严坤平[1]2004年在《色谱饼的优化设计及其在生物工程中的应用》文中研究指明该论文内容分为叁个部分。 1．以评价色谱柱的方法对色谱饼进行了评价，发现用于分离生物大分子的疏水填料并不遵循分离小分子填料的规律。另外，仍以短柱理论为理论基础，在原液流分布器(以下简称分布器)的基础上设计出多种液流分布器，并用不同的方法对液流分布器的合理性进行了判断，挑选出对液体分布性能更好的分布器，使其吸附量在容量因子k′=10.54时比原分布器提高约4.43mg，约33.8％左右。在原装柱方法的基础上，还设计了两种新的装柱方法，其中一种较好的装柱方法吸附量在容量因子k′=9.87时比原装柱方法提高了8.36mg，提高约67.5％。 2．研究了一种弱阴离子交换(WAX)色谱饼对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的复性并同时纯化的方法。将大肠杆菌(E.coli)表达的存在于包涵体中的rhG-CSF用脲提取并用巯基乙醇还原变性后，在流动相中有一定浓度的脲及氧化-还原谷胱甘肽存在条件下，对rhG-CSF进行复性的色谱条件进行了优化。在30min内可得到纯度95％、比活为1.9×10~8IU／mg的rhG-CSF，质量回收率为27％。该法可在进样时生成沉淀的条件下正常进行色谱操作，并以周期性溶解沉淀的方式，再用WAX色谱饼复性方法提高rhG-CSF的质量及活性回收率。可望普遍用于蛋白质复性及同时纯化工业生产。 3．研究了一种用聚合物基质的WCX色谱饼对重组人干扰素-γ复性并同时纯化的方法，将大肠杆菌(E.coli)表达的存在于包涵体中的rhIFN-γ用脲提取，对rhIFN-γ进行复性的色谱条件进行了优化。在30min内可得到纯度大于97％、比活为4.3×10~7IU／mg的rhIFN-γ，质量回收率为48.9％。相对于文献中报道的方法，该方法步骤少，操作简单。在实验中采用了色谱饼装填聚合物基质的填料，使该种填料有了更为广泛的应用，并提高了色谱饼的吸附量，可望用于工业生产。
王骊丽[2]2004年在《人干扰素-γ和人干细胞因子在原核细胞中的表达、液相色谱复性并同时纯化》文中进行了进一步梳理基因工程技术,尤其是以大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)克隆表达系统为基础的原核基因工程技术,使得人们可以在E.coli中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白,用于蛋白质结构和功能的解析以及临床医疗。然而,通常用基因工程技术从Ecoli中获得一个具有活性的治疗用药物蛋白或者研究用蛋白纯品,仍然面临着严峻的技术挑战。其中,作为生物工程“下游技术”的重要部分的重组蛋白复性和纯化,往往是在E.coli中生产特定真核蛋白的技术“瓶颈”,要占生产总成本的70-90%。因此,本论文将通过基因工程手段分别构建的重组干扰素-γ(recombinant human interferon-γ,rhIFN-γ)和重组人干细胞因子(recombinant human stem cell factor,rhSCF)的原核表达载体,并实现在E.coli中高效表达。用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)对不含有二硫键rhIFN-γ进行复性并同时纯化;主要用LC法完成rhSCF的复性并同时纯化工艺研究,获得了可供临床使用的rhIFN-γ和rhSCF,并为基因工程产品的不断完善提供实验依据。 论文包括以下九个部分: 1.文献综述 目前,在基因工程药物生产中由于E.coli具有遗传背景清楚、操作简单、生长周期短、产量高、成本低等显着优点,在重组蛋白生产的过程中E.coli仍占着主导地位。hSCF是一类作用于多系的造血细胞生长因子,与其它的生长因子有较好的协同作用,具有恢复造血的功能。虽然在E.coli中表达的重组蛋白和天然蛋白具有相同的生物活性,但迄今为止,在原核细胞中表达重组蛋白都存在表达量较低、表达产物存在于包含体组分以及包含体复性效率较低等问题。其中重组蛋白的复性一直是大量获得有功能的基因工程产品的技术“瓶颈”。因此,通过基因工程手段获得多种可供临床使用的造血细胞因子,一方面具有重大的临床、经济和社会效益,另一方面也可为基因工程下游技术的不断完善提供实验依据。整个文献综述共引用了135篇文献和四个图。 2.重组人干扰素-γ在大肠杆菌中高效表达和色谱复性 从健康人外周血分离单核细胞,经LPS刺激后提取总RNA。用反转录-聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增hlFN-γ的互补DNA(Complementary deoxynucleic acid,cDNA)。将扩增的产物克隆后进行序列分析证
陈刚[3]2009年在《制备液相色谱中整体蛋白高效快速分离新策略》文中提出随着蛋白质组学研究热潮的到来,对于整体活性蛋白的分离和制备已成为影响蛋白质组学研究向纵深发展的一大难题。一方面,为获得更多蛋白质的结构与功能信息,必需足够量的高纯度的活性蛋白;另一方面,应用蛋白质组学研究成果开发与生产活性蛋白质药物急需高效的分离技术并降低生产成本。因此,研究制备规模下整体蛋白快速、高分辨分离的新策略是解决上述问题的关键。本文首次提出了制备色谱中蛋白分离的五“S”策略,即使用短柱(Short column)装填小颗粒填料(Small particles),在单位柱横截面上(cross-Sectional area per unit)样品较小的质量过载(Small sample over load)和适宜的低线流速(Suitable low linear velocity)条件下进行活性蛋白高效快速的分离。绪论。介绍了整体蛋白分离与制备的意义、分离技术和液相色谱分离介质的研究进展;对色谱饼及其用于蛋白分离的理论、技术和应用的研究作了回顾;简述了制备色谱的发展及其与分析色谱的异同,引用文献150篇。实验部分。包括了本文中所用的仪器、材料、实验方法。整体蛋白液相色谱分离的五“S”策略。全面比较了色谱柱和色谱饼分离整体蛋白时的分离度与峰容量;在分析规模下短色谱柱(色谱饼)和常规长色谱柱上这两者相当,在制备规模下,同样柱体积的色谱饼分离效果优于色谱柱;装填较细硅胶基质填料的色谱饼在分离制备蛋白时能取代“软”基质的商品填料。基于此首次提出了制备色谱中蛋白快速、高分辨分离的五“S”策略。五“S”策略与热力学因素。对生物大分子的色谱保留行为进行了研究,发现其在液相色谱分离过程中存在洗脱浓度窗口,用计量置换保留理论对此进行了解释。通过对溶质与固定相、流动相之间分子相互作用机理的探讨,阐明了溶质在色谱柱床上复杂的吸附、解吸附过程及其内在特点。提出条件分离度、有效柱长比和单位横截面积的样品负载密度叁个新概念,用来解释超载状态下蛋白在色谱柱床上具有优异分离性能的原因。阐明了在此条件下提高蛋白分离度的有效途径为增加柱内径,降低柱床上样品吸附层的厚度和样品负载密度,同时为增大高流速下蛋白的产量应适当减小柱长;表明色谱饼是实现五“S”策略的首选柱技术。五“S”策略与动力学的影响。分别考察了不同粒径的色谱填料、填充方式和色谱柱特征对蛋白分离和谱带扩展的影响。随着填料粒径的减小,蛋白的分离效果逐渐变好,色谱饼的几何结构使得其填料装填密度要高于同体积的常规色谱柱,并因此减弱了蛋白的谱带展宽。研究不同流速下蛋白的分离,以条件塔板高度对流速作图,表明色谱饼具有比色谱柱较小的最佳线流速和较宽的最佳流速范围。提出以条件分离度与流速关系曲线确定和表征色谱分离的优化条件。在色谱饼上对标准蛋白进行了高效快速分离的优化,与文献对比,色谱饼的样品负载量大,分离效果好,质量回收率和回收样品浓度高。五“S”策略的应用。用疏水色谱饼在6 min内实现了人血清样品的一步快速分离制备。采用基于色谱饼的二维液相色谱成功实现了不同色谱模式之间缓冲溶液交换和人血清样品在70 min内快速在线二维分离,在2 cm色谱饼上一次样品处理量为40 mg总蛋白。
王军[4]2010年在《单柱二维液相色谱复性变性溶菌酶及胰腺癌血清中肿瘤标志物的制备》文中认为高效液相色谱法是生物大分子分离纯化的手段,也是蛋白复性的有效方法。液相色谱的核心是色谱填料,它在蛋白分离和蛋白折迭液相色谱(PFLC)中起着重大作用。本文主要研究了用单柱二维液相色谱填料分别在弱阳离子交换色谱(WCX)和疏水相互作用色谱(HIC)模式下对还原变性溶菌酶的复性,同时采用离线单柱二维液相色谱对蛋清中的蛋白进行了分离纯化,以及采用SEC-RPLC制备胰腺癌血清中肿瘤标志物。主要包括以下4个部分。1文献综述：主要介绍了二维液相色谱和单柱二维液相色谱的概念及应用,论述蛋白折迭液相色谱法的原理,总结了溶菌酶复性的研究进展及胰腺癌早期诊断的研究进展,其中共引用文献64篇。2首次使用一根色谱柱分别在弱阳离子交换色谱(WCX)和疏水色谱(HIC)两种模式下对还原变性溶菌酶的折迭进行了研究。详细讨论了在两种分离模式下流动相中脲浓度,GSH/GSSG比例,pH,蛋白浓度及流动相流速对还原变性溶菌酶复性效率的影响。结果表明,使用此二维色谱柱,可分别在WCX和HIC模式下实现对还原变性溶菌酶的复性。在WCX模式下复性时,在蛋白浓度高达40 mg／mL的条件下,得到活性回收率和质量回收率分别为94.6%和96.0%,而在HIC模式下,蛋白浓度为5 mg／mL时,相应的活性回收率和质量回收率分别为79.8%和96.1%。表明该二维色谱柱能够应用于蛋白折迭液相色谱,可分别在WCX和HIC模式下对变性蛋白进行折迭。该二维色谱柱有望成为实现蛋白折迭液相色谱法的首选色谱柱。3首次使用一根色谱柱,采用离线单柱二维液相色谱技术对鸡蛋清中的3种蛋白质进行了的分离纯化。第一维采用离子交换色谱模式,可一步分离纯化得到抗生物素蛋白和溶菌酶,其纯度分别达到95.3%和95.6%。将在离子交换模式下不保留的组分再通过疏水色谱模式进行第二维分离,通过条件优化,一步可分离纯化得到球蛋白G2,其纯度可达到98.1%。而卵白蛋白和伴白蛋白则不能够完全分离。结果表明,采用单柱二维液相色谱技术,利用一根色谱柱就可以完成对复杂样品的二维分离和纯化。4采用800 mm×40.0 mm I.D.制备型排阻色谱柱对胰腺癌血清进行了预分离,再经反相色谱进一步分离纯化,得到分子量为5734Da的胰腺癌肿瘤差异蛋白,如将该蛋白进行进一步鉴定,有望成为新的肿瘤标志物。
陈曼[5]2006年在《高效液相色谱在白血病研究中的应用》文中研究表明高效液相色谱(HPLC)作为一种高效、快速的分离分析技术,已广泛的应用于众多的研究领域中,特别是多维色谱以及联用技术在蛋白质组学研究中的应用,也为进一步进行一些临床监测和疾病的早期诊断提供了研究的新技术和新思路,越来越使HPLC受到了关注。对临床复杂的样本,如何选择合适的HPLC分析手段来是实现临床的监测和早期诊断面临的一大课题。针对于此,本文将从白血病患者血清、白血病细胞以及慢性粒细胞白血病细胞株K562中入手,采集正常人血清、血浆和相关细胞株并用色谱分离,通过样本中差异蛋白的分析,建立了白血病蛋白质组学体系研究中HPLC方法。 论文包括四部分: 1.文献综述:概括的介绍了HPLC法在临床医学领域、蛋白质组学研究中的应用,以及目前蛋白质组学在白血病研究中的重要意义。 2.二维液相色谱-质谱分离鉴定白血病患者血清中的蛋白质:对叁种不同的二维色谱分离模式进行了条件优化,选用弱阴离子交换色谱-反相高效液相色谱作为血清蛋白质组研究中的分离方法,对白血病患者及健康人的血清蛋白进行了分离;采用基质辅助电离解析时间飞行质谱对分离组分进行了检测,通过分析质谱结果,找出了白血病患者与健康人血清中的差异蛋白。 3.HPLC分离-质谱鉴定K562细胞株蛋白:建立了二维色谱分离-基质辅助电离解析时间飞行质谱检测细胞蛋白的研究方法。通过反相高效液相色谱、弱阴离子交换色谱-反相色谱、排阻色谱-反相色谱这叁种色谱模式对K562细胞蛋白进行分离,收集的色谱馏分采用基质辅助电离解析时间飞行质谱检测,将这叁种分离模式所获得的蛋白质数据进行比较后得出结论:当选择排阻色谱-反相色谱构建K562细胞蛋白质图谱时,可以检测到分子量从2KD到130KD左右的120多种蛋白,所获得的蛋白质数目最多,信息最为全面。此法的建立为白血病的临床研究提供了一种有效的手段。
参考文献：
[1]. 色谱饼的优化设计及其在生物工程中的应用[D]. 严坤平. 西北大学. 2004
[2]. 人干扰素-γ和人干细胞因子在原核细胞中的表达、液相色谱复性并同时纯化[D]. 王骊丽. 西北大学. 2004
[3]. 制备液相色谱中整体蛋白高效快速分离新策略[D]. 陈刚. 西北大学. 2009
[4]. 单柱二维液相色谱复性变性溶菌酶及胰腺癌血清中肿瘤标志物的制备[D]. 王军. 西北大学. 2010
[5]. 高效液相色谱在白血病研究中的应用[D]. 陈曼. 西北大学. 2006