很好的提高,反复使用10次仍能保持60%的活性。通过与商品固定化酶的比较,其对蛋白质的酶解效率与质谱鉴定成功率都有明显提高。同时采用该方法进行了N-糖苷酶F的固定,10mmin完成了糖链的酶切,大大缩减了传统溶液酶解的时间,从而进一步提高了糖苷内切酶的酶解效率。第五章针对翻译后修饰蛋白中糖蛋白/糖肽的分离富集问题。利用纳米金刚石表面的多活性位点以及较大的比表面积,实现了对其功能化修饰以及糖肽的特异性富集。在超声分散条件下采用氨基苯硼酸对纳米金刚石进行功能化修饰,采用傅立叶变换红外光谱仪进行表征；通过复杂肽段中糖肽的特异性富集评价了该功能化材料的优点。与商品化硼酸磁珠相比,其选择性、富集效率与灵敏度都有较大的提高。采用160/18O定量标记法评价了纳米金刚石一一硼酸法对糖肽的富集回收率达72.2%。同时,我们将该方法用于大鼠肝脏样品液相分离部分中糖肽的富集,鉴定并确定了40条糖肽和36个糖基化位点,其中有7个位点在Swiss-prot和TrEMBL数据库有记录,新发现26个糖基化位点。通过上述研究表明氨基苯硼酸纳米金刚石可以快速、有效的富集糖肽,由于具有较高的富集回收率,富集灵敏度达250amol/μL,并且可以直接与MALDI-MS、LC-MS联用,可以将该方法用于实际样品中糖肽的分析鉴定。第六章针对分泌蛋白质的分离富集技术,采用水热法制备了具有超顺磁性的四氧化叁铁磁性微球；采用溶胶-凝胶法在其表面包覆二氧化硅层,合成制备了具有核壳结构的Fe3O4@SiO2磁性硅球；并在其表面进行氨基硅烷化修饰,随后利用聚丙烯胺、碳化二胺、琥珀酰胺辅助反应试剂实现纳米金刚石在上述磁性功能材料上固定和键合。利用傅立叶变换红外光谱仪、透射电子显微镜等对我们制备的Fe3O4@SiO2@ [dND]n进行了表征。证实我们合成了以磁性材料为核的层层组装键合纳米金刚石。通过对标准蛋白酶解肽段/蛋白质的富集评价,证明该材料具有与纳米金刚石相似的富集能力,同时由于磁性材料的引入,大大提高了样品富集处理效率。采用Fe3O4@SiO2@[dND]n(?)寸蛋白的分离富集能力,我们成功富集了由四环素刺激前后诱导乙肝病毒产生的HepAD38细胞分泌上清,并采用iTRAQ技术进行了刺激前后分泌蛋白质表达量的差异分析。该材料的硅层表面与报道过的同类材料的聚合物表面相比,具有更好的生物相容性。将其应用于富集低丰度肽段,富集倍数达到100倍以上；即使对高浓度的盐溶液中的肽段仍能实现有效富集。总之,本论文围绕蛋白质组学研究的新技术、新方法,以纳米金刚石为基础建立了有效的分离富集等新方法,为解决蛋白质组学分析中的低丰度蛋白质、糖基化蛋白的分离富集及提高鉴定效率等问题提供了新颖有效的研究手段和方法。
高明霞[3]2006年在《高丰度蛋白质的除去及蛋白质的多维色谱分离与定量新方法研究》文中研究说明20世纪中期以来，随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的X射线解析，开始了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的主要体现者蛋白质的研究，成为生命科学研究的主要内容。90年代中期，在人类基因组计划(Human Genomic Project)研究发展及功能基因组学的基础上，国际上萌发产生了一门在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科——蛋白质组学(Proteomics)，它以蛋白质组(Proteome)为研究对象。蛋白质组学(proteomics)已经成为功能基因组学研究的重要领域，其重要性和战略意义日益显着。蛋白质组学研究主要有两种路线：第一种是传统的双向凝胶电泳(2-DE)分离技术。但是双向凝胶电泳技术仍然存在许多不足和一些难以克服的缺陷，比如有限的动态范围，分离样品中分子量差别较大的蛋白、低拷贝蛋白、疏水蛋白以及极酸极碱蛋白的分辨能力比较差，而且其操作过程费时费力，自动化程度低。针对这些固有的技术上的缺陷，具有快速，高效，自动化程度高等优点的液相色谱技术得到了长足发展，并成为蛋白质组学研究的第二条技术路线。发展两维乃至多维色谱分离技术，提高峰容量和分离能力是根本上解决复杂样品分离问题的方法。从理论上说，只要组合在一起的两种模式的分离机理正交，整个二维系统的峰容量是每一维峰容量的乘积，特别适合于复杂样品的分析。在过去的十几年中，已经出现了一些被认为是突破性的进展，Jorgenson(多维色谱-电泳技术)，Yates(Shot-gun技术)，Aebersold(ICAT技术)等科学家在蛋白质组学新方法的研究方面打开了一个崭新的局面。目前，蛋白质组学面临的两大挑战是高丰度蛋白质压制低丰度蛋白质造成低丰度蛋白质检测困难以及蛋白质的定量问题。Shot-gun为代表的bottom-up技术在分离之前将蛋白质样品进行酶解，一个蛋白质酶解成多个肽段，这势必使原本就很复杂的样品变得更加复杂，不仅给色谱的分离能力与质谱的扫描速度提出挑战，不利于低丰度蛋白质的检测，而且将蛋白质酶解成肽段的同时又损失了完整蛋白质的信息。ICAT技术在蛋白质的相对定量方面发挥了重大作用，然而已有的定量技术仅局限在相对定量方面。因此，现有的多维色谱技术在解决蛋白质组学的两大问题上存在许多不足，本论文就是围绕当前蛋白质组学研究中存在的问题开展工作的，建立发展多维色谱技术方法达到实现高丰度蛋白质的去除以及完整蛋白质的分离鉴定以及定量等目的。本论文共分五章。主要内容摘要如下：第一章总结了蛋白质组学的现状与发展以及多维色谱与其相关技术在蛋白质组学中的应用与进展。介绍了二维／多维分离方法的理论依据，探讨了目前蛋白质组学研究使用的技术模式的成功与不足。并介绍了本论文选题的目的和意义，着重在于如何利用多维液相色谱的技术实现在完整蛋白水平上的分离，去除高丰度蛋白质以及利用多维液相色谱技术同时实现对蛋白质的定性定量等问题。第二章以鼠肝为研究对象比较了不同的提取环境对动物组织中蛋白质提取的影响。主要研究了叁种提取环境：酸性、中性和碱性环境。利用双向凝胶电泳分离成像技术比较了在叁种不同环境下提取的蛋白质的分布的差异性，通过实验证明了在不同的提取环境下提取的蛋白质在种类和含量上都是不同的，同时也证明了在蛋白质组学的研究中不同的分离路线或分离模式应该根据具体分离条件的酸碱度的不同选用不同的蛋白提取方法，以避免在分离的过程中因沉淀问题而损失蛋白质，为后续工作打下基础。第叁章针对肝脏组织蛋白建立了反相高效液相色谱／双向凝胶电泳(RPLC／2-DE)的叁维分离系统。2-DE技术是比较成熟的蛋白质分离手段，但是样品负载量低是影响中低丰度蛋白检测的一个重要原因，同时2-DE技术对于复杂的蛋白质样品的分离能力是有限的。RPLC是生物分析中常用的高效的分离模式，对蛋白或肽等有很好的分离能力，还具有除盐纯化样品的能力。RPLC与2-DE的分离机理正交，两种技术联合使用能在很大程度上提高样品的分辨率。本章工作以大鼠的肝脏组织蛋白为研究对象建立了实验路线并确立了实验条件。研究表明，蛋白质样品经过RPLC预分离之后，不同的蛋白就被富集浓缩到不同的馏份中，极大的提高了单个馏份中的蛋白在2-DE上的上样量和分辨率，这一点在凝胶扫描图上可以直观的反映出来，同时，实验证明RPLC分离蛋白质有着很好的重现性，据此可以对同一样品进行平行收集，以达到进一步增大单个馏份中蛋白的上样量的目的。因此，将RPLC作为预分离手段用于2-DE之前对样品进行预分离可以提高蛋白质在2-DE上的上样量和分辨率。这条技术路线已经在中国人肝项目表达谱的研究中得到应用。第四章直接采用多维液相色谱的方法通过多维色谱分离的手段去除生物样品中的高丰度蛋白。中心思路就是：首先利用多维色谱技术对蛋白样品进行有效分离，在完整蛋白分离的基础上，将高丰度蛋白质在酶解成更复杂的肽段之前除掉。这条技术路线目前还没有类似报道。具体路线简述如下：发展了强阳离子交换色谱／反相高效液相色谱(SCX／RPLC)分离系统，对鼠肝组织蛋白进行高效的分离。使用连续地线性盐梯度将蛋白质从SCX色谱柱上洗脱下来，得到62个馏份，每个馏份进一步使用常规的RPLC进行第二维地分离，整个分离过程使用紫外信号对蛋白的色谱峰进行监测，在第二维的分离过程中将信号强也就是量大的高丰度蛋白单独收集，其余中低丰度的蛋白进行合并、浓缩和酶解，然后使用毛细管反相色谱(cRPLC)进行分离，之后进行质谱鉴定，62个馏份分别如法炮制。结果表明，一次实验流程可以去除77个高丰度蛋白，占总蛋白量的34.5％，与不经过去除高丰度蛋白的样品进行比较，鉴定蛋白的数量提高了2到3倍之多。在此基础上，我们进一步简化实验路线并提高方法地通量。来自SCX分离之后的62个馏份经过RPLC进一步分离之后，我们将所有含有中低丰度蛋白的洗脱液合并浓缩到一起，共同酶解之后使用在线的二维分离系统，即shot-gun技术对酶解之后的肽段进行分析鉴定。简化后的实验路线对中国人肝样品进行了分析，58个高丰度蛋白质被去除，共鉴定出1213个蛋白质。总之，这套系统对降低蛋白质样品地复杂性，避免高丰度蛋白质在分离和质谱鉴定过程中压制中低丰度蛋白提供了一个新的手段和思路。另外，通过多维液相色谱分离的方法去除高丰度蛋白质，相对通常使用的免疫亲和的手段，无疑更具有通用性、灵活性、低成本和周期短的优势。第五章发展了多维液相色谱的Top-down技术路线，即SCX／cRPLC／靶上酶解／MALDI-TOF-TOF分离鉴定系统。采用SCX／cRPLC分离系统，实现了在完整蛋白水平上的两维分离，本实验室发展的新方法靶上酶解技术的采用将蛋白质分离与质谱鉴定有效的结合起来，从而实现了蛋白从分离、酶解到鉴定这样一个完整的Top-down路线。蛋白质样品经过常规柱SCX分离之后，得到62个馏份，每个馏份继续使用毛细管反相柱cRPLC进行第二维分离，cRPLC作为第二维具有除盐和纯化样品的作用，为直接酶解提供了可能，利用自动点样仪将经过cRPLC的洗脱液直接收集到标准的MALDI靶板上，点样频率为30秒／个，经过靶上单点酶解之后用MALDI-TOF-TOF鉴定。整个系统对中国人肝蛋白进行了鉴定，共鉴定出3313个唯一蛋白。与通常采用的shot-gun技术相比，我们发展的多维液相色谱的Top-down技术路线更能充分的分离蛋白质，得到更多的包括肽谱和疏水性等有关蛋白质的信息。与2-DE相比具有成本低和自动化高等优势。在此基础上，我们进一步发展为叁维蛋白分离系统，即SEC／SCX／RPLC系统，对肝脏蛋白进行更为完全的分离，利用紫外可见检测对蛋白峰进行归一化处理，进一步计算出蛋白的含量，相对应的蛋白质色谱峰同时进行浓缩、酶解、进而MALDI-TOF-TOF检测定性分析，以达到对单个蛋白同时进行定性和定量的目的。这条路线已经进行了有成效的探索，得到一些初步的结果，为蛋白质组学中的定量问题提供了一个可行的有价值的新思路。总之，本论文围绕蛋白质组学的研究热点，以液相色谱分离系统为基础，发展了多种有效的分离系统，以完整蛋白质的分离为指导思想，建立了反相色谱预分离结合双向凝胶电泳的分离路线；开创了基于多维色谱分离为基础的高丰度蛋白质去除系统；发展了多维液相色谱的Top-down技术路线，试图在蛋白质研究主流的2-DE-MS技术之外，另辟蹊径，对蛋白组学新方法学的建立进行了有益的探索和研究，而且多数实验路线已经在中国人肝项目中投入使用，贡献了大量的有价值的实验数据。
徐秀青[4]2007年在《基于功能磁性材料的蛋白质组学分离鉴定新方法研究》文中进行了进一步梳理本论文针对目前蛋白质组学研究中面临的分离富集及鉴定方面的热点难点问题，将功能磁性材料与蛋白质分析结合起来，开展了一系列研究工作，发展了相关的新技术新方法并进行了实际的应用研究，取得了一些创新性研究结果。主要研究内容和取得的主要研究成果摘要如下：第一章概述了蛋白质组学目前分离鉴定研究的主要技术手段及分离富集新技术研究的发展趋势；概述了磁性聚合物微球的特点及其应用；就功能材料应用于分离富集低丰度蛋白和翻译后修饰蛋白质的研究进展进行了综述；提出了本论文选题的目的和意义。第二章针对低丰度蛋白及肽段的分离鉴定，采用水热法制备了具有超顺磁性的四氧化叁铁磁性微球；采用溶胶-凝胶法在其表面包覆二氧化硅层，合成制备了具有核壳结构的Fe_3O_4@SiO_2磁性硅球；并在其表面进行硅烷化修饰。利用振动样品磁场计、傅立叶变换红外光谱仪、透射及扫描电子显微镜、热失重分析仪等对我们制备的C8键合相疏水性硅球磁性材料C8-f-Fe_3O_4@SiO_2进行了表征。该材料的硅层表面与报道过的同类材料的聚合物表面相比，具有更好的生物相容性。将其应用于富集低丰度肽段，富集倍数达到100倍以上；即使对高浓度的盐溶液中的肽段仍能实现有效富集。进一步用于血清中游离低丰度肽段的分离富集。实验结果表明，其对于血清中游离肽段的富集效果达到并超过了已经报道的同类材料的效果。第叁章针对翻译后修饰蛋白质组中的磷酸化蛋白及肽段的分离富集问题，采用固定金属亲和色谱(IMAC)原理，在Fe_3O_4@SiO_2磁性硅球表面键合上螯合金属离子的官能团，将Fe(Ⅲ)固定在磁球表面。采用傅立叶变换红外光谱仪等对其进行了表征与确认。以β-casein标准蛋白为测试对象，实验证明该材料对于磷酸化肽段具有很好的选择性富集效果，信躁比可提高10倍以上。实验得到了该材料选择性富集磷酸化肽段的最佳条件并考察了该材料对于混合蛋白酶解肽段体系中磷酸化肽段的选择性富集性能，富集到的磷酸化肽可洗脱分析也可无需洗脱直接进行质谱分析，显示了该方法的灵活性。在此基础上，进一步用于人血清中游离的磷酸化肽段的富集，并采用质谱进行了磷酸化肽段结构以及磷酸化位点的鉴定，获得了一批磷酸化肽段数据。以鼠肝蛋白提取物为研究对象，将提取蛋白酶解得到的鼠肝肽段混合物，分别采取两条技术路线进行分离鉴定：(a)将肽段混合物中所有的磷酸化肽段富集到材料上，将其洗脱，进行nanoLC-LTQ MS／MS分析，鉴定了66条磷酸化肽段。(b)将肽段混合物进行色谱分离，按时间收集29个馏分，降低了富集体系的复杂性后再用材料富集各个馏分中的磷酸化肽，对每个馏分中富集到的磷酸化肽段采用MALDI TOF MS进行磷酸化肽段及其位点的鉴定，显示了该材料对磷酸化肽段具有较好的选择性和适用性。论文还发展了更为简便的方法，合成了氨基四氧化叁铁磁性纳米材料，在其表面键合上螯合金属离子的官能团，将Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)、Ga(Ⅲ)、In(Ⅲ)、Zr(Ⅳ)、Ce(Ⅲ)等离子固定到磁球表面。通过傅立叶变换红外光谱仪、能量弥散X射线分析仪等对其进行表征。考察了表面固定Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)、Ga(Ⅲ)、In(Ⅲ)、Zr(Ⅳ)、Ce(Ⅲ)等离子的氨基四氧化叁铁磁性纳米材料对于磷酸化肽段的选择性富集能力，结果表明，所有材料对于磷酸化肽段都有较好的分离富集选择性，其中Fe(Ⅲ)、Al(Ⅲ)、Ga(Ⅲ)和Zr(Ⅳ)较In(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)的选择性更加突出。第四章研究探索了二氧化钛的包覆新方法，采用磁球外部包覆碳层为模板包覆二氧化钛、随后灼烧去除碳层的方法，制备了结构紧密的具有核壳结构的Fe_3O_4@TiO_2超顺磁性微球。该新材料具有与IMAC材料完全不同的富集机理，且具有更高的化学惰性和稳定性。采用振动样品磁场计、傅立叶变换红外光谱仪、透射及扫描电子显微镜等对产物进行了表征与确认。该合成新方法为在磁球表面包覆其他金属氧化物提供了很好的借鉴作用。实验进而优化了该材料富集磷酸化肽段的实验条件，包括富集体系、富集时间、样品洗脱时间等，验证了该材料对于复杂体系中磷酸化肽段有很好的选择性富集性能。并将其应用于人血清磷酸化肽富集和鼠肝蛋白中磷酸化肽鉴定，获得了79条磷酸化肽段的数据。第五章针对翻译后修饰蛋白中糖基化蛋白及肽段的分离富集问题，论文研究制备了表面键合硼酸基团／Con A凝集素的氨基磁性纳米粒子新材料，采用傅立叶变换红外光谱仪进行表征；对该材料应用于糖基化蛋白的选择性富集进行了初步实验探索，实现了对糖蛋白的选择性富集，获得了有价值的研究结果。论文还研究了糖蛋白的酶解方法，优化了酶解的条件，采用色谱分离的方法获得了目标糖肽段。总之，本论文围绕蛋白质组学研究的新技术新方法，发展了多种功能化磁性材料并建立了多种有效的分离富集方法，为解决蛋白质组学分析中的低丰度蛋白质、翻译后修饰的磷酸化和糖基化蛋白的分离富集及鉴定问题提供了新颖有效的研究手段和方法。
靳文海[5]2005年在《多维液相色谱-质谱联用技术在蛋白质组学中的应用》文中指出由于血浆中蛋白质的种类繁多,各组分含量的动态分布范围很大,采用二维液相色谱对人血浆样品首先进行蛋白质水平上的分级,收集到的组分分别酶解后再利用毛细管液相色谱—电喷雾—串连质谱分析,在人类蛋白质组学组织(HUPO)建议的较为严格的数据库搜索标准下,成功鉴定到了1292种蛋白质,有效避免了常规方法中去除高丰度蛋白质给血浆中低丰度蛋白质所带来的损失,从而大大提高了鉴定到的蛋白质的数量。 采用固定化金属亲和色谱对小鼠肝组织蛋白质酶解所产生肽段进行亲和纯化,富集到了大量的磷酸化肽段,之后利用纳升级毛细管液质联用系统进行分析,成功鉴定到了26段小鼠肝组织的磷酸化肽段的26个磷酸化位点,并对磷酸化肽段的质谱行为做了分类总结。建立了对组织样品进行磷酸化蛋白质分析的方法。 充分利用了磷酸化肽段在聚苯乙烯类色谱柱上不保留或保留很弱以及磷酸化肽段在碱性条件下通常带有较多负电荷的特点,采用新型一体柱在碱性条件下上样和pH台阶梯度洗脱,有效富集了小鼠肝组织酶解肽段中的磷酸化肽段。通过对收集到的酸性洗脱液中肽段的质谱分析,成功鉴定了31组蛋白质的37段磷酸化肽,确定了46个磷酸化位点。 通过改变聚合单体的比例和添加新的致孔剂,快速制备出了聚苯乙烯类毛细管电色谱整体柱,并成功分离了苯的同系物、苯胺、荷尔蒙、碱性药物、肽段以及小肽的同分异构体,最高柱效超过20,000N/m。
谢秀枝, 王欣, 刘丽华, 董世雷, 皮雄娥[6]2011年在《iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用》文中研究指明近年来随着蛋白质组学的迅速发展,其相应的方法学研究也取得了巨大的进步,一系列新技术融入了蛋白质组学研究中,极大地促进了这门学科的发展.相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术与高度敏感性和准确性的串联质谱及多维液相色谱联用技术已成为蛋白质定性和定量研究的主要工具之一.该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性.由于其能够同时对多达8种样品进行标记分析,故在生命科学的各个领域得到了广泛的应用.本文对iTRAQ的原理、实验流程、优缺点及近几年的应用进展进行综述.
詹怿婕[7]2007年在《叁种软体动物大脑神经节的蛋白质组学的研究》文中提出蓝斑背肛海兔(Notarcus leachii cirrosus Stimpson, NLCS)、蓝无壳侧鳃海牛(Pleurobranchaea novaezealandiae Cheseman, PNC)和褐云玛瑙螺(Achatina fulica Férussac, AFF)均属于腹足纲软体动物,它们的中枢神经系统(central nervous system, CNS)组成与分布均较为相似。近10年来,在神经分子生物学研究领域中的许多突破性研究成果均取材于软体动物的CNS。本文,选用海兔(Aplysia)和同属于后腮亚纲的PNC的大脑神经节(cerebral ganglion, CG)为研究材料,开展了CG蛋白质组学及相关功能蛋白的研究。选用AFF作为实验材料,研究AFF受镉离子污染前后CG差异蛋白质组,筛选镉污染的生物标志蛋白,拟用于生物监测土壤中的重金属污染程度及危害性。本文所建立的分析技术和揭示的研究结果有助于科学地理解人类和高等动物神经系统的活动规律和调控机制,具有重要的科学意义。首先解剖分离NLCS的CG,经过裂解液溶解后离心得到蛋白样品。以IPG胶条作为第一向等电聚焦进行双向电泳,获得NLCS的CG全蛋白质图谱,并采用肽质量指纹技术鉴定CG的全蛋白质,初步构建了NLCS的CG分子解剖图谱。较好地鉴定了转录调节因子、肽酶等对维持CG的生理功能起到重要作用的功能蛋白。其次在同等条件下,比较NLCS和PNC的CG双向凝胶电泳图谱,发现了两者的CG全蛋白质之间存在着11个差异蛋白斑点,并对这些差异蛋白点进行逐一鉴定。对其中匹配率较高的蛋白质进行功能分析,发现只在PNC的CG中出现ATP合酶的β亚基,提示在PNC的CG中存在与其独特的生理活动和生物功能相关的蛋白。通过食物链和镉盐污染为途径,选用差异蛋白质组学技术分析AFF经镉盐污染后,它的CG所表达的差异蛋白质,发现且鉴定了29个差异蛋白斑点,其中部分差异蛋白质为热休克蛋白X类似蛋白酶、ABC转运器和ABC转运器底物结合蛋白,属于动物受镉盐污染后,神经系统产生的应急蛋白质。本论文所建立的蛋白质组学分析技术适合于筛选监测土壤中镉污染的动物神经系统的指示蛋白质。
于雁灵[8]2004年在《比较蛋白质组定量分析及其在疾病研究中的应用》文中认为蛋白质组学技术是生命科学中的分析化学的主要内容,是当前的研究前沿,是化学生物学近年来的新研究方向。本论文工作是在建立蛋白质组研究实验室的过程中,建立和发展了蛋白质组、比较蛋白质组和定量蛋白质组研究的相关技术平台,并将其应用于人类重大疾病的研究。定量蛋白质组学是通过某种方法或技术,对生物样品(细胞、组织或体液等)在某些过程中蛋白质的含量进行比较分析。从蛋白质组水平上对基因表达进行准确的定量分析,是比较蛋白质组学的重要内容,是当前研究重大疾病致病机制以及药理控制机制的必要手段及研究前沿。本论文工作的主要贡献是,建立了一套稳定可靠的蛋白质顺序提取-双向凝胶电泳分离-半自动胶上酶解-质谱鉴定的高通量技术分析平台;建立了一种新的、基于肽段乙酰基化的稳定同位素标记定量蛋白质组分析技术,并在实际生物样品体系中进行了验证;将建立、优化的蛋白质组定量分析技术应用于动脉粥样硬化、冠心病以及肝癌的复发转移相关的多个实际生物样品的比较分析,并从分子水平上评价了几种药物的药效。本文还研究了对基于生物素-抗生物素蛋白特异性结合的亲和色谱分离体系,结果显示该体系有望实现与乙酰基化同位素标记技术的有效对接,建立新的定量分析技术。一、在优化和发展传统双向凝胶电泳蛋白质组、比较蛋白质组方法的基础上,建立了蛋白质组顺序提取-双向凝胶电泳分离-半自动胶上酶解-质谱鉴定的高通量技术分析平台,为蛋白质组学方法学研究和应用研究奠定了实验基础鉴于蛋白质组的高度复杂性,在进行双向凝胶电泳前对蛋白质进行预分组是十分必要的。顺序提取按蛋白质溶解能力的不同将复杂的蛋白质组预分组,是目前常用的比较有效的样品预分组的方法之一。如何根据实验需求合理选择不同溶解能力的顺序提取液,不同的蛋白质提取液可否直接进行双向凝胶电泳分离并得到良好的分离效果等问题,是影响蛋白质组分析的重要因素。本论文提出了一套完整的蛋白质叁步提取方案,可以确保几乎所有的蛋白质进入相应的溶液中。其中,T1体系 (1 mmol/L PMSF的水溶液) 由于不含任何的蛋白质去垢剂、变性剂等,背景溶液组成简单,可以很方便地采取各种色谱分离的手段进行分离,也可以在直接补加一定量的蛋白质去垢剂、变性剂后采用双向凝胶电泳进行分离;T2 (7 mol/L 尿素,2 mol/L硫脲,2% CHAPS,2% SB3-10,
贾韦韬[9]2006年在《生物质谱新技术与新方法及其在蛋白质组学中的应用研究》文中研究说明本博士学位论文工作的主要贡献为：在蛋白质组学领域中关于低丰度蛋白和多肽除盐、富集的研究方面取得了创新性的进展：利用液滴内部的“Outward Flow”过程结合自制的多功能疏水性聚合物成功实现了一步高效靶上除盐与样品富集直接MALDI-MS分析，并成功应用到实际样品的蛋白质组学研究中；同时利用上述体系，使用阳离子型聚合物成功实现了对低丰度磷酸化肽段的靶上富集与除盐；首次利用聚合物-无机纳米复合材料成功实现了低丰度蛋白质／多肽的高效、快速和高回收率富集；参与研制成功了作为高效液相色谱检测器的电喷雾—四极杆—飞行时间质谱仪(ESI-Q-TOF-MS)，填补了国内空白。 蛋白质组学作为后基因组时代生命科学领域的热点，近年来得到了蓬勃的发展，已涉足生命科学中一系列前沿领域，并成为分析化学研究领域的最前沿课题。它的内容包括分离和分析细胞与组织的全部蛋白并直接找到一组或几组功能蛋白，研究它们与功能基因(组)的内在联系。蛋白质组研究具有观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化的独特优势，更接近生命现象的本质，在药靶研究中具有潜在价值，可通过对蛋白质性质、丰度的考察来揭示它的功能，进而找到与人类重大疾病相关的差异蛋白，使之成为诊断、治疗及药物筛选的靶分子。目前蛋白质组已被广泛用于研究各种疾病的发生、发展规律，并取得了很多重大的成就。 蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的发展，主要依赖于生物质谱技术的飞速发展以及高通量分离和分析技术的突破性进步。首先是质谱技术尤其是“软电离源”技术——电喷雾和基质辅助激光解析离子源的发展，使之成为检测微量甚至是痕量蛋白质分子的重要手段。高通量、高效的分离技术和大规模、高效率、高准确性地鉴定一个组织或细胞乃至亚细胞中的全部蛋白质以及利用稳定同位素标记方式与多维分离-串级质谱实现大规模的蛋白质定量分析也已经使得生物质谱成为实现这一目标的核心分析技术。生物信息学的建立形成了国际性的科学大协作。目前，世界各主要国家都不惜巨资进行蛋白质组的研究。蛋白质组学研究的进一步深入，将对了解疾病的发生和药物的筛选起到决定性的作用。 本博士学位论文工作主要是在化学系生物质谱实验室和生物医学研究院蛋白质组学研究中心完成的。由于传统的生物质谱技术平台已不足以应对蛋白质组学中低丰度蛋白检测的要求，所以研究和发展针对低丰度蛋白检测方面的新技术与新方法尤显得意义重大，本论文以此为切入点，研究了蛋白质组学分析中如何实现低丰度蛋白有效富集和除盐的问题，包括：利用疏水性聚合物微印迹技术实现的靶上一步除盐和样品富集技术；开展了靶上磷酸化肽段直接浓缩与除盐技术的研究；发展了利用聚合物-无机纳米复合材料实现的低丰度蛋白快速高效富集技术。又因为串级质谱的成功鉴定对于蛋白质组学研究也非常重要，所以本论文以一种含有多达28个氨基酸的复杂多肽为对象研究了如何对大质量多肽进行有效的串级质谱全序列分析；本论文作者还参与研制成功了作为高效液相色谱检测器的高分辩飞行时间质谱仪。 本论文共分六章，主要内容摘要如下： 第一章主要综述了蛋白质组学研究中的关键技术——生物质谱相关技术的发展及其在蛋白质组学中的应用。新的“软电离”方式——基质辅助激光解吸电离技术(MALDI)和电喷雾电离技术(ESI)的问世、质谱质量分析器的改善、各种分离技术如高效液相色谱／毛细管电泳等和质谱的联用、稳定同位素标记技术的发展及应用，使得生物质谱已成为蛋白质组学研究中无可替代的核心技术平台。生物质谱在对基因工程产物、功能蛋白及疾病相关蛋白的定性、定量分析中具有无可比拟的优越性，在蛋白的相互作用、蛋白质的折迭等动力学过程的研究中具有极大的潜力。而蛋白质组学作为一门新兴学科，它的发展现状和最新技术进展还包括双向凝胶电泳技术、色谱分离技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术和串联亲和纯化技术等。低丰度蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一，在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，然而其极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识，因此低丰度蛋白的有效浓缩与除盐是实现其准确分析和鉴定的重要条件，所以本章还综述了目前针对低丰度蛋白检测的技术，并提出了本课题工作的研究方向。 第二章研究工作主要涉及关于低丰度蛋白靶上一步除盐与富集直接MALDI-MS分析的新方法。这部分工作是通过将疏水性聚合物微印迹技术与基质辅助激光解析离子化质谱联用，巧妙利用液滴内部的“Outward Flow”效应，结合自制的多功能疏水性聚合物成功实现了痕量多肽的靶上一步除盐与富集。微印迹的疏水性聚合物对蛋白质和多肽有很好的吸附富集效果，但是对无机盐和其他污染物吸附很少，利用固体表面液珠蒸发过程中的外流作用，被疏水性聚合物吸附的样品无需额外的洗脱除盐步骤就可实现一步除盐并可直接进行MALDI-TOF-MS分析。本方法不仅成功实现了样品一步除盐与富集的特性，而且具有灵敏度高、重现性高、通量高、耐盐能力强、经济和省时等特点。可广泛用于蛋白质组学领域，大大拓展了疏水性聚合物的应用范围。此工作已显现出比传统商业Ziptip或ZipPlate除盐、富集系统更优秀的特性，并成功应用在我们课题组承担的国际人类蛋白质组人肝计划和中国人肝计划。 第叁章主要阐述了低丰度磷酸化肽段靶上浓缩与除盐—直接MALDI-MS分析的研究。蛋白质的翻译后修饰是目前蛋白质组研究中的一个重要课题，目前蛋白质组技术研究的主要目标之一是建立一套能快速、有效、高通量地分析鉴定发生翻译后修饰的蛋白质的方法技术。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式。蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢、肿瘤发生等。目前蛋白质组学方法中磷酸化蛋白、肽段的富集技术主要包括双向磷酸多肽谱图法、高分辨率的凝胶电泳法(2DE)、反相高效液相色谱法、固定化金属亲和色谱(IMAC)、抗体富集、化学标记富集等。磷酸化肽段的质谱检测难点主要在于其丰度低、动态的体内磷酸化过程、难于离子化、受其它高丰度的非磷酸化肽段信号的强烈抑制等原因。本论文采用一种阳离子性聚合物材料，结合第二章介绍的一步除盐与样品富集体系，在靶上有效富集了低浓度磷酸化肽段，大大简化了样品富集步骤。本方法可检测到10fmol／μL β-酪蛋白中的单磷酸化肽，并可得到很好的串级质谱信息。 第四章研究工作主要涉及一种以纳米碳酸钙球表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯组合材料(简称CaCO_3-PMMA)作为纳米吸附剂，进行痕量肽及蛋白样品的富集——伴随无固态颗粒化基质辅助激光解析离子源质谱直接分析的方法。此聚合物-无机纳米复合材料可对蛋白质和多肽进行快速高效富集，与基质辅助激光解吸离子源质谱有很好的相容性，吸附了样品的CaCO_3-PMMA在进入质谱分析前被巧妙的去核——从而避免固体颗粒对信号重现性的影响及其溅射对质谱仪器的损害。本方法操作简单，快速高效，既避免了常规吹干富集方法的样品损失问题，又具有很好的耐盐性。本方法可广泛适用于蛋白质组学相关领域，并大大拓展了聚合物-无机纳米复合材料CaCO_3-PMMA的应用范围。 第五章主要介绍了对含有28个氨基酸的复杂多肽的串级质谱全序列分析研究。对于含有太多氨基酸片断(大于20个)的多肽，很难利用传统的“从头测序”(de novo sequencing)方法进行测序，一方面，由于含有较多氨基酸，得到的串级质谱图往往碎片信息不完整，对谱峰归属造成很大困难，另一方面即使获得了较为完整的串级质谱图，实验室的服务器电脑无法对如此复杂的碎片峰进行合理归纳，往往会造成电脑超负荷运算陷入死循环。本章不仅利用串级质谱图成功鉴定了一种人工合成寡肽(28个氨基酸)的一级结构，并且详细考察了不同类型质谱仪器、不同碎裂方式、不同碎裂能量、不同激光能量、不同分析软件对于测序结果的影响，讨论了含有超过20个氨基酸片断的多肽获得合格串级质谱的条件，也为蛋白质组学研究工作如何制定有效的串级质谱策略提供了有力参考。 第六章主要阐述了作为高效液相色谱检测器的四极杆——飞行时间质谱仪(Q-TOF-MS)的研制工作。我们使用叁组功能不同的四极杆调制和传输离子，采用正负双脉冲推斥和离子垂直引入的方式将离子束引入到经过优化设计的二级有网式反射器，配合新颖的MCP安装方法和离子检测技术，并使用先进的叁级真空系统，最终实现了高灵敏度以及FWHM=11000的高分辨。
黄炎[10]2015年在《基于生物组学方法的纳米银细胞毒性机理研究》文中提出随着纳米粒子在生物医学领域中的应用日趋广泛,纳米粒子对人体健康的影响即纳米毒性引起了人们的密切关注。虽然研究者已采用多种方法从不同层面研究了纳米粒子的毒性,但目前人们对纳米粒子与活细胞的相互作用仍知之甚少,更重要的是采用动物整体实验、细胞学实验和传统分子生物学方法不能系统全面地解释纳米粒子与细胞相互作用的机理。高通量生物组学技术(基因表达谱芯片技术、蛋白质组学技术、SOLiD测序技术等)的快速发展为全面、系统地在分子水平上研究纳米粒子毒性机理提供了新方法和新技术手段。但迄今为止,对纳米粒子作用后引起的细胞中基因、蛋白质、microRNA表达谱的变化都是采用单一的生物组学方法分别进行研究的,因此只能获知纳米粒子对细胞影响的一个方面,而无法对纳米粒子的毒性进行系统整体的分析。纳米银由于效果强、杀菌光谱,在医学领域获得了广泛的应用,但由于纳米银对生物系统影响的复杂性,其毒性作用还有许多方面未被揭示。目前已有研究者开始研究纳米银对细胞内基因、蛋白质表达谱的影响,但尚未见对细胞中microRNA表达谱影响的报道,也未见联合多种生物组学方法系统研究纳米银毒性机制的报道。本论文将通过对将基因、microRNA、蛋白质表达数据的联合分析,探讨microRNA在纳米银对人皮肤成纤维细胞毒性中的调控机制。本论文的具体内容如下：1、采用硼氢化钠还原硝酸银的方法制备纳米银,通过调节硼氢化钠的浓度和改变溶剂的种类制备一系列纳米银溶液。紫外可见分光光度计和透射电镜表征结果显示,还原剂的浓度和溶剂的种类均会影响纳米银的大小和形状。用二蒸水制备的纳米银形状均一,大部分呈球形。为了获得实验用20nm的纳米银,确定以二蒸水为溶剂、浓度为2mM的硼氢化钠和硝酸银溶液进行制备。2、采用MTT法、实时细胞电阻抗仪、光学显微镜、荧光显微镜和扫描电镜对纳米银对人皮肤成纤维细胞增殖和形貌的影响进行分析,采用流式细胞术研究纳米银对细胞周期和细胞凋亡的影响,进一步采用原子吸收光谱仪分析纳米银在细胞中的摄取。结果显示,低浓度的纳米银(1、10、50、100μM)作用细胞72h内,细胞毒性均为0级,高浓度纳米银(200、300μM)在作用细胞48h后均出现1级细胞毒性,且细胞的规则排列发生变化。而200μM纳米银作用细胞1、4、8h时虽未产生细胞毒性,影响细胞形态,但已使细胞滞留于DNA合成期,且在8h时纳米银对细胞周期和凋亡的影响最为显着。此外,随着作用时间的增加,细胞中摄取的纳米银量显着升高。3、采用基于二维差异凝胶电泳分离技术和质谱鉴定的蛋白质组学技术研究200／μM纳米银作用1、4、8h后人皮肤成纤维细胞中的蛋白质表达谱,筛选获得25种在叁个时间点均发生差异表达的功能蛋白质,其中发生上调表达的蛋白质19种,发生下调表达的蛋白质4种,既有上调又有下调的蛋白质2种。进一步采用Cluster & Treeview, Gosurfer、GenMAPP、Ingenuity Pathway Analysis软件对差异表达蛋白质进行聚类、Gene Ontology (GO)功能分类、生物学通路和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析,发现25种差异表达蛋白质影响多个GO功能类别,并参与31条生物学通路和4个蛋白质相互作用网络。纳米银可能影响细胞信号传导、细胞骨架、细胞粘附、细胞能量代谢、mRNA加工等功能,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。4、采用SOLiD测序技术分析2001μM纳米银对人皮肤成纤维细胞中microRNA表达谱的影响,在1、4、8h叁个时间点分别获得59、143和142个差异表达microRNA,其中不重复的共有246个。进一步使用miRanda、TargetScan和PicTar叁种方法同时对差异表达microRNA进行靶基因预测,在叁个时间点分别获得1747个、2928个和2667个靶基因,其中不重复的共有3594个。生物信息学分析发现,差异表达microRNA靶基因显着影响171、272、233个生物学过程、分子功能和细胞组分第叁层次的功能类别,并参与120、132和129条生物学通路,其功能涉及细胞粘附、细胞骨架、细胞凋亡、细胞周期、炎症反应等。5、将纳米银作用细胞后的蛋白质表达数据和本课题组前期获得的基因表达数据进行比较,发现两者在种类、数量和表达模式上都存在明显差别。对比差异表达基因、microRNA和蛋白质涉及的GO生物学过程功能类别和参与的生物学通路,发现叁者之间存在差异。通过联合分析microRNA、基因和蛋白质表达数据,在1、4、8h叁个时间点分别匹配到具有生物学意义的microRNA-靶基因作用对36、429、116个,microRNA-靶蛋白质作用对2、1、3个,包含的靶基因和靶蛋白质有28、186和82个,不重复的共257个。在匹配到的microRNA-靶基因／靶蛋白质对找到对应3个基因／蛋白质对的6个microRNA,而靶基因-蛋白质对的表达分别受多个microRNA的共同调控,microRNA本身的表达方式也会影响其对靶基因／靶蛋白质的调控效果,microRNA可通过降解mRNA和抑制翻译两种方式发挥对靶基因-蛋白质对的调控作用。对257个microRNA靶基因／靶蛋白质的生物信息学分析显示,其功能主要与细胞通讯和细胞代谢过程有关,并且参与57条生物学通路。而差异表达nicroRNA和调控的靶基因-蛋白质对共同参与4条主要的生物学通路,即“肌动蛋白细胞骨架的调节”、“肝细胞生长因子受体”、“胰岛素信号”和‘'MAPK信号通路”。纳米银可能通过差异表达microRNA调控这4条通路中的靶基因和靶蛋白质,最终导致细胞骨架的破坏、ATP水平的降低和细胞凋亡的产生。6、采用Western blot和qRT-PCR对选定的4种蛋白质和8个microRNA的表达值进行测定,证实纳米银与细胞作用的蛋白质组学和nicroRNA测序实验结果的可信性。进一步采用肌动蛋白细胞骨架染色试剂盒、ATP检测试剂盒和Hoechst荧光染色法对纳米银作用1、4、8、24、48和72h后细胞骨架、细胞内ATP含量和细胞凋亡进行分析,证实生物信息学分析结果,证明纳米银主要通过破坏细胞骨架、降低ATP水平和诱导细胞凋亡这叁个方面的作用引起人皮肤成纤维细胞毒性。7、采用SOLiD测序技术分析200μM纳米金对人皮肤成纤维细胞中microRNA表达谱的影响,在1、4、8h叁个时间点分别获得109、78和124个差异表达]microRNA。进一步使用miRanda, TargetScan和PicTar同时对差异表达microRNA进行靶基因预测,在叁个时间点分别获得2403个、2044个和3002个靶基因,这些靶基因显着影响208、193、249个生物学过程、分子功能和细胞组分第叁层次的功能类别,并参与126、125和129条生物学通路。通过联合分析microRNA、基因和蛋白质表达数据,在1、4、8h叁个时间点分别匹配到具有生物学意义的microRNA-靶基因／蛋白质作用对132、38、137个,包含的不重复的靶基因和靶蛋白质共187个。对匹配的187个microRNA靶基因／靶蛋白质的生物信息学分析显示,其功能主要与细胞代谢过程有关,并且参与71条生物学通路。而差异表达microRNA和调控的靶基因-蛋白质对共同参与2条主要的生物学通路,即"mRNA加工”和"MAPK信号通路”。纳米金可能通过差异表达microRNA调控这2条通路中的靶基因和靶蛋白质,影响细胞周期但抑制细胞凋亡。8、从细胞水平、蛋白质水平和microRNA水平对纳米银与纳米金对人皮肤成纤维细胞的影响进行比较。结果发现,这两种纳米粒子对细胞增殖、细胞周期、细胞骨架、氧化应激、能量代谢、细胞凋亡等方面的影响均存在差异。进一步在蛋白质水平上的比较发现,这两种纳米粒子诱导的差异表达蛋白质中相同的只有5种,生物学过程、分子功能、细胞组分分类中包含蛋白质最多的类别基本相同,而纳米银影响的通路数量(31条)多于纳米金(24条)。在]microRNA水平上的比较显示,纳米银和纳米金作用细胞后差异表达microRNA的种类、靶基因／靶蛋白质功能、参与的生物学通路和对生物学通路的影响均不同。与纳米银相比,纳米金影响细胞周期,减弱对ATP合成的抑制和对细胞骨架的损伤,并抑制细胞凋亡的产生,最终未产生细胞毒性。而两种纳米粒子作用后细胞中活性氧水平的差异与纳米金无细胞毒性而纳米银诱导产生细胞毒性有关。
参考文献：
[1]. 双向凝胶电泳技术研究及其在蛋白质组学中的应用[D]. 袁泉. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2004
[2]. 基于纳米金刚石的蛋白质组学新技术和新方法研究[D]. 魏黎明. 复旦大学. 2011
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[4]. 基于功能磁性材料的蛋白质组学分离鉴定新方法研究[D]. 徐秀青. 复旦大学. 2007
[5]. 多维液相色谱-质谱联用技术在蛋白质组学中的应用[D]. 靳文海. 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）. 2005
[6]. iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用[J]. 谢秀枝, 王欣, 刘丽华, 董世雷, 皮雄娥. 中国生物化学与分子生物学报. 2011
[7]. 叁种软体动物大脑神经节的蛋白质组学的研究[D]. 詹怿婕. 厦门大学. 2007
[8]. 比较蛋白质组定量分析及其在疾病研究中的应用[D]. 于雁灵. 复旦大学. 2004
[9]. 生物质谱新技术与新方法及其在蛋白质组学中的应用研究[D]. 贾韦韬. 复旦大学. 2006
[10]. 基于生物组学方法的纳米银细胞毒性机理研究[D]. 黄炎. 东南大学. 2015
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