中国沿海重要赤潮藻多重PCR检测技术的建立

论文摘要

近年来,我国沿海有害藻类水华频发,给海洋生态环境、人类健康和公众财产造成了重大威胁,及时预警和监测有害藻类水华的发生迫在眉睫。然而,赤潮微藻的体型较小、分类学复杂,不容易进行区分。传统的显微镜检测方法费时费力且准确度不高,且海洋自然环境中的有害藻种多种多样,有必要开发一种可并行检测多种有害微藻的方法。因此,本研究建立了一种能同时检测六种微藻的检测方法——多重PCR（mutiplex PCR,m PCR）检测技术。本研究以中国沿海常见藻华形成种,包括东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense,Pd）、骨条藻（Skeletonema spp.,Ss）、米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi,Km）、锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea,St）、海洋卡盾藻（Chattonella marina,Cm）和剧毒卡尔藻（Karlodinium veneficum,Kv）为目标,建立了一种能同时识别这些藻种的的多重PCR检测技术。首先通过克隆测序对6个目标藻种进行分子鉴定。提取目标藻种基因组DNA,对其转录内间隔区（internal transcribed spacers,ITS）或者核糖体大亚基（large subunit,LSU）D1-D2区进行PCR扩增。扩增产物进行切胶回收,经转化与载体连接,导入感受态细胞中进行克隆,筛选阳性克隆菌株送去测序公司测序。将所得结果在NCBI上进行比对分析,确定其为目标藻种。根据比对结果,从Genebank中下载亲缘关系较近的同属藻种或者相似度较高的藻种序列。在Bioedit上将下载的序列与目标藻种的序列进行比对分析,目测找到种或者属特异性区域,用Primer Premier 5.0软件设计符合要求的特异性引物。设计的各目标藻的特异性引物通过与25种我国沿海常见的微藻进行交叉扩增测试,结果证明各引物特异性良好。m PCR的特异性引物分别靶向目标藻种的ITS rDNA或LSU rDNA基因序列设计,扩增目的片段大小分别为437 bp、343 bp、254 bp、198 bp、137 bp和83 bp。初步建立m PCR体系,对反应条件进行了优化,确定最佳参数如下:Kv、Cm、Ss、St、Km和Pd的引物浓度分别为0.10μM、0.15μM、0.10μM、0.15μM、0.20μM和0.20μM;Mg2+浓度,3.5 m M;d NTP浓度,0.6 m M;Taq聚合酶浓度,0.10 UμL-1;退火温度,52°C。后续实验均由优化后的m PCR体系进行。通过在m PCR扩增体系中加入不同目标藻种的DNA模板的组合,进一步证实m PCR体系具有特异性。干扰扩增测试表明,m PCR扩增体系不受背景DNA浓度的影响。灵敏度测试表明,m PCR对Kv、Cm、Km和Pd的最低检测极限为0.6 ngμL-1,对Ss和St的最低检测极限为0.06 ngμL-1。模拟自然水样测试表明,Km、Pd和Kv的最低检测极限为60 cells m L-1,Cm、Ss和St的最低检测极限为6cells·m L-1。通过对从东海采集的野外样品进行的自然水样检测,进一步证实了m PCR体系的准确性和实用性。本研究建立的m PCR具有多重分析的特点,特异性强,检测体系稳定,可作为这些藻种的形态鉴定法的重要补充。

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摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 赤潮概述

1.1.1 赤潮的定义及危害

1.1.2 赤潮的形成原因

1.2 赤潮的检测

1.3 mPCR技术及其国内外研究现状

1.3.1 mPCR技术的原理

1.3.2 mPCR技术的国内研究进展

1.3.3 mPCR技术的国外研究进展

1.4 本课题研究内容及意义

1.4.1 研究内容

1.4.2 研究意义

第2章用于mPCR技术研究目标藻种的确定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验藻种与培养条件

2.2.2 主要试剂

2.2.3 培养基及溶液配制

2.2.4 实验仪器

2.2.5 微藻基因组DNA的提取

2.2.6 微藻基因组DNA的质量测定

2.2.7 目标藻ITS或 LSU序列的PCR扩增

2.2.8 扩增产物的纯化回收

2.2.9 扩增目标片段的T-A克隆

2.2.10 序列的比对分析

2.3 结果

2.3.1 基因组DNA的提取结果

2.3.2 基因组DNA的质量检测结果

2.3.3 ITS区和LSU rDNA D1–D2区基因的扩增

2.3.4 目标藻PCR产物纯化回收

2.3.5 菌落PCR结果

2.4 讨论

2.5 小结

第3章特异性引物设计及特异性验证

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 试剂及仪器

3.2.3 mPCR特异性引物的设计

3.2.4 mPCR引物的特异性验证

3.3 结果

3.3.1 引物序列比对结果

3.3.2 特异性引物设计结果

3.3.3 mPCR引物的特异性验证结果

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 mPCR检测体系的优化

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 藻种及培养条件

4.2.2 试剂及仪器

4.2.3 引物的单一PCR验证

4.2.4 mPCR反应体系的初步建立及反应条件的优化

4.3 结果

4.3.1 单重PCR扩增结果

4.3.2 mPCR体系的初步建立

4.3.3 mPCR体系反应条件的优化

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 mPCR检测技术的灵敏度及实用性验证

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 藻种及培养条件

5.2.2 试剂及仪器

5.2.3 mPCR体系的特异性验证

5.2.4 mPCR体系扩增稳定性测试

5.2.5 mPCR的检测灵敏度测试

5.2.6 应用mPCR对模拟自然水样进行检测

5.2.7 应用mPCR对野外样本进行检测

5.3 结果

5.3.1 mPCR引物的特异性验证结果

5.3.2 mPCR体系的扩增稳定性验证

5.3.3 mPCR的灵敏度测试结果

5.3.4 模拟自然水样检测结果

5.3.5 野外样品检测结果

5.4 讨论

5.5 小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙艳杰

导师: 郭长禄

关键词: 有害藻类水华,有害微藻,多重,检测

来源: 哈尔滨工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 海洋学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 哈尔滨工业大学

分类号: X55;X834

DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.005499

总页数: 74

文件大小: 1962k

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