论文摘要
各种各样的细菌生活在同一个微生物群落中,它们需要在有限的空间和资源之中进行激烈的竞争或合作。相互合作的细胞可以产生大量有利于其自身生存的行为,包括营养的获得、群体运动、毒力、防御、离子吸收、生物膜形成以及子实体形成。为了确保这些合作行为发生在同种细胞之间,细菌需要被相邻的细胞所识别。微生物社会学直接受到邻近细胞的协同或对抗行为的影响,这些行为基于微生物自我识别和非自我排除以形成相关群落的能力。细菌中细胞间的亲缘识别通常表现为菌落融合不兼容,直到目前,有一些关于菌落融合不兼容的研究认为,同类菌株的两个菌落相遇后可以融合,而两个非同类菌株的菌落相遇后会形成一条肉眼可见的界线。一些细菌物种的近亲,例如奇异变形杆菌、枯草芽孢杆菌和黄色粘球菌,能够在彼此无法识别的不同菌株的菌落之间形成可见的界线,这就是菌落融合不兼容现象。黄色粘球菌DK1622是一种革兰氏阴性土壤细菌,属于变形杆菌（Proteobacteria）的δ分枝,该模式菌株的基因组己完全测序。黄色粘球菌的独特特征之一是它具有多细胞行为且是众所周知的社会性细菌,例如在营养丰富的固体表面上,它具有细胞的群体运动能力,而在营养成分稀少的情况下,黄色粘球菌的多细胞聚集形成子实体,尽管只有1%的细胞能够成为抗应激孢子并存活下来,而当营养物富集后,孢子又可以萌发形成营养细胞。黄色粘球菌的另一个特点是它能够分泌大量的抗生素和胞外酶类,以配合它捕食其他微生物细胞。这种多细胞行为促进黄色粘球菌细胞的存活并与其他具有分离行为的单细胞竞争。本实验室的前期相关研究在黄色粘球菌DK1622中通过随机插入转座子获得了 3392个插入突变株,从中筛选出了 11个异己识别突变菌株,命名为自我识别（SI）突变株,并且它们能够与野生菌株形成菌落界线。插入的位点位于黄色粘球菌DK1622基因组的9个基因中,大多数是具有未知功能的假定蛋白。与野生菌株相比,这些SI突变株大都表现出运动、生长、子实体发育或孢子形成能力的缺陷。△MX4N0049是对应核酸酶基因MXAN0050的免疫蛋白缺陷突变株,其在黄色粘球菌DK1622的菌落融合不兼容中起作用。值得注意的是,这里我们关注的是黄色粘球菌DK1622和不相容的突变株△MXAN0049,二者成群接近细菌菌落之间会形成形态可见的分界线,被称为界线形成。一种关于菌落融合不兼容的机制是,供体细胞通过接触依赖性过程中的VI型分泌系统（T6SS）装置,将效应蛋白转运到受体细胞。然而,我们并不清楚是哪些因素在界线形成中发挥了主要作用。为了研究界线形成的原因,我们使用了蛋白质组学和代谢组学的方法。组学方法和显微镜技术有助于我们对不同基因、不同蛋白和不同潜在途径直接或间接参与界线形成的理解。基于覆盖率和PSM值,我们筛选出了显著高表达的蛋白。我们发现,当界线形成时,许多抗逆蛋白如冷休克蛋白（CspA,CspB,CspC,CspD,CspE）、伴侣素蛋白家族GroELl和GroEL2编码基因的表达水平显著上调。与对照组（DK1622-DK1622和△MXAN0049-AMXAN0049）相比,DK1622-△MXAN0049形成界线时,冷休克蛋白编码基因csps的表达显著上调了约11倍,groEL1上调了约1.5倍。另外还有一些其他显著上调的蛋白,如Patatin-磷脂酶家族蛋白比DK1622-DK1622对照上调了 7.6倍,比△MXAN0049-△MXAN0049对照上调了 4.6倍。在先前关于革兰氏阴性细菌的报道中,Patatin-磷脂酶充当靶向宿主细胞膜的效应分子,因为它具有加速膜脂质中脂肪酸破坏的能力。同样,据报道四环肽重复（TPR）蛋白直接参与某些致病菌如铜绿假单胞菌、耶尔森氏菌以及土拉弗朗西斯菌的毒力相关功能,它们通过将毒力因子转移到宿主细胞或通过连接宿主细胞的方式来传递它。总之,在黄色粘球菌DK1622中有154种蛋白与TPR具有相同的同源性。DK1622-AMXAN0049的界线上存在41个TPR蛋白,而DK1622-DK1622和△MX4N0049-△MXAN0049的非边界情况下分别存在31和22个TPR蛋白。当界线形成时,四聚肽重复蛋白（编码基因ID:MXN4221）比DK1622-DK1622显著上调约5倍,比AMXAN0049-AMXAN0049显著上调6.5倍。当界线形成时,一些蛋白编码基因也会下调甚至不表达,比如外膜蛋白P1、未表征的蛋白（孔蛋白家族,MXAN 5855）以及TonB依赖性受体外膜蛋白。有趣的是,孔蛋白、脂蛋白、TonB依赖性受体起到营养物质的作用,转移信号和一些通过解毒过氧化物如巯基特异性过氧化物酶以起到保护细胞免受氧化应激作用的废物或蛋白。当界线形成时,一些蛋白覆盖率显著下降,这可能导致对界线中细胞的影响。上述研究揭示了存在于自然环境中细菌微生物群落中的一种机制,这些细菌微生物群落已经与不同菌株共存于不同的生态位,并且可以防止资源竞争或被其他菌株利用。虽然在本研究中通过蛋白质组学分析,我们强调了可能在界线形成中直接或间接发挥作用的重要蛋白,但仍需进一步的研究和实验确证。另外,蛋白质组学数据还显示,当界线形成时,RNA的降解也会发生,并且RNA降解途径变得活跃主要因为界线中大多数相关的关键蛋白显著上调。有趣的是,RNA降解途径与冷休克蛋白（Csps）具有较强的蛋白-蛋白相互作用。在这项研究中,我们还发现了界线形成时Ⅵ型分泌系统（T6SS）的潜在作用。当在DK1622菌株中敲除T6SS基因簇（MXAN4800-4813）后,与AMXAN0049相互作用后界线消失,这也证实了 T6SS在界线形成中起到了关键作用。T6SS组分的存在揭示了它在膜上不同组分运输中的作用,当界线形成时,两种VgrG蛋白（MXAN 4800和MXAN 5573）也存在。除了真菌、放线菌以及芽孢杆菌属的一些种类之外,粘细菌属于次级代谢产物的主要产生者之一。值得注意的是,大量分枝杆菌的筛选导致多种生物活性代谢物的发现,包括抗癌、抗菌以及抗病毒类化合物。黄色粘球菌是众所周知的模式菌株,是不同生物活性次级代谢产物的重要来源。聚酮类化合物合成酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）是重要的生物合成酶,分别负责产生多种聚酮类化合物和非核糖体肽。值得注意的是,当界线形成时存在14种聚酮类化合物合成酶（PKS）或非核糖体肽合酶（NRPS）,而DK1622-DK1622和△MXAN0049-△MXAN0049中分别仅存在6种和7种,这表明PKS/NRPS对界线形成有影响。对于次级代谢产物的评估显示,与非界线相比,在界线形成时存在几种己报道的化合物,例如Myxochelin A、Myxochelin B、Myxalamide D、Myxochelin J8和Neriifolin。我们还发现了 12种新的未知化合物（尚未报道）在界线形成时比对照上调了约100倍。我们也在T6SS基因簇敲除突变株（△T6SS）中研究了上述化合物在界线内的产生情况。在显微镜技术部分,LIVE/DEAD活力分析显示死亡或受损细胞表现为红线,而绿色则表示存在活性的细胞。为了进一步确认细胞的形态,我们使用了扫描电子显微镜（SEM）。在不同的放大倍数下,我们在界线处发现了受损或死亡以及不规则形状的细胞,而在两个对照组中只观察到了活细胞。我们还发现,在边界内,细胞的形状发生了变化,并且它们不像之前报道的那样处于规则的杆形状,而MreC被报道能够促使细胞形成杆状。蛋白质组学结果表明,界线形成时MreC蛋白并不存在,而它却出现在细胞呈规则形状的对照组中。另外,我们在界线形成时发现了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径,并通过代谢组学研究证实苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在界线中的存在意义,它们可能是导致界线形成的另一个因素。总之,我们认为界线的形成有多种因素,本文有助于提供各种线索来解决界线形成的问题,以便进一步的研究。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: MIAN NABEEL ANWAR
导师: 李越中
关键词: 型分泌系统,蛋白质组学,黄色粘球菌,次级代谢产物,显微镜技术,冷休克蛋白,菌落融合不兼容
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山东大学
分类号: Q938
总页数: 190
文件大小: 12768K
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标签：型分泌系统论文; 蛋白质组学论文; 黄色粘球菌论文; 次级代谢产物论文; 显微镜技术论文; 冷休克蛋白论文; 菌落融合不兼容论文;