肖希斌[1]2003年在《当归多糖对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞的影响》文中研究指明目的：探讨当归多糖对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞的影响。方法：取慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓单个核细胞，分别予粒—巨噬集落刺激因子（GM-CSF）、白介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)常规培养或联合当归多糖（APS）培养，共分6组：对照组（未加细胞因子和当归多糖）；常规处理组（IL-4/GM-CSF/ TNF-α）；小剂量当归多糖组（IL-4/GM-CSF/50mg/L APS），中剂量当归多糖组（IL-4/GM-CSF/100mg/L APS），大剂量当归多糖组（IL-4/GM-CSF/200mg/L APS），超大剂量当归多糖组（IL-4/GM-CSF/400mg/L APS）。利用普通光镜和电镜观察细胞形态，台酚蓝拒染法检测细胞成活率，流式细胞仪检测树突状细胞的免疫表型（CD80，CD86，CD83），自体或异体混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激T淋巴细胞的增殖能力。结果：常规培养的和加入当归多糖诱导培养的慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞均表现出典型的树突状形态。与常规处理组比较，加入当归多糖组的细胞成活率和增殖能力显着提高，CD83、CD80、CD86表达显着升高，当归多糖组CML-DC刺激T淋巴细胞的增殖能力更强。结论：当归多糖组培养的树突状细胞CD83、CD80、CD86表达率明显高于常规处理组。加入当归多糖诱生的CML-DC刺激淋巴细胞增殖能力强于常规处理组。当归多糖能促进IL-4和GM-CSF对 CML-DC的诱生与成熟。
陈国安, 肖希斌, 袁利亚, 戎吉平[2]2004年在《当归多糖促进慢性粒细胞白血病细胞性树突状细胞的诱导生成》文中进行了进一步梳理目的 探讨当归多糖 (APS)对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞 (DCs)的影响。方法 取慢性粒细胞白血病 (CML )患者骨髓单个核细胞 ,分别予粒 -巨噬集落刺激因子 (GM- CSF) /白介素 - 4 (IL - 4 )培养或GM- CSF/ IL- 4联合各浓度 APS(5 0 ,10 0 ,2 0 0 mg/ L)培养 ,普通光镜和电镜观察细胞形态 ,台盼蓝拒染法检测细胞成活率 ,流式细胞仪检测 DCs的免疫表型 (CD80 ,CD86 ,CD83) ,自体或异体混合淋巴细胞反应检测 DCs刺激 T淋巴细胞的增殖能力。结果 GM- GSF/ IL - 4或 GM- CSF/ IL - 4 / APS诱导培养的慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞均表现出典型的树突状形态而且表达高水平的免疫表型。GM- CSF/ IL- 4 / APS培养的 DCs的细胞成活率和增殖能力显着提高 ,CD83,CD80 ,CD86 表达显着升高 ,APS组慢性粒细胞白血病细胞诱导的树突状细胞 (CML - DCs)刺激 T淋巴细胞的增殖能力更强。结论 GM- CSF/ IL- 4 / APS培养的 DCs的 CD83、CD80 、CD86 表达率明显高于 GM-CSF/ IL - 4组。 GM- CSF/ IL - 4 / APS诱生的 CML - DCs刺激 T淋巴细胞增殖能力强于 GM- CSF/ IL - 4组。 APS能促进 IL- 4和 GM- CSF对 CML- DCs的诱生与成熟。
黄丹菲[3]2009年在《植物活性多糖对小鼠树突状细胞和巨噬细胞功能的调节作用》文中研究说明自然界中植物种类多种多样,具有免疫调节作用的药用植物也是数量繁多,如果能将其中起主要作用的有效成分分离出来,研究其理化性质及作用机理,对于植物功能性因子的研究及相应功能食品的开发将具有非常重要的意义。抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APCs)主要承担对抗原物质的摄取,加工,并将抗原肽呈递给特异性T淋巴细胞,是启动免疫应答的关键因素。树突状细胞(dendritic cells,DCs),是目前已知功能最强的专职APCs,具有诱导初次免疫应答的独特功能,能有效刺激初始型T细胞(na(l|¨)ve T cells)增殖,在机体细胞免疫和体液免疫调控中具有独特的地位;巨噬细胞作为宿主天然免疫防御阵线的重要成员在先天性免疫防御和获得性免疫应答中同样起着不可忽视的作用。为探讨中药植物的免疫增强药理机制,本研究初步建立了以小鼠骨髓来源DCs为靶细胞的植物化学物免疫活性筛选模型,在细胞水平初步探讨了大粒车前子精制多糖(crude polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.,PL-PS)、大粒车前子多糖纯品(polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.,PLP)、毛蕊花苷(acteoside)、异毛蕊花苷(isoacteoside)、茶叶糖蛋白(tea glycoprotein,TGP)、青钱柳多糖(polysaccharides from Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja,CPC)的免疫调节功能。在此基础上,进一步研究了大粒车前子多糖PL-PS及PLP对小鼠骨髓来源DCs的分化、发育、成熟、迁移等方面的影响,并初步探讨了PL-PS对同为APCs的巨噬细胞功能的影响,为车前子产品开发提供理论依据。现将本文主要研究结果归纳如下:1.探讨了PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和异毛蕊花苷对DCs前体细胞的细胞毒性。采用倒置显微镜观察细胞形态;用MTT法检测对细胞生长的增殖率;流式细胞仪测定细胞的早期凋亡。结果发现经各植物化学物处理后DCs前体细胞生长良好、细胞生存率高,对DCs前体细胞凋亡无明显影响,青钱柳多糖、毛蕊花苷和异毛蕊花苷对小鼠DCs前体细胞具有显着地促进增殖作用,提示青钱柳多糖、毛蕊花苷和异毛蕊花苷对小鼠DCs前体细胞的影响有可能通过直接诱导扩增及增强其细胞生物活性而发挥。实验结果发现本研究所采用的各植物化学物均无细胞毒性,可用于后续实验,并为临床应用及食用安全提供理论依据。2.建立了DCs为靶细胞的植物化学物活性筛选模型。参照经典文献,结合国际上研究现状,采用手法分离纯化小鼠骨髓细胞,联合rmGM-CSF和rmIL-4诱导分化培养5天后,用MACS免疫磁珠法对细胞进行进一步纯化。通过采用各种形态学方法观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表面分子表达对细胞进行鉴定,结果发现该方法可以获得大量稳定的高纯度DCs,可用于后续植物化学物的免疫活性筛选。3.应用已建立的以DCs为靶细胞的活性筛选模型,初步探讨了PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和异毛蕊花苷的免疫调节活性。采用倒置显微镜观察,发现DCs经PLP、CPC、PL-PS、TGP诱导后,细胞周围突起增多,细胞体积增大,形态更加典型。经毛蕊花苷和异毛蕊花苷刺激24 h后,与阴性对照组相比,细胞成团数量有所增加。MTT法检测各植物化学物对DCs增殖的影响,发现大部分植物化学物在相应的浓度范围内,对DCs的生长无显着影响;毛蕊花苷和异毛蕊花苷可促进DCs的增殖。流式细胞仪检测各植物化学物对DCs表型和吞噬功能的影响,发现与目前公认具有免疫促进功效并已应用于肿瘤辅助治疗的香菇多糖相似,PLP、PL-PS、毛蕊花苷和异毛蕊花苷在浓度为50μg/mL,TGP和CPC在浓度为100μg/mL时均可增强CD11c阳性细胞表达MHCⅡ分子。并且发现经各植物活性提取物诱导后DCs吞噬荧光标记的葡聚糖的能力下降。研究结果初步发现PLP、CPC、PL-PS、TGP、毛蕊花苷和异毛蕊花苷均具有促进DCs表型及功能成熟的作用,从而为后续进一步实验提供理论依据。4.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs表型及吞噬功能的影响。采用流式细胞分析技术分析不同剂量PL-PS和PLP对DCs表面MHCⅡ、CD80、CD86及CD40表达水平的影响。结果发现PL-PS和PLP均可促进MHCⅡ、CD80、CD86和CD40的表达,在10～200μg/mL浓度范围内,呈剂量依赖关系。且PL-PS、PLP同剂量组相比,在对CD86分子表达上,PL-PS高、中剂量组比同剂量组的PLP强(p＜0.05),在对CD80的影响的表达上,PL-PS低剂量组比同剂量组的PLP强(p＜0.05)。空白组DCs吞噬FITC标记的葡聚糖功能很强,而经不同剂量PL-PS,PLP处理后DCs的吞噬活性均明显下降。再次提示大粒车前子多糖可促进小鼠骨髓来源DCs表型及功能的成熟,并且这一促进功能在10～200μg/mL浓度范围内,呈剂量依赖关系。5.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs分泌功能的影响。采用Griess法检测各组DCs分泌NO的量;双抗体夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养液上清中细胞因子IL-12p70、IL-10、IL-1β及趋化因子RANTES的含量。结果发现,PL-PS及PLP能够诱导未成熟DCs分泌Th1型细胞因子IL-12p70和IL-1β,对Th2型细胞因子IL-10则具有显着抑制作用(p＜0.05),并且这种刺激作用具有剂量依赖性,与同剂量的PLP相比,25μg/mL PL-PS可显着降低IL-10的产生(p＜0.05)。PL-PS及PLP能够刺激未成熟DCs分泌RANTES-Th1型趋化因子,而且这种促进作用在PL-PS浓度为25μg/mL时最显着(p＜0.05)。由此可见,PL-PS及PLP可以通过调节DCs分泌不同类型的细胞因子及趋化因子,诱导机体偏向Th1型细胞免疫应答,以及促进机体天然免疫向获得性免疫过渡。6.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs刺激T细胞功能的影响。采用MTT法检测PL-PS及PLP对DCs刺激OVA未致敏或致敏淋巴细胞增殖的影响,发现PL-PS和PLP均可增强树突状细胞的刺激未致敏和致敏淋巴细胞增殖的能力,说明经PL-PS或PLP刺激后,树突状细胞诱导免疫应答及抗原提呈功能均增强。提示在适宜的T:DCs比时,PL-PS与PLP的作用一致,均能促进DCs对T细胞增殖的刺激作用。7.探讨了不同剂量大粒车前子多糖PL-PS及PLP对DCs趋化功能的影响。采用半定量PCR法检测了DCs表面趋化因子受体CCR7 mRNA的表达水平。结果发现PL-PS或PLP均可影响DCs表面趋化因子受体CCR7的表达。其中,与阴性对照相比,PL-PS在浓度为100μg/mL,PLP在浓度为50μg/mL和100μg/mL时,可显着提高DCs表面CCR7的表达(p＜0.01)。可以推测PLP或PL-PS对DCs的促成熟作用可能与趋化因子受体的表达有关。8.初步探讨了大粒车前子多糖对DCs抗小鼠SP2/0骨髓瘤功能的影响。选取小鼠骨髓瘤细胞制备冻融抗原,使小鼠骨髓来源DCs负载SP2/0细胞冻融抗原,致敏T淋巴细胞,产生CTL,诱导出的T淋巴细胞对SP2/0细胞有明显CTL活性,而PL-PS及PLP的干预可促进这一功能的提高。所以大粒车前子多糖抗肿瘤机制与促进DCs抗原呈递能力有密切的关系,可提高机体对肿瘤细胞的特异性主动免疫功能。9.探讨了大粒车前子多糖对小鼠巨噬细胞功能的影响。采用倒置显微镜、MTT法、Griess法、流式细胞术及ELISA法探讨了大粒车前子多糖对RAW264.7细胞株及小鼠腹腔巨噬细胞的影响。结果发现:PL-PS能刺激RAW264.7细胞株和小鼠腹腔巨噬细胞生成NO;促进RAW264.7细胞表面CD80、CD86、CD40的表达及TNF-α、IL-1β的分泌,并能促进腹腔巨噬细胞IL-10的分泌。提示大粒车前子多糖的免疫调节活性也与其对巨噬细胞的作用相关。上述结果提示:植物化学物的免疫调节可通过建立的以小鼠骨髓来源DCs为靶细胞的模型来进行初步的筛选和探讨。大粒车前子多糖PL-PS及PLP可通过促进DCs表面MHCⅡ类分子,共刺激分子的表达及Th1型细胞因子的分泌,刺激T淋巴细胞的增殖,诱导Th1型免疫应答并增强CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤活力。并通过促进DCs表面趋化因子受体CCR7 mRNA的表达,促进DCs的移行和发育成熟。说明PL-PS及PLP均作用于DCs,通过对DCs移行、成熟、功能的上调作用而促进免疫应答的启动,增强机体的免疫功能。另外,PL-PS也可通过对巨噬细胞的作用来调节机体免疫应答。
阮旭东, 欧阳学农[4]2009年在《中药增强树突状细胞功能的研究进展》文中指出树突状细胞是功能强大的抗原提呈细胞,在介导机体的免疫反应、抵御恶性肿瘤中发挥重要作用。中药作为免疫调节和促进剂,在提高机体免疫功能、抗肿瘤方面起到不可忽视的作用。近年来,对中药促进树突状细胞功能方面的研究逐渐开展,主要集中在调节表面分子、细胞因子、淋巴细
黄晖蓉[5]2006年在《乳腺癌多药耐药细胞株及敏感株抗原致敏树突状细胞介导的特异性抗肿瘤免疫研究》文中指出目的 树突状细胞(Dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强的专职性抗原呈递细胞(Antigen-presenting Cells,APC),是激发特异性免疫应答的中心环节和抗肿瘤免疫的重要载体。以DC为基础的肿瘤疫苗在部分恶性肿瘤的治疗中已显示出良好的效果。肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)是临床肿瘤化疗失败的主要原因之一,大量研究证实肿瘤的生物治疗对机体而言更为安全,不像化疗、手术、放射等方法杀伤肿瘤的同时也大量杀伤了正常细胞。因此我们设想是否能将P-gp作为肿瘤免疫治疗的靶点,将其高表达的MDR肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏DC,诱导产生P-gp特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应?以及产生的特异性CTL反应与药物敏感肿瘤细胞抗原致敏的DC所诱导的CTL反应有何不同?故此,本实验拟用人乳腺癌P-gp高表达耐药细胞株MCF-7/ADR及其敏感株MCF-7肿瘤冻融抗原冲击致敏DC,探讨其对杀瘤活性的影响。 方法 采集健康供者骨髓血,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,应用重组人粒/单细胞集落刺激因(rhGM-CSF,1000U/ml)、重组人白介素-4(rhIL-4,500U/ml)和重组人肿瘤坏死因子-a(rhTNF-a,100ng/ml)联合培养体系诱导骨髓单个核细胞产生DC,再以人乳腺癌P-gp高表达耐药细胞株MCF-7/ADR及其敏感株MCF-7肿瘤冻融抗原冲击致敏DC,以光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪(FACS)检测细胞免疫表型,MTT法检测DC诱导CTL增殖及体外效应细胞杀伤活性。 结果 骨髓单个核细胞(BMMNC)经体外扩增培养后,具有典型的树突状形态特征,流式细胞仪检测细胞表面CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR表达率均较培养前明显增高(P<0.01),经抗原负载的DC能有效地激发外周血单个核细胞(PBMNC)中CD8~+T细胞增殖(P<0.01)。MCF-7/ADR-DC及
黄文强, 宋晓平[6]2008年在《多糖对树突状细胞功能的影响》文中进行了进一步梳理树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前已知机体内功能最强的抗原递呈细胞,也是惟一能启动初始T细胞介导免疫反应的一类细胞。论文综述了多糖对DC功能的影响,多糖能够刺激DC分裂增殖,同时能够显着地诱导DC成熟,能够有效增强DC表面分子表达与增强细胞因子分泌的能力,从而促进DC的抗原递呈能力。
阮旭东[7]2009年在《肺泰胶囊对Ⅳ期NSCLC化疗期间树突状细胞功能影响的研究》文中提出目的:探讨Ⅳ期非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)患者使用NP方案化疗期间,肺泰胶囊对外周血树突状细胞(Dendritic Cell,DC)功能的影响。方法:选取Ⅳ期NSCLC患者60例,随机分为实验组和对照组(各30例)。实验组采用肺泰胶囊联合NP方案治疗,对照组采用单纯NP方案化疗。治疗前、一周期治疗后、两周期治疗后分别采用流式细胞仪检测两组患者外周血DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的数值。结果:治疗前,两组无论是在年龄、性别、病理类型、初治、复治、转移部位、卡氏评分、外周血中的CD83、CD86、HLA-DR等的构成上,统计学无显着差异。比较治疗前、一周期治疗后及两周期治疗后发现,实验组和对照组外周血DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR均有所升高,统计学有显着差异。其中CD83、CD86实验组明显优于对照组,且呈时间依赖性,统计学有显着差异(P=0.013,P=0.019);HLA-DR实验组虽略优于对照组,但统计学无显着差异(P=0.232)。亚组分析显示,无论是实验组还是对照组,临床治疗有效的患者其外周血DC表面分子升高的幅度远远高于进展组(P＜0.05)。结论:1.肺泰胶囊联合化疗可以进一步促使外周血DC成熟,并增强其抗原提呈功能,从而增强机体的抗肿瘤免疫作用,而且呈时间依赖性;2.肺泰胶囊可以提高Ⅳ期非小细胞肺癌患者化疗后的生活质量及免疫功能,但不能提高NP方案近期的有效率。
唐永富[8]2007年在《车前子毛蕊花苷类对树突状细胞表型和功能的影响》文中指出车前子为车前科(Plantaginaceae)植物车前(Plantago asiatica L.)的干燥成熟种子。车前科有叁属,约270种,我国只有车前(Plantago asiatica L.)一属约17种。我国药典记载,车前药用的只有两种,即车前(Plantago asiatica L.,又称大粒车前)和平车前(Plantago.depressa Willd.,又称小粒车前)。我省吉安、泰和一带是大粒车前子的主产地。我国古代文献记载的临床应用提示车前具有补益强身、防病健身之功效。近年来许多学者对车前子的活性成分进行了研究,发现车前子中含有环烯醚萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、多糖等多种活性成分。为了从免疫学角度阐述车前子补益强身、防病健身的药理机制,本研究从车前子中分离纯化出两种苯乙醇苷类物质一毛蕊花苷和异毛蕊花苷,建立了以树突状细胞为靶细胞的植物化学物免疫活性筛选模型,进一步研究了毛蕊花苷和异毛蕊花苷对小鼠骨髓来源树突状细胞表型和功能的影响,旨在初步探讨毛蕊花苷和异毛蕊花苷的免疫调节机制,为车前子产品开发提供理论依据。同时本研究建立的以树突状细胞为靶细胞的植物化学物免疫活性筛选模型可为免疫活性筛选研究提供新的思路。现将本文主要研究结果归纳如下;1.对车前子毛蕊花苷和异毛蕊花苷的分离纯化进行了研究。采用AB-8型大孔树脂吸附结合制备液相色谱技术从车前子中分离纯化得到2个苯乙醇苷类单体-毛蕊花苷和异毛蕊花苷,经测定车前子中含量分别为8.65mg/g和1.36mg/g,HPLC分析得知其纯度均在95%以上,样品内毒素含量分别为0.92ng/mg和1.27ng/mg。研究表明,毛蕊花苷和异毛蕊花苷其纯度及内毒素含量均能达到要求,可用于活性研究。2.建立了树突状细胞为靶细胞的植物化学物活性筛选模型。参照经典文献,结合国际上现在的研究现状,采用手法分离纯化小鼠骨髓细胞,并用rmGM-CSF和rmlL-4的诱导分化成未成熟的DCs,培养6-7天后树突状细胞的纯度达到80%以上。研究表明,此方法简单,实验可靠,能够稳定获得树突状细胞,可以用于植物化学物活性筛选。3.应用建立的活性筛选模型,以树突状细胞为靶细胞,研究了毛蕊花苷和异毛蕊花苷的免疫调节活性。采用倒置显微镜观察,发现树突状细胞经毛蕊花苷和异毛蕊花苷诱导后,细胞周围突起增多,细胞体积增大,形态更加典型。MTT法检测对树突状细胞增殖的影响,发现在1μg/mL～100μg/mL的浓度范围内,毛蕊花苷和异毛蕊花苷均可促进树突状细胞的增殖,当单独使用药物而不加相应的细胞因子时亦出现很强的促进增殖的作用。流式细胞仪检测对树突状细胞表型和吞噬功能的影响,发现毛蕊花苷和异毛蕊花苷均可促进CD11c~+MHCⅡ~+双阳性细胞的表达,同时以树突状细胞标志分子CD11c~+设门,发现毛蕊花苷和异毛蕊花苷均可显着增强CD11c阳性细胞表达MHCⅡ分子。并且发现经毛蕊花苷和异毛蕊花苷诱导后树突状细胞吞噬荧光标记的葡聚糖的能力下降。MTT法检测对树突状细胞刺激OVA未致敏或致敏淋巴细胞增殖的影响,发现毛蕊花苷和异毛蕊花苷均可增强树突状细胞的刺激致敏淋巴细胞增殖的能力,说明树突状细胞诱导免疫应答及抗原提呈功能均增强。实验结果表明毛蕊花苷和异毛蕊花苷可以促进树突状细胞表型和功能的成熟,可以从调控树突状细胞的角度对车前子的免疫调节机制做初步解释。
于明薇[9]2009年在《活血药、益气活血药对肿瘤生长转移过程中调节性T细胞介导的免疫逃逸影响研究》文中研究指明活血类中药在肿瘤治疗中的作用一直存在争议,临床经验表明活血药可通过合理的配伍增强其改善荷瘤机体高凝状态的作用,同时逆转(或减弱)其可能的促肿瘤转移的趋势。导师的既往课题研究观察了不同类型活血药和配伍不同剂量的益气药黄芪后对肿瘤转移的影响,结果显示:高剂量的益气药配伍活血药不但可以提高单纯活血药对小鼠Lewis肺癌的肿瘤抑制率,并且具有抑制某些单纯活血药促进肿瘤转移的趋势。对其作用机制研究显示:益气活血药与单纯的活血药比较可以降低CD4~+CD25~+调节性T细胞表达,但其分子机制有待进一步深入探讨。本研究是在导师前期工作的基础上,以国家自然科学基金课题为依托开展的。研究对原发性非小细胞肺癌患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与健康志愿者的差异、与肺癌主要临床特征及主要单证的关系进行了小样本的研究;从丹参、苏木、水蛭叁种活血药及其与益气药黄芪配伍后的叁种益气活血药中选择出一组对小鼠Lewis肺癌肺转移干预作用差异最大的药物,即苏木和苏木+黄芪作为活血药与益气活血药的代表进行更深入观察;动物实验研究中主要通过免疫磁珠细胞分选、流式细胞术、实时定量PCR、荧光显微镜图像分析、ELISA、CBA flexset等技术,从Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织和T淋巴细胞两方面观察苏木、苏木+黄芪对CD4~+CD25~+调节性T细胞、相关活化和调控分子、效应因子、Jagged1-Notch信号转导通路中主要基因表达及树突状细胞表面分子的干预作用;体外实验研究中主要通过MTT、transwell小室法检测苏木、苏木+黄芪含药血清对PG细胞增殖、运动、侵袭能力的干预作用,并运用共培养技术,建立人外周血DC、外周血CD4~+细胞、PG细胞培养上清混合培养体系,观察苏木、苏木+黄芪含药血清对T细胞分化的影响。研究从影响肿瘤免疫逃逸角度探讨活血药、益气活血药对肿瘤生长转移干预作用差异的分子机制及关键环节,取得了具有一定价值的研究结果:1主要研究结论1.1原发性非小细胞肺癌患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞检测及临床意义通过对30例原发性非小细胞肺癌患者和12例健康志愿者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg流式细胞仪检测和对肺癌患者的临床资料分析证实,肺癌患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞百分比高于健康志愿者,与文献报道相一致;肺癌患者CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞百分比升高与病期进展和肿瘤负荷增加有关,在不同性别、年龄、病理、KPS及肿瘤标志物正常与否之间比较无差异;肺癌患者CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞百分比升高与患者出现主要单证中的气虚证和血瘀证关系最为密切。这一研究结果在CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg与肺癌关系方面为动物和体外实验研究提供了临床数据依据,并对人外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞百分比流式检测作为一项新的免疫功能监测指标的临床意义和方法可行性作了初步探讨。1.2不同类型活血药、益气活血药对小鼠Lewis肺癌生长转移的干预作用观察选取肿瘤科常用的和血、活血、破血代表药丹参、苏木、水蛭及其与益气药代表黄芪配伍的组方用于抑瘤实验,结果表明:①丹参有促进Lewis肺癌生长及转移的趋势,丹参与黄芪配伍干预后不能逆转这种趋势;苏木、苏木+黄芪、水蛭、水蛭+黄芪在抑制小鼠Lewis肺癌生长转移方面有良好的疗效,提示不同类型活血药、益气活血药对肿瘤生长转移的干预作用不尽相同;②丹参、苏木、水蛭叁种不同类型活血药配伍益气药后在增强活血药抑瘤、抗转移作用方面有共同的趋势。通过以上实验结果,选取对小鼠Lewis肺癌肺转移干预作用差异最大的一组即苏木和苏木+黄芪作为活血药和益气活血药的代表进行后续研究。1.3活血药、益气活血药对荷瘤小鼠脾CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg表达干预作用动态观察通过对苏木、苏木+黄芪作用后Lewis肺癌荷瘤小鼠体重、瘤重、小鼠脾CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞表达的动态观察及小鼠肺转移病理观察、生存期的分析,结果显示:①苏木、苏木+黄芪的抑瘤作用随荷瘤天数的增加总体呈降低趋势,提示中药在肿瘤早期,瘤负荷较小时抑瘤作用更明显;②苏木在肿瘤早期抑瘤作用较强,但苏木+黄芪在提高肺转移抑制率、延长生存期方面作用均优于苏木;③荷瘤对照组小鼠脾CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞表达随荷瘤天数的增加呈上升趋势;④苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠脾CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞表达的变化趋势有不同影响,20d苏木+黄芪组小鼠脾CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞百分比显着低于荷瘤对照组和苏木组。以上结果显示,中药可通过调控荷瘤小鼠脾CD4~+CD25~+Treg表达改善其体内存在的免疫耐受状态,益气活血药苏木+黄芪作用优于其单纯活血药成分,这可能是益气活血中药抑制小鼠Lewis肺癌生长转移、延长生存的作用靶点之一。1.4活血药、益气活血药对荷瘤小鼠脾CD4~+细胞培养上清中细胞因子及Jagged1-Notch1信号转导通路主要基因的影响通过对苏木、苏木+黄芪作用后Lewis肺癌荷瘤小鼠脾CD4~+细胞培养上清中细胞因子及Jagged1-Notch1信号转导通路主要基因检测,发现:①苏木+黄芪组小鼠脾CD4~+细胞培养上清IL-2、IFN-γ水平显著高于荷瘤对照组,而TGF-β1水平低于荷瘤对照组;②苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠脾CD4~+细胞Notch1、Jagged1mRNA表达无明显干预作用。说明中药可通过调控荷瘤小鼠体内细胞因子水平改善体内存在的免疫耐受状态,苏木+黄芪组优于苏木组,而二种中药对Jagged1-Notch1信号转导通路的影响有待进一步研究。1.5活血药、益气活血药对荷瘤小鼠免疫逃逸相关基因表达的影响通过对苏木、苏木+黄芪作用后Lewis肺癌荷瘤小鼠脾CD4~+CD25~+细胞和小鼠肿瘤组织Foxp3、CTLA-4基因的表达的同步检测,发现:苏木+黄芪能减低脾CD4~+CD25~+分选后细胞Foxp3及荷瘤小鼠瘤组织CTLA-4、Foxp3 mRNA表达,作用优于苏木。说明苏木+黄芪可通过降低CTLA-4、Foxp3 mRNA的表达而减低CD4~+CD25~+Treg的活性,并且在淋巴组织和肿瘤微环境都表现出作用,为中药的全身调节特点提供了佐证。1.6活血药、益气活血药对荷瘤小鼠脾树突状细胞表型的影响通过对正常小鼠和苏木、苏木+黄芪作用后Lewis肺癌荷瘤小鼠脾树突状细胞表型CD11c、CD80、CD86百分比检测发现:①荷瘤机体存在明显的成熟DC数量减少;②苏木+黄芪干预能够显着增加荷瘤小鼠脾成熟DC表型,作用优于苏木。说明苏木+黄芪具有改善荷瘤机体中成熟DC数量减少的作用,同时为体外实验中研究DC成熟程度与T细胞分化的关系提供动物实验的基础。1.7活血药、益气活血药含药血清对PG细胞增殖及运动、侵袭能力干预作用观察为体外实验研究需要,制备了苏木、苏木+黄芪大鼠含药血清,并检测其对PG细胞增殖及运动、侵袭能力的干预作用,结果显示:①苏木、苏木+黄芪含药血清对PG细胞增殖无明显抑制作用;②苏木+黄芪含药血清对PG细胞趋化运动、侵袭能力的抑制作用显着高于对照大鼠血清和苏木含药血清。说明中药能够在多个靶点、从多种途径发挥抗肿瘤生长转移作用,对肿瘤细胞的直接抑制杀灭作用只是其中的一个方面。1.8 PG细胞培养上清对体外培养树突状细胞成熟的影响本实验从人外周血分离单个核细胞,并采用不同细胞因子体外诱导其分化为不同成熟状态的树突状细胞,以PG细胞培养上清加入DC培养体系,在体外模拟体内肿瘤微环境,并检测PG细胞培养上清干预组和无干预组中DC表型CD11c、CD86百分比,结果证实:PG细胞培养上清干预能显着抑制体外培养DC的成熟。本实验为后续体外实验提供肿瘤细胞培养上清干预抑制体外培养DC成熟的前提结论和方法学铺垫。1.9 PG细胞培养上清对DC、T细胞混合培养体系的影响及活血药、益气活血药对其干预作用本实验建立了人外周血DC、外周血CD4~+细胞、PG细胞培养上清混合培养体系,并观察混合培养体系中DC、T细胞分布,检测混合培养体系中CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞百分比,细胞培养上清IL-12水平,细胞Jagged1、Notch1 mRNA表达,结果显示:①PG细胞培养上清干预后人外周血DC、外周血CD4~+细胞混合培养体系与无PG干预组相比具有细胞CD4~+CD25~+Foxp3~+表达显着增高、细胞Jagged1、Notch1 mRNA表达明显增高、细胞培养上清IL-12水平明显下降的特点;②苏木、苏木+黄芪含药血清对无PG细胞培养上清干预的人外周血DC、外周血CD4~+细胞混合培养体系中CD4~+T细胞向Treg的分化无干预作用,对细胞培养上清IL-12水平也无影响;③苏木+黄芪含药血清在体外人外周血DC、外周血CD4~+细胞混合培养体系中有抑制CD4~+CD25~-T细胞向CD4~+CD25~+ Treg转化的作用;④苏木+黄芪含药血清在体外有改善肿瘤细胞培养上清干预体系中IL-12水平降低作用;⑤苏木、苏木+黄芪含药血清对人外周血DC、外周血CD4~+细胞混合培养体系中细胞Jagged1、Notch1 mRNA表达无明显干预作用。说明PG细胞培养上清干预体系中Treg的产生与肿瘤细胞分泌大量免疫抑制性细胞因子、DC成熟状态和肿瘤抗原刺激量有关,是多方因素共同作用的结果,而苏木+黄芪含药血清对Treg产生的抑制及对T细胞活化的促进可能与上述因素有关。本研究分别以非小细胞肺癌患者、Lewis肺癌荷瘤小鼠、高转移性人巨细胞肺癌细胞PG干预的DC、T细胞共培养体系为研究对象,从临床实验、动物实验、体外实验叁个不同层次探讨了CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg与肺癌生长转移关系,从肿瘤组织和T淋巴细胞两方面观察苏木、苏木+黄芪对CD4~+CD25~+Treg、相关活化和调控分子、效应因子、Jagged1-Notch信号传导通路中主要基因表达及树突状细胞表面分子的干预作用,从整体-细胞-分子基因水平较系统地探讨了活血药、益气活血药对肿瘤生长转移干预作用差异的分子机制及关键环节,为临床更加合理有效地应用活血药和益气活血药提供了科学依据。2主要创新点本研究的创新之处主要有以下几点:2.1本研究分别以非小细胞肺癌患者、Lewis肺癌荷瘤小鼠、高转移性人巨细胞肺癌细胞PG干预的DC、T细胞共培养体系为研究对象,从整体-细胞-分子基因水平探讨了活血药苏木、益气活血药苏木+黄芪对肺癌生长转移过程中CD4~+CD25~+Treg介导的肿瘤免疫逃逸影响差异的分子机制和关键作用环节,为肿瘤临床治疗中更加合理有效地应用活血药、益气活血药提供了科学依据。2.2在既往研究基础上,通过动态观察Lewis肺癌荷瘤小鼠在肿瘤自然病程中不同时间点脾CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞表达,并分析其与小鼠体重、生存期等的关系以及活血药苏木、益气活血药苏木+黄芪的影响作用,提出干预CD4~+CD25~+Treg及相关活化和调控分子、效应因子表达是活血药、益气活血药在肿瘤生长转移过程中作用差异产生的重要机制,首次结合肿瘤免疫编辑学说中免疫监视和免疫逃逸理论,从影响T淋巴细胞和肿瘤微环境两方面评价不同中医治法各自特点和治疗结果差异的原因。2.3本研究从小样本临床研究切入,证实肺癌患者CD4~+CD25~+Treg检测的重要临床意义;继而通过动物抑瘤实验从叁组不同活血药、益气活血药中筛选出一组对Lewis肺癌转移影响差异最大的药物苏木、苏木+黄芪作为代表进行深入研究;然后采用细胞分选、流式细胞术、实时定量PCR、荧光显微镜图像分析、ELISA、CBAflexset等技术从动物实验角度研究活血药、益气活血药对CD4~+CD25~+Treg及相关活化和调控分子、效应因子表达量的影响;最后采用MTT、transwell小室、细胞共培养等技术从体外实验角度观察活血药、益气活血药对Treg的产生的干预作用。围绕CD4~+CD25~+Treg作用机制的主线,通过不同层次研究,较为全面地观察了中药对肺癌生长转移过程中免疫逃逸相关分子表达和功能的干预作用。2.4临床实验研究中将免疫学新指标与中医基础理论相结合,首次探讨了原发性非小细胞肺癌患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg表达与肺癌中医证候的关系。
参考文献：
[1]. 当归多糖对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞的影响[D]. 肖希斌. 江西医学院. 2003
[2]. 当归多糖促进慢性粒细胞白血病细胞性树突状细胞的诱导生成[J]. 陈国安, 肖希斌, 袁利亚, 戎吉平. 中草药. 2004
[3]. 植物活性多糖对小鼠树突状细胞和巨噬细胞功能的调节作用[D]. 黄丹菲. 南昌大学. 2009
[4]. 中药增强树突状细胞功能的研究进展[J]. 阮旭东, 欧阳学农. 现代中西医结合杂志. 2009
[5]. 乳腺癌多药耐药细胞株及敏感株抗原致敏树突状细胞介导的特异性抗肿瘤免疫研究[D]. 黄晖蓉. 兰州大学. 2006
[6]. 多糖对树突状细胞功能的影响[J]. 黄文强, 宋晓平. 动物医学进展. 2008
[7]. 肺泰胶囊对Ⅳ期NSCLC化疗期间树突状细胞功能影响的研究[D]. 阮旭东. 福建中医学院. 2009
[8]. 车前子毛蕊花苷类对树突状细胞表型和功能的影响[D]. 唐永富. 南昌大学. 2007
[9]. 活血药、益气活血药对肿瘤生长转移过程中调节性T细胞介导的免疫逃逸影响研究[D]. 于明薇. 中国中医科学院. 2009
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