细胞内组分辅助荧光放大新方法研究

论文摘要

原位、实时获取细胞内生化信息,既是探究生命现象本质的基石,也是当今化学领域、生物医学领域的研究核心内容。具有高时空分辨率、无损分析、操作简便等优点的荧光传感和荧光成像技术,已经成为在细胞层面研究生物分子及其生理病理机制工作中不可取代的重要分析手段。然而,实时监测细胞内一些低丰度表达且重要的生命活性物质和重大疾病关键标志物,这无疑是对现存的荧光传感技术提出的一项严峻挑战。荧光放大是应对这一挑战的关键所在,但现有荧光放大方法依赖于外源物作为辅助工具且存在放大条件严苛等困难。因而,发展一种通用性好且生物相容性佳的荧光放大方法,以此突破现有分析物与输出信号“一对一”传统探针的设计模式并攻克现有荧光放大方法难题,不仅是实现细胞内低丰度目标分子的原位检测与实时追踪的关键,更是生物医学与化学传感领域中亟需攻克的重要难题。本论文工作以发展细胞内原位荧光放大新方法为目的,立足于当前生物医学与分析传感中亟需解决的难题,依据分析对象的生物学特性,以细胞内固有组分作为信号放大辅助工具,提出细胞内组分辅助荧光放大新策略,为荧光探针多样化发展提供重要的设计思路,进而为实现细胞水平上实时监测、探究生物分子的表达、活性变化以及揭示重大疾病关键标志物与疾病成因之间关系,提供全新的分析工具和技术方法。本论文主要展开了以下几个方面的研究工作:（一）胞浆核糖核酸（RNA）结合荧光放大在细胞内特定生物分子检测中的研究。（1）基于细胞内核糖核酸（RNA）具有增强染料RBF荧光特性,发展了一类RNA结合荧光放大新策略,并针对与肿瘤密切相关的透明质酸酶亚型Hyal-1,利用其相较其它亚型更好的降解透明质酸（HA）性能,理性设计了一种由胆固醇胺修饰的HA纳米胶束CHA,并将其与RNA结合荧光染料RBF自组装形成荧光放大纳米传感器RBF@CHA,应用于细胞内Hyal-1特异检测与成像分析。实验结果表明:该纳米传感器不仅能够实现特异性响应Hyal-1,并且由于RNA结合荧光增强效应,该传感器展现了其独特的高灵敏特征,成功应用于细胞内低丰度生物活性分子的原位成像。（第2章）（2）为了进一步验证该RNA结合荧光放大策略的普适性,本章以细胞内抗坏血酸（AA）为分析对象,利用具有荧光猝灭性能的钴氢氧化物（CoOOH）作为响应门控装置将RBF封装于介孔硅纳米颗粒（MSN）内部,组装成了新型抗坏血酸荧光放大纳米传感器。实验结果表明:该纳米传感器充分展现了RNA荧光放大策略的独特性能,并实现细胞内AA高灵敏成像分析,表明RNA结合荧光放大在细胞内原位检测中具有良好的应用前景。（第3章）（二）GSH辅助荧光放大细胞内氧含量的特异性检测中的应用研究。实现细胞内氧含量的原位高灵敏检测对开展缺氧与相关疾病机制之间的研究工作具有重要的应用价值。基于细胞内具有高丰度还原型谷胱甘肽（GSH）特征,合成了GSH敏感型荧光染料,并提出一种GSH荧光放大策略用于构建细胞内氧传感器。本章中,利用β环糊精（β-CD）与低氧敏感的偶氮苯之间自组装特性,将GSH敏感荧光染料N-bMBN封装于MSN内部,以此获得细胞内氧传感器icO2-GASensor。实验结果表明:由于荧光染料N-bMBN具有GSH敏感性响应特性,该纳米传感器不仅成功实现细胞内不同程度低氧的原位高灵敏成像,并且在纳米材料MSN的高效载药量特性的协助下实现信号放大检测的目的。（第4章）（三）粘度辅助荧光放大在溶酶体组织蛋白酶B原位成像中的应用研究。溶酶体内蛋白水解酶与细胞的生理病理学功能密切相关,但实现原位高灵敏检测溶酶体内蛋白酶活性仍具有很大的挑战性。针对这一问题,我们基于溶酶体粘度较强这一生物特征,发展一种溶酶体粘度辅助荧光放大策略用于溶酶体内组织蛋白酶B（Cath B）的原位成像分析。本章中,利用Cath B特异性酶切肽将粘度敏感型荧光染料HPI封装于MSN内部,由此获得荧光放大纳米传感器Lyso-FA。实验结果表明:该纳米传感器可成功进入并滞留于溶酶体,并实现对Cath B在亚细胞水平上的高灵敏检测及原位成像。（第5章）本论文所提出的细胞内组分辅助荧光放大策略,不仅为开创全新的信号放大方法提供了理论思路,进而也推动了生物医学领域中相关深入研究的开展,为发展细胞内原位超灵敏可视化分析提供的基础理论指导和较大的生化分析应用价值。

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摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 引言

1.2 荧光生物传感

1.2.1 光诱导电子转移

1.2.2 分子内电荷转移

1.2.3 荧光共振能量转移

1.2.4 激基缔合物/复合物

1.3 信号放大及其传感应用

1.3.1 酶催化放大

1.3.2 化学催化放大

1.3.3 其它材料辅助放大

1.3.4 细胞内信号放大

1.4 本论文的构思与研究内容

第2章 RNA结合荧光放大在细胞内Hyal-1 特异检测中的应用研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 有机荧光染料RBF（EPI）的合成

2.2.3 两亲性聚合物Chol-HA的合成

2.2.4 传感器的构建与表征

2.2.5 实验可行性验证与条件优化

2.2.6 细胞水平的检测成像

2.3 结果与讨论

2.3.1 纳米传感器RBF@CHA的设计及响应机理

2.3.2 纳米传感器RBF@CHA的构建与表征

2.3.3 可行性考察

2.3.4 性能考察

2.3.5 定量分析

2.3.6 细胞成像

2.4 小结

第3章 RNA结合荧光放大在细胞内抗坏血酸特异检测中的应用研究

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 传感器的构建与表征

3.2.3 传感器在实际检测中的应用

3.2.4 细胞培养及细胞毒性测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 纳米传感器RBF@MSN@CoOOH设计及响应机理

3.3.2 纳米传感器RBF@MSN@CoOOH的构建与表征

3.3.3 可行性考察

3.3.4 性能考察

3.3.5 定量分析

3.3.6 细胞成像

3.4 小结

第4章 GSH辅助荧光放大在细胞内氧含量的特异性检测中的应用研究

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 荧光染料的合成

4.2.3 荧光染料性能考察

4.2.4 传感器的构建与表征

4.2.5 传感器在实际检测中的应用

4.2.6 细胞培养及细胞毒性测定

4.2.7 细胞成像

4.2.8 组织成像

4.3 结果与讨论

2-GASensor设计及响应机理'> 4.3.1 纳米传感器icO₂-GASensor设计及响应机理

4.3.2 荧光染料的合成及性能考察

2-GASensor的构建与表征'> 4.3.3 纳米传感器icO₂-GASensor的构建与表征

4.3.4 可行性考察考察

4.3.5 性能考察分析

4.3.6 定量分析

4.3.7 细胞成像

4.3.8 组织成像

4.4 小结

第5章粘度辅助荧光放大在细胞内组织蛋白酶B溶酶体原位成像中的应用研究

5.1 前言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂和仪器

5.2.2 荧光染料的合成

5.2.3 荧光染料性能考察

5.2.4 荧光染料性能考察

5.2.5 传感器在实际检测中的应用

5.2.6 细胞培养及细胞毒性测定

5.2.7 Cath B致细胞凋亡（细胞程序性死亡）验证

5.2.8 细胞成像

5.3 结果与讨论

5.3.1 纳米传感器Lyso-FA设计及响应机理

5.3.2 荧光染料的光学特性考察

5.3.3 纳米传感器Lyso-FA的构建与表征

5.3.4 性能考察

5.3.5 定量分析

5.3.6 细胞成像

5.4 小结

结论与展望

参考文献

附录攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李媛

导师: 杨荣华

关键词: 荧光放大,细胞内,核糖核酸,还原型谷胱甘肽,溶酶体粘度

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 湖南大学

分类号: O657.3;Q2-33

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.000052

总页数: 142

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