猪非典型性瘟病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及基因组学研究

论文摘要

猪非典型性瘟病毒（Atypical porcine pestivirus,APPV）是能引起新生仔猪A-II型先天性震颤（Congenital tremor,CT）的一种新型的瘟病毒病原,地域范围广泛,已造成了养猪业巨大的经济损失。2015年美国首次证实了该病毒的存在,随后我国南方等各省也对该病毒进行了报道,证实了该病毒在我国广泛流行。本研究旨在建立一种快速准确检测APPV的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法对中国西南地区APPV在新生猪群血清中进行分子流行病学调查及基因组特征分析,取得的结果如下:1、TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及其应用2017年,本研究通过对GenBank中已公布的8条APPV全基因组序列进行比对分析,在APPV的基因组中5’非编码区（5’-UTR）是相对保守的区域进行了检测引物及探针的设计。通过对退火温度、引物和探针浓度的优化,结果显示在本研究中该方法的最佳退火温度为54°C,最佳引物和探针浓度分别为0.5μL（250 nM）和0.8μL（400 nM）。通过灵敏性试验显示该方法最低检测核酸浓度为每个反应130个拷贝,其灵敏度是已报道荧光RT-PCR方法的20倍。通过运用经典猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）、牛病毒性腹泻病毒1型（Bovine viral diarrhea virus 1,BVDV-1）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV-2）、大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）、沙门氏菌（Salmonella）等阳性毒（菌）株进行特异性鉴定,结果显示该方法只能对APPV样本进行扩增,表明该方法特异性良好。通过组内和组间的重复性试验,结果显示其组内和组间的变异系数小于2.5%,表明经该方法重复性良好。因此本研究成功建立了一种灵敏性高的、特异性良好的、稳定性好的、易于操作且快捷的基于APPV 5’-UTR的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的检测方法。基于本研究成功建立的qRT-PCR方法,对中国西南地区22个猪场中采集的166份新生仔猪血清样本进行检测,结果显示其中有18个样本为APPV抗原阳性（10.84%,95%CI:6.6%16.6%）,22个猪场中存在8个阳性场（36.36%,95%CI:17.2%59.3%）;利用SPSS软件分析临床健康样本和疑似患病样本之间的阳性率是否存在差异性,结果显示两者之间差异显著,其中临床健康的血清样本的检出情况（0/126）远远低于与CT症状相关的样本（18/40）的检出情况（OR:45,95%CI:29.3%61.5%,P<0.001）,从而揭示了我国新生仔猪APPV的患病率与临床CT密切相关。同时与已经报道的方法进行了检测结果的比较,结果显示与荧光RT-PCR方法的阴性及阳性复核率为100%。2、APPV的基因组学研究针对西南地区的18个阳性样本,运用NS3基因组保守区设计的检测引物进行普通RT-PCR扩增成功获得了15条NS3基因部分片段（439 bp）,15条NS3基因序列之间核苷酸同源性为81%100%,和所有可用的13条APPV毒株以及瘟病毒其他的代表宿主毒株之间的核苷酸同源性分别为80.1%94.2%和47.1%56.7%。在能成功扩增NS3基因片段的7个APPV阳性猪场中挑选出7个代表样本进行全基因组扩增并进行遗传进化分析。成功获得的7个APPV毒株的近似全基因组（命名为SWU-DY/2018、SWU-KZ/2018、SWU-MY/2018、SWU-QL/2018、SWU-XC/2017、SWU-YB/2018和SWU-ZH/2017）其核苷酸长度为11,26911,462 nt,多聚蛋白基因的碱基G/C所占组分为46.11%46.48%,7个APPV菌株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为83.1%99.5%和91.3%99.6%;与GenBank中的13条参考序列的核苷酸和氨基酸同源性分为82.8%98%和91.3%98.8%。基于本实验中获得7条实验毒株和GenBank中的13条APPV毒株的ORF基因构建的进化树显示,APPV基因序列的整体上分为两个大支,本研究中获得的7条APPV基因序列在进化树中的2个大支上都有分布且形成了3个小分支,因此表现出较为丰富的遗传多样性。其中五个毒株（SWU-DY/2018、SWU-MY/2018、SWU-QL/2018和SWU-XC/2017、SWU-YB/2018）分布于由中国序列形成的2个小支上,揭示这2个小分支的毒株可能是国内潜在的优势毒株。而SWU-KZ/2018和SWU-ZH/2017毒株在遗传关系中显示更靠近于国外的APPV毒株,表明该两株毒株可能是我国西南地区流行的APPV毒株的遗传变异较大或者由引种原因传入我国后逐渐演变形成的。在瘟病毒属中E2蛋白是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。本研究对获得的7株APPV毒株与世界首例APPV毒株（PPV1-000515）的E2蛋白的抗原决定簇进行了预测对比。结果发现本次研究中的APPV毒株在所预测的抗原决定簇的数量上存在明显的遗传多样性（异质性）。目前,APPV主要是基于的Nrpo和E2基因进行基因型鉴定,并分为4种基因型（A/B/C/D）。为进一步研究7株APPV毒株的遗传进化关系,基于E2和Nrpo基因构建的遗传进化树分析显示七株实验毒株被分为3个基因型,SWU-XC/2017和SWU-YB/2018毒株属于Type D,SWU-KZ/2018和SWU-ZH/2017毒株属于Type A。值得注意的是,毒株SWU-DY/2018、SWU-MY/2018和SWU-QL/2018所处分支与其他分支在E2和Nrpo基因的遗传距离差异分别为16.42%19.25%、21.26%24.60%。因此预示着本次实验中的这三个毒株与中国广东的毒株是潜在的新的基因型Type E。本实验的结果表明APPV在中国西南地区的新生CT仔猪群中广泛流行,并且揭示了至少有1种新的基因型毒株在中国猪场中存在和流行,这为进一步了解APPV的遗传进化有重要的意义。

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摘要

Abstract

第一章猪非典型性瘟病毒研究进展

1.1 APPV的发现及生物学分类

1.2 APPV临床症状和病理变化

1.3 APPV的流行病学

1.4 APPV的基因组结构、非编码区和编码的蛋白的生物学功能

1.4.1 猪非典型性瘟病毒的非编码区

1.4.2 APPV编码的蛋白及其功能

1.5 APPV的分子遗传多样性

1.6 APPV的诊断

1.7 目的与意义

第二章 TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及其应用

2.1 材料

2.1.1 临床样本

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 主要试剂的配制

2.2 试验方法

2.2.1 引物的设计与合成

2.2.2 病毒RNA的提取和c DNA的合成

2.2.3 5'UTR、NS3 基因的部分片段的PCR扩增

2.2.4 APPV三种检测引物的扩增片段的阳性质粒的制备

2.2.5 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

2.2.6 临床病料的检测

2.3 结果

1.3.1 目的基因的RT-PCR的扩增结果

1.3.2 3种重组质粒的鉴定结果

1.3.3 TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法条件的优化结果

1.3.4 临床样本的检测结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 APPV的基因组学研究

1.1 材料

1.1.1 临床样本

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要仪器

1.1.4 主要试剂的配制

1.2 试验方法

1.2.1 病毒RNA的提取及c DNA的合成

1.2.2 NS3 基因的部份序列的PCR扩增

1.2.3 PCR产物的回收与纯化

1.2.4 回收产物的连接、转化

1.2.5 菌落的PCR鉴定、测序及NS3 基因序列分析

1.2.6 引物的设计与合成

1.2.7 全基因组的各片段PCR扩增

1.2.8 PCR产物的回收与纯化

1.2.9 回收产物的连接、转化

1.2.10 菌落的PCR鉴定、测序

1.2.11 全基因组序列的拼接及分析

1.3 结果

1.3.1 NS3 基因部分序列分析

1.3.2 7个APPV毒株全基因组的同源性及基因组特征分析

1.3.3 E2 基因序列的抗原决定簇分析

1.3.4 7株APPV毒株的ORF及 Nrpo、E2 基因的遗传进化分析

1.4 讨论

1.5 小结

结论与创新点

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

附件

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周可磊

导师: 张斌,李建

关键词: 猪非典型性瘟病毒,荧光定量,基因组分析

来源: 西南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西南民族大学

基金: “ 十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0500705),国家自然科学基金(31772766)

分类号: S852.651

DOI: 10.27417/d.cnki.gxnmc.2019.000246

总页数: 59

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猪非典型性瘟病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及基因组学研究

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