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鸭Mx蛋白体外抗RNA病毒活性的研究

2020-12-08阅读(99)

鸭Mx蛋白体外抗RNA病毒活性的研究

论文摘要

Mx蛋白是一类由干扰素诱导产生具有抗病毒活性的动力蛋白样GTP酶,在脊椎动物中普遍存在。目前对于鼠源、鱼源、鸡源等动物的Mx蛋白抗病毒活性的研究已较为深入,但是对于鸭Mx抵抗RNA病毒的病毒活性还并未确定,因此鸭Mx抗RNA病毒活性还需要进一步评价。本研究分别用四种RNA病毒水疱性口炎病毒（VSV）、新城疫病毒（NDV）、1型鸭甲肝病毒（DHAV-1）和3型鸭甲肝病毒（DHAV-3）感染人胚胎肾上皮细胞（HEK293T）,盲传3代后测定半数细胞培养物感染量(TCID50),最终测定VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3的TCID50分别为10-5.164/0.1 mL、10-6.181/0.1 mL、10-7.748/0.1 mL和10-9/0.1 mL。提取293T细胞中四种病毒的RNA,将其反转录为cDNA,利用PCR技术扩增目的基因,构建了四种RNA病毒的标准质粒,并以标准质粒为模板制作标准曲线,通过重复性、灵敏度和特异性检测,成功建立了分析病毒载量的实时荧光定量RT-PCR检测方法。合成带有红色荧光标签的慢病毒穿梭质粒pLV-mCherry-Mx-2166,利用脂质体转染技术将pLV-mCherry-Mx-2166导入293T细胞,并对转染剂量和时间进行优化。Western blot结果显示用2μg/孔的pLV-mCherry-Mx-2166瞬时转染293T细胞24 h时,鸭Mx蛋白的表达量优于其他时间点的表达量。在此基础上,分别用四种RNA病毒感染293T细胞,利用Western blot和RT-qPCR方法检测感染后6 h、9 h、12 h、24 h和36 h细胞样品中鸭Mx的表达水平和RNA病毒的病毒载量,试验结果表明与对照组相比体外瞬时过表达鸭Mx可显著抑制VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3病毒的复制。根据鸭Mx基因的保守编码区设计并合成了3对siRNA引物siRNA-Mx1、siRNA-Mx2、siRNA-Mx3及阴性对照引物siRNA-NC。利用Western blot和RT-qPCR方法筛选出干扰效果较稳定的siRNA-Mx2,并优化干扰载体的最佳使用浓度。结果显示,干扰鸭Mx抗VSV和NDV的最佳使用浓度为40 pmol/孔,干扰鸭Mx抗DHAV-1和DHAV-3的最佳使用浓度为50 pmol/孔,与未干扰组相比干扰效率可降低50%以上。利用优化好的条件探究干扰鸭Mx蛋白表达后对VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3的抗病毒活性。结果表明,与未干扰组相比siRNA-Mx2显著抑制鸭Mx抗VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3病毒的活性。本研究利用过表达及RNA干扰技术,从正反两个方面揭示鸭Mx在293T细胞中过表达后对VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3四种RNA病毒具有体外抗病毒活性,为今后深入研究鸭Mx蛋白的抗病毒功能及其机制奠定了重要的理论基础。

论文目录

  • 摘要
  • 英文摘要
  • 1 前言
  •   1.1 Mx蛋白的命名与发现
  •   1.2 Mx蛋白的家族成员
  •     1.2.1 Mx蛋白的分类
  •     1.2.2 啮齿动物的Mx蛋白
  •     1.2.3 人类MxA和 MxB蛋白
  •     1.2.4 其他哺乳动物Mx蛋白
  •     1.2.5 鱼类和禽类Mx蛋白
  •   1.3 Mx蛋白的分子结构
  •     1.3.1 GTP酶结构域
  •     1.3.2 中间域
  •     1.3.3 GTP酶效应结构域
  •     1.3.4 Mx蛋白的自我装配
  •   1.4 Mx蛋白抗病毒活性的研究
  •     1.4.1 Mx蛋白的表达与调控
  •     1.4.2 Mx蛋白的抗病毒机制
  •   1.5 禽类Mx蛋白的研究现状
  •     1.5.1 鸡Mx蛋白的研究进展
  •     1.5.2 鸭和鹅Mx蛋白的研究进展
  •     1.5.3 鸟类Mx蛋白的研究进展
  •   1.6 研究的目的与意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 细胞、载体、菌株及毒株
  •     2.1.2 实验动物
  •     2.1.3 酶、抗体、主要试剂等
  •     2.1.4 主要仪器
  •     2.1.5 主要溶液配制
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 RNA病毒在293T细胞中的繁毒及鉴定
  •     2.2.2 VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3 的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
  •     2.2.3 鸭Mx体外抗VSV病毒条件的优化
  •     2.2.4 鸭Mx体外瞬时过表达抗RNA病毒活性的研究
  •     2.2.5 siRNA干扰鸭Mx表达条件的优化及鉴定
  •     2.2.6 siRNA干扰鸭Mx体外抗RNA病毒活性的研究
  • 3 结果
  •   3.1 RNA病毒在293T细胞中的繁毒及鉴定
  •     3.1.1 NDV、DHAV-1和DHAV-3 的繁毒
  •     3.1.2 VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3在293T细胞中的增殖
  •     3.1.3 VSV、NDV、DHAV-3和DHAV-1 P3 代的TCID50 的测定
  •     3.1.4 VSV、NDV、DHAV-3和DHAV-1 P3 代病毒不同时间点的PCR鉴定
  •   3.2 VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3 的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
  •     3.2.1 VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3 阳性标准品的制备
  •     3.2.2 VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3 退火温度的优化
  •     3.2.3 VSV、NDV、DHAV-1和DHAV-3 的实时荧光定量RT-PCR标准曲线的绘制
  •     3.2.4 重复性试验
  •     3.2.5 灵敏性试验
  •     3.2.6 特异性试验
  •   3.3 鸭Mx体外抗RNA病毒条件的优化
  •     3.3.1 鸭Mx瞬时过表达的优化及鉴定
  •     3.3.2 鸭Mx体外瞬时过表达抗VSV病毒条件的优化
  •     3.3.3 鸭Mx体外瞬时过表达抗RNA病毒活性的研究
  •   3.4 siRNA干扰鸭Mx表达条件的优化及鉴定
  •     3.4.1 siRNA干扰鸭Mx表达载体的筛选及鉴定
  •     3.4.2 siRNA干扰鸭Mx体外抗RNA病毒条件的优化及鉴定
  •   3.5 siRNA干扰鸭Mx体外抗RNA病毒活性的研究
  •     3.5.1 siRNA干扰鸭Mx体外抗VSV病毒的检测
  •     3.5.2 siRNA干扰鸭Mx体外抗NDV病毒的检测
  •     3.5.3 siRNA干扰鸭Mx体外抗DHAV-1 病毒的检测
  •     3.5.4 siRNA干扰鸭Mx体外抗DHAV-3 病毒的检测
  • 4 讨论
  •   4.1 选择293T细胞瞬时过表达鸭Mx蛋白的依据
  •   4.2 实时荧光定量RT-PCR方法的建立
  •   4.3 鸭Mx蛋白瞬时过表达条件的优化
  •   4.4 体外瞬时过表达鸭Mx抗 RNA病毒活性的评价
  •   4.5 siRNA干扰鸭Mx蛋白抗RNA病毒活性的评价
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 刘悦

    导师: 马波

    关键词: 鸭蛋白,病毒,抗病毒活性,过表达,干扰

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 东北农业大学

    分类号: S852.65

    总页数: 89

    文件大小: 7715K

    下载量: 81

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