朱子龙[1]2004年在《大鼠脑干缺血再灌注模型制备—脑干缺血再灌注损伤病理和脑干血流变化》文中提出目的：脑干缺血再灌注模型的建立对于脑干缺血损伤及再灌注损伤的病理，病生理及药理学研究具有重要意义。目前国内外文献对此模型的研究鲜有报道，以往对于脑干缺血的研究只停留在脑干持续缺血后一系列病生理，电生理及生化等方面，并且多集中于犬、猴等大型动物。因此我们尝试应用大鼠制作脑干缺血再灌注模型，对再灌注后早期的病理，病生理进行了观察，并且观察了夹闭前后和再灌注前后脑干血流的变化。方法：雄性wistar大鼠，分为再灌注组，夹闭组和假手术组。于大鼠基底动脉(BA)第一无分支区和第二无分支区分别应用微型动脉夹夹闭若干时间后再行开放来制作缺血再灌注模型；缺血组只夹闭BA不予开放；而假手术组只暴露BA。观察大鼠BA夹闭再通后的神经症状。应用TTC(2，3，5-氯化叁苯基四氮唑)染色确定缺血范围及程度。分别在BA夹闭后0.5h，1h，2h，3h，6h及再灌注1h后取脑干组织进行光镜观察。应用激光多普勒技术测量基底动脉夹闭前后以及再通后的血流值。应用统计软件SPSS(10.0版)对相关数据进行统计学处理及分析。结果：两点夹闭基底动脉后大鼠出现不同程度的呼吸不规则、抽搐、呃逆、瞳孔扩大或缩小、对光反应减弱、肢体瘫痪及昏睡等症状，随着血管的再通，这些症状并没有减轻。TTC染色显示于第一、第二无分支区夹闭基底动脉后，缺血范围主要集中在脑桥和延髓上部。基底动脉闭塞后，脑干组织血流量较闭塞前明显减少，再通后血流量与闭塞前基线值并不一致，夹闭时间0.5h、1h和1.5h组的血流量较基线值高，而2h和3h组的再通后血流量较基线值低。光镜结果：夹闭0.5h未见组织缺血，可见组织出血，再灌注后可见明显的血管扩张充血及血管周围出血；夹闭1h未见组织缺血损伤；夹闭2h，可见缺血分界区，缺血区可见组织水肿，染色浅淡，部分神经元胞膜增厚、皱缩、核仁浓染，轻度髓鞘脱失，再灌注后，浅染区较闭塞组减少，髓鞘脱失不明显，但有明显的血管扩张出血和少量组织出血；夹闭3h，可见明显的缺血分界区，缺血中心区组织水肿、浅染、间隙增大，神经元有明显的缺血损伤，胞体出现空泡现象，尼氏体减少或消失，细胞皱缩等，可见轻度髓鞘脱失，再灌注后缺血损伤程度减轻，可见明显的出血现象；夹闭6h，缺血区明显扩大，有时可由腹侧延伸至背侧，缺血中心区出现神经元固缩和变性坏死，边缘区可见神经元胞体皱缩、尼氏体减少，髓鞘脱失严重，再灌注后缺血范围未见明显减小，并可见组织出血，髓鞘脱失严重，部分缺血区内可见白细胞浸润。结论：①夹闭大鼠基底动脉第一，第二无分支区后出现呼吸不规则、抽搐、呃逆、瘫痪、瞳孔变化、眼球震颤、意识障碍等神经功能障碍与临床脑干梗死患者所出现的症状有相似之处。②基底动脉再通后，大鼠所出现的神经症状未见明显改变。③病理学观察发现脑干缺血后所造成的超早期病理变化，随缺血时间的延续病理损伤愈严重。再灌注后，脑干缺血3h内超早期病理表现减轻；脑干缺血6h超早期病理表现没有明显减轻。④脑干局部血流值在基底动脉闭塞后较闭塞前明显降低，说明BA闭塞效果可靠；BA再通后，脑干局部血流值较再通前明显增加，但存在高灌注和低灌注现象，后者提示脑干的血管自动调节可能受损。⑤此模型由于大鼠脑血管解剖接近人类，手术过程操作相对简单，动物耐受性好，具有可重复性，费用低廉，可适用于急性脑干缺血再灌注的研究。
孙星亮[2]2012年在《缺血预处理对大鼠脑干缺血再灌注损伤影响的实验研究》文中指出目的：通过研究缺血预处理对大鼠脑干缺血再灌注后再灌注损伤的影响及BAX、GSH-Px表达变化，从而揭示缺血预处理对脑干的神经保护可能机制，进一步为脑干缺血耐受增强提供依据.并在临床上为脑干梗死特别是TIA反复发作后的脑干梗死病人溶栓时间窗的选择提供参考依据。方法：1雄性SD大鼠160只,体重300∽320g,随机分为假手术组、缺血组、缺血再灌注组、缺血预处理组（缺血组分为缺血1h、2h、3h、4h、5h，缺血再灌注组分为缺血1h再灌注7h,2h再灌注6h，3h再灌注5h，4h再灌注4h，缺血5h再灌注3h五个观察时间点，每组每个观察点8只大鼠，缺血预处理组先给予全脑缺血预处理3min，72h后再给予脑干缺血再灌注，各时间点同缺血再灌注组）。2缺血组只夹闭基底动脉相应时间；缺血再灌注组应用微型动脉夹夹闭基底动脉后间隔不同时间点打开动脉夹使血管再通；缺血预处理组采用改良的pulsinelli四血管阻断法给予大鼠全脑缺血3min，间隔3d后制备脑干缺血再灌注模型。各组造模成功并纳入实验后在相应时间点处死取材。3采用HE染色应用光镜观察细胞结构变化4采用TTC染色及脑干BAEP观察脑干缺血范围及程度5采用免疫组化观察BAX变化6采用酶联免疫吸附(ELISA)法观GSH-px的变化。结果：（1)HE染色可见假手术组神经细胞形态结构正常；缺血组随着缺血时间延长逐渐出现细胞水肿、炎性反应、细胞核固缩等逐渐加重表现。缺血再灌注组及缺血预处理组有类似的表现。缺血再灌注组在4h之前细胞损伤轻于缺血组；缺血预处理组在5h时间点之前细胞损伤不仅轻于缺血组且较再灌注组也减轻。（2）TTC染色显示假手术组各时间点均未见缺血表现，其余叁组1h时间点均未见明显缺血表现；再灌注组在缺血4h时间点之前再灌注时缺血情况小于缺血组，预处理组在缺血5h时间点之前再灌注时不仅小于相应时间点缺血组且小于相应时间点缺血再灌注组。（3）BAEP变化：缺血各实验组中其各波（Ⅰ波除外）在各时间点（再灌注组、预处理组在1h时间点除外）潜伏期及波峰间期与假手术组相比较均明显延长，有统计学意义（P<0.05)；再灌注组中1h、2h、3h时间点再灌注各波（Ⅰ波除外）潜伏期及波峰间期与缺血组相应时间点相比明显缩短（P<0.05)；缺血预处理组中1h、2h、3h、4h时间点再灌注各波（Ⅰ波除外）潜伏期及波峰间期不仅与缺血组相应时间点相比缩短，且与缺血再灌注组相应时间点比较进一步缩短。（4）免疫组化BAX显示：缺血各实验组中各时间点其BAX的表达与假手术组相比较明显增高，有统计学意（P<0.05)；缺血再灌注组中1h、2h、3h时间点再灌注其BAX的表达与缺血组相应时间点比较明显降低（P<0.05)；缺血预处理组中1h、2h、3h、4h时间点再灌注不仅与缺血组相应时间点比较明显降低（P<0.05)，且与缺血再灌注组相应时间点比较显着减少（P<0.05)。（5）GSH-px活性变化：缺血各实验组中各时间点其GSH-Px的表达与假手术组相比较明显降低，有统计学意义（P<0.05)；缺血再灌注组中1h、2h、3h时间点再灌注其GSH-Px的表达与缺血组相应时间点比较明显增高（P<0.05)；缺血预处理组中1h、2h、3h、4h时间点再灌注不仅与缺血组相应时间点比较明显增高（P<0.05)，且与缺血再灌注组相应时间点比较显着增高（P<0.05)。结论：（1）脑缺血预处理模型及脑干缺血再灌注模型简单、经济、实用。其中脑干缺血再灌注模型夹闭基底动脉第一、第二无分支区，缺血稳定，动物死亡率低。（2）BAEP能够灵敏反映脑干缺血及再灌注损伤程度，其变化趋势表明缺血预处理能够延长脑干再灌注时间窗。（3）脑缺血预处理可以通过下调脑干缺血再灌注后BAX表达，上调GSH-Px活性表达，延长脑干缺血再灌注时间窗，明显减轻脑干缺血再灌注损伤。
李娇红[3]2012年在《依达拉奉预处理对大鼠脑干缺血再灌注损伤的保护机制研究》文中认为目的：目前，医学家们渐渐发现，在缺血性疾病抢救和治疗过程中，对组织细胞造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是恢复血液再通后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内的细胞造成的，这种损伤，叫做“组织缺血再灌注损伤”（IRI）。脑血管病（VCD）是由各种脑血管病变所引起的局灶性或弥漫性脑功能缺失为共同特征的脑血管疾病，它是一种常见病、多发病，严重威胁着人类的健康和生命，其病死率、致残率、复发率均高。在临床脑血管病的分类中，脑梗死（CI）占2/3[1]。椎基底动脉闭塞引起的卒中约占缺血性卒中的20%，它的病死率和致残率均明显较颈内动脉引起的卒中高，其中以脑干梗死危害最大。依达拉奉（edaravone EDA）作为特异性强效的自由基清除剂，目前已广泛应用于脑缺血再灌注损伤中，大量临床研究也证实其可清除自由基及由自由基引发的脂质过氧化，抑制脑水肿及迟发性神经细胞的死亡，从而有效改善神经缺损症状[2,3]。同时发现，EDA对机体多种脏器及组织的缺血再灌注损伤有保护作用[4-6]，但有关EDA在脑干缺血再灌注损伤过程中的作用机制国内还未见报道。脑干作为人的意识和生命中枢，对它缺血损害的积极治疗和提前预防都显得尤为重要。因此本实验采用大鼠基底动脉第一无分支区和第二无分支区之间的脑干缺血再灌注模型，用EDA对大鼠预处理，观察其对大鼠脑干缺血再灌注损伤后MDA、SOD等方面的影响，并探讨研究EDA对脑干缺血再灌注损伤的保护作用，为临床应用提供实验依据。方法：1实验分组和大鼠模型制备：健康清洁级SD大鼠55只，雄性，月龄2个月左右，体重250g左右，实验动物随机分为3组，即假手术组（N组）5只、缺血再灌注组（IR组）和依达拉奉预处理组（E组）各25只。其中缺血再灌注组根据缺血时间不同分为缺血1h灌注7h（I_1R_7），缺血2h灌注6h（I_2R_6），缺血3h灌注5h（I_3R_5），缺血4h灌注4h（I_4R_4），缺血6h灌注2h（I_6R_2），共5个亚组。每个亚组5只老鼠。其中N组：暴露基底动脉（BA）第一无分支区和第二无分支区，观察8小时；IR组：暴露基底动脉第一无分支区和第二无分支区，于各个时间点用微型动脉夹夹闭相应时间缺血再灌注对应时间；E组：于各亚组实验前10分钟于大鼠尾静脉注射依达拉奉6mg/kg，其他同IR组。2检测指标及检测方法：TTC染色：TTC(2，3，5一氯化叁苯基四氮唑)呈脂溶性，对光敏感，与正常组织细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应后呈红色，而缺血组织细胞内的琥珀酸脱氢酶活性下降，不能与之反应而使脑组织呈苍白色[7]。它是评价脑缺血损伤常用指标之一。HE染色、光镜观察：N组观察8小时，IR组及E组于术后断头取脑处死大鼠，取脑干组织，置于10%多聚甲醛中固定，切片HE染色，在200倍光镜下观察脑干组织的病理改变。测定脑干中丙二醛（MDA）、NO含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力：采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用硫化巴比妥酸（TBA）比色法检测丙二醛（MDA）含量；采用硝酸还原酶法检测NO含量。以上试剂盒购于南京建成生物工程研究所。采用放射免疫法测定大鼠血浆中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)的含量。结果：各组动物的体重250～320g、月龄2～2.5月。TTC染色：假手术组（N组）脑干组织为红色；缺血再灌注组（IR组）正常脑干组织红色，梗死灶呈苍白色；依达拉奉预处理组（E组）与相对应IR组比较，梗死灶苍白色范围缩小。HE染色、光镜下观察：假手术组（N组）脑干组织结构未见明显病理改变；缺血再灌注组（IR组）细胞水肿明显，胶质细胞弥漫增生，神经细胞可见变性、坏死及出血；依达拉奉预处理组（E组）示脑干组织病理改变较相对应IR组明显减轻。脑干组织的MDA、 NO含量的变化：与N组相比，IR组脑干组织中MDA含量明显升高（P<0.05），E组脑干组织中MDA含量升高较IR组不明显；与IR组比较，E组脑干组织中MDA含量明显降低（P<0.05）。与N组相比，IR组脑干组织中NO含量明显升高（P<0.05），E组脑干组织NO含量升高不明显。脑干组织的SOD活性：与N组相比，IR组脑干组织中SOD活性明显降低（P<0.05），E组脑干组织中SOD活性亦降低；与IR组比较，E组脑干组织中SOD活性明显升高（P<0.05）。脑干组织中TNF-a的含量变化：与N组相比，IR组脑干组织血浆中TNF-a的含量明显增高（P<0.05）；与IR组比较，E组脑干组织中TNF-a的含量明显减少（P<0.05）。结论：依达拉奉对大鼠脑干缺血再灌注损伤有较好的保护作用，其机制可能与通过清除自由基，对抗脂质过氧化，抑制NO、TNF-a释放，增加SOD活性、减少MDA含量有关。且依达拉奉预处理可适当延长脑干再灌注时间窗。
周莉[4]2012年在《大鼠脑干缺血再灌注时间窗的实验研究》文中研究表明目的：急性脑缺血性疾病患者治疗的关键是在短时间内迅速恢复缺血周边半暗带区血流，使神经细胞可存活并恢复功能，减少或避免脑功能的缺损。目前，国内外对后循环的再灌注时间窗（即溶栓治疗时间窗）的时限争议较多。建立动物脑干缺血再灌注模型的不仅可以反应出脑干组织缺血损伤及再灌注机制，也可以为临床确立有效安全的治疗时间窗提供实验依据。目前国内外对脑干持续性缺血模型的研究多集中于大型动物，而对大鼠脑干缺血再灌注模型的报道甚少。本实验是通过建立大鼠脑干缺血再灌注的模型，设立不同缺血及再灌注点观察大鼠神经症状、脑干缺血组织病理学改变以及BAEP、超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）含量的变化来探讨脑干缺血后再灌注时间窗和再灌注损伤机的可能机制。方法：健康雄性SD大鼠100只，体重250～320g，随机分为3组：假手术组（20只）、缺血组（40只）、缺血-再灌注组（40只），缺血组再分为I_1、I_2、I_3、I_4、I_6，5个亚组（每组8只），缺血-再灌注组再分为I_1R_7、I_2R_6、I_3R_5、I_4R_4、I_6R_2，5个亚组（每组8只）。应用微型动脉夹夹闭大鼠的基底动脉(BA)第一无分支区和第二无分支区处，夹闭相应时间后再行开放来制作缺血-再灌注模型；缺血组只夹闭BA不予以开放；而假手术组仅暴露BA。观察大鼠BA缺血后及再灌注后的神经症状；行TTC(2，3，5-氯化叁苯基四氮哇)染色确定脑干缺血范围及程度；光镜观察缺血及再灌注后不同时间点脑干组织的病理改变。运用脑干诱发电位的监测大鼠术后不同时间点BAEP的变化,记录和分析波峰潜伏期与波峰间期；采用比色法测定缺血组及再灌注组各亚组脑干组织SOD活力、MDA的含量，并进行分析；结果：1、假手术组在术后各时间点均未出现神经功能障碍；缺血组和再灌注组出现瞳孔扩大或缩小，对光反应减弱、呼吸节律不规则、呃逆、抽搐、昏睡及肢体活动障碍等神经症状，随着血管的再通后，这些神经症状有所减轻。2、TTC染色观察：假手术组呈红色、无脑梗死发生；I_1和I_1R_7组脑干呈红色：余缺血组和再灌注组脑干组织缺血范围主要集中在脑桥和延髓上部；3、光镜结果：假手术组的神经细胞、血管等结构未见明显病理改变；I_1组未见组织缺血，I_1R_7组可见明显的血管扩张充血及血管周围出血；I_2组，缺血灶与正常脑组织有明显的分界区，缺血区染色浅淡，见组织水肿，部分神经元胞膜增厚、皱缩、核仁浓染，I_2R_6组，也有明显的分界区，但浅染区较缺血组减少，血管扩张出血较明显，有少量组织出血；I_3组，缺血灶与正常脑组织也有明显的分界区，浅染区较缺血组减少，缺血中心区内组织水肿、间隙增大，神经元缺血损伤明显，胞体出现空泡现象，尼氏体减少或消失，细胞皱缩等，I_3R_5组缺血损伤程度有所减轻，但出血现象较明显；I_4、I_6组，缺血区与I_2、I_3组比较明显扩大，由脑干腹侧可以延伸至背侧，缺血中心区可见神经元固缩、变性坏死，边缘区可出现神经元胞体皱缩、尼氏体减少，I_4R_4、I_6R_2组与I_4、I_6组比较缺血范围未见明显减小或扩大，亦可见组织出血。4、BAEP变化：①脑干缺血各实验组Ⅰ波潜伏期与假手术组比较无统计学意义(P>0.05)；②缺血组与再灌注组各亚组（除I_1R_7组外）其Ⅲ、Ⅴ波潜伏期及Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅴ波峰间期与假手术组比较明显延长，有统计学意义（P<0.05），且随着缺血时间的延长有逐渐增加的趋势；③再灌注组中I_1R_7、I_2R_6、I_3R_5亚组其Ⅲ、Ⅴ波潜伏期及Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅴ波峰间期与缺血组相应时间点比较明显缩短，有统计学意义（P<0.05）。5、SOD活力、MDA含量变化：①缺血组和再灌注组各时间点的SOD活力显着低于假手术组，有统计学意义（P<0.05），随着缺血时间的延长SOD活力有逐渐降低趋势；②再灌注组中I_1R_7、I_2R_6、I_3R_5亚组其SOD活力与缺血组相应时间点比较明显增高，有统计学意义（P<0.05）。③缺血组和再灌注组各时间点的MDA含量显着高于假手术组，有统计学意义（P<0.05），随着缺血时间的延长MDA含量有逐渐升高趋势；④再灌注组中I_1R_7、I_2R_6、I_3R_5亚组其MDA含量与缺血组相应时间点比较明显降低，有统计学意义（P<0.05）。结论：1、由于大鼠脑血管解剖接近人类，采用夹闭大鼠基底动脉第一，第二无分支区可以制作脑干稳定的缺血且不易造成动物死亡，适用于急性脑干缺血再灌注的实验研究。2、病理学观察发现脑干缺血后易造成早期病理变化，且随缺血时间的延长而加速脑组织病理损伤。在缺血4h内再灌注能减轻脑组织损伤，提示脑干缺血再灌注时间窗可能在4h以内。3、BAEP的变化及MDA、SOD的表达能较好的反映脑干缺血后脑组织的损伤程度和缺血组织清除氧自由基的能力。其变化趋势进一步说明脑干缺血4h后再灌注可能加重脑组织的损伤。
张磊[5]2009年在《Homer和Shank基因表达改变在脑损伤和脑胶质瘤病理过程中的意义》文中研究表明本研究主要分为两部分。第一部分:脑损伤后脑内Homer与Shank基因的改变及意义脑损伤主要包括创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)和缺血性脑损伤,残、死率高[1-2]。脑损伤的发生、发展可能与谷氨酸神经毒性、钙离子超载、炎症反应和血-脑脊液屏障破坏等因素有关,但其确切的分子病理机制尚不清楚,这是治疗效果差的根本原因[3-4]。我们曾在体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤模型上,发现一种即早基因( immediately early gene,IEG) Homer及其下游分子Shank,能调控多种细胞分子,通过多种信号通路广泛参与脑损伤发生、发展的核心过程[5]。本课题拟在以往工作基础上,通过在体动物的多种脑损伤模型,如侧向瞬时旋转致弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)模型、Marmarou加速致弥漫性脑损伤(diffuse brain injury,DBI)模型及缺血性脑损伤模型,检测Homer和Shank在损伤脑组织中的表达及其意义,为探索脑损伤的发生机制及其相关治疗提供理论依据。实验一大鼠DAI后,脑内Homer的表达改变及意义目的:研究大鼠DAI后,脑内Homer蛋白各亚型表达变化规律及意义。方法:选择成年雄性SD大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术组与DAI后30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h共10组,每组12只;应用侧向瞬时旋转致DAI,取大鼠脑干区主要核团、皮层和海马组织进行检测;采用免疫组化染色法行免疫组化评分检测;Western blot法行蛋白测定;实时荧光定量RT-PCR法行mRNA测定。结果:①免疫组织化学法结果显示,正常对照组和假手术组中神经元Homer1a染色呈阴性,DAI组神经元Homer1a染色呈阳性,阳性染色呈颗粒状分布于胞浆、胞膜及突起结构;伤后30 minHomer1a蛋白出现表达,一直持续至伤后72 h,与正常对照组和假手术组Homer1a蛋白免疫评分相比,DAI后24h出现表达高峰(P<0.01);Homer1b/c在各组神经元中均有一定程度表达,但表达量无明显变化;②与正常对照组和假手术组相比较,在DAI后30min,Homer1a蛋白及其mRNA开始表达,1h ~72 h表达量明显增加,在24h达到高峰(P<0.01),但72h仍维持较高水平(P<0.05);③Homer1b/c在正常对照组、假手术组和DAI组神经元中均有一定程度表达,无论蛋白还是mRNA表达水平,其表达量均无明显变化(P > 0.05);④DAI后,在30min~24h,脑干Homer1a蛋白及其mRNA表达量均大于皮层和海马(P<0.05),但在48~72h无统计学差异(P>0.05);其在皮层和海马之间无差异(P>0.05);Homer1b/c蛋白及其mRNA表达量在上述叁个部位也无差异(P>0.05)。结论:DAI刺激可诱导Homer1a基因快速表达,可能与DAI后,大量谷氨酸释放,细胞兴奋性增加有关,而Homer1b/c表达不受神经元兴奋性活动调节。结合以往文献认为,DAI后,动态表达的Homer1a与持续表达的Homer1b/c共同调节mGluR1a的结构和功能,其机制可能是Homer1a与Homer1b/c竞争结合mGluR1a,减少细胞内Ca2+超载,调节mGluR1a在突触部位的分布及受体信号传递效率,防止mGluR1a过度兴奋。神经元兴奋性增高时,Homer1a表达增加,这是一种自然的、选择性地调节mGluR1a与Homer1b/c结合的负反馈机制。而脑组织不同部位Homer1a表达量存在差异可能与侧向旋转DAI致伤模型造成中线部分受损最严重有关,提示根据Homer1a表达量多少可判断脑损伤严重程度。实验二大鼠DBI后,脑内Homer的表达改变及意义目的:研究大鼠DBI后,脑内Homer蛋白各亚型表达变化规律及意义。方法:选择成年雄性SD大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术组DBI后30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h共10组,每组12只;采用Marmarou加速致DBI模型,其它检测内容和方法同实验一。结果:①免疫组织化学法结果显示,正常对照组和假手术组中神经元Homer1a染色呈阴性,DBI组神经元Homer1a染色呈阳性,阳性染色呈颗粒状分布于胞浆、胞膜及突起结构;伤后30 min Homer1a蛋白开始表达,一直持续至伤后72 h,与正常对照组和假手术组Homer1a蛋白免疫评分相比,DBI后24h出现表达高峰(P<0.01),同时,Homer1a在损伤胶质细胞中也表达;Homer1b/c在各组神经元中均有一定程度表达,但表达量无明显变化;②与正常对照组和假手术组相比,DBI后3h和24h,Homer1a蛋白及其mRNA表达量出现2个峰值(P<0.01),72h时仍维持较高水平(P<0.05);③Homer1b/c结果同实验一结果;④DBI后30min~24h,Homer1a蛋白及其mRNA表达量在皮层和海马均大于脑干的相应值(P<0.05),而在48~72h两者无差异(P>0.05);实验中,Homer1a蛋白及其mRNA表达量在皮层和海马之间无差异改变(P>0.05),而且,Homer1b/ c蛋白及其mRNA表达量在脑干、皮层和海马之间也无差异改变(P>0.05)。结论:DBI后Homer1a表达有两个高峰,第一个高峰的出现可能与早基因蛋白Homer1a竞争性与Homer1b/c结合代谢性谷氨酸受体,降低其在突触部位的聚集量,减少细胞内Ca2+超载有关;第二个高峰的出现可能与Homer1a还可能参与促进受损神经元和胶质细胞病理性凋亡有关,这种Homer1a蛋白上调可能对受损脑组织有保护作用。另外,与实验一DAI后的结果不同,Homer1a表达量在海马和皮层明显增高,这可能与模型不同、海马和皮层受损更严重、发生机制不同有关。实验叁大鼠缺血再灌注脑损伤后,脑内Homer的表达改变及意义目的:研究大鼠缺血再灌注脑损伤后,脑内Homer蛋白各亚型表达变化规律及意义。方法:选择成年雄性SD大鼠120只,随机分为正常对照组、假手术组与缺血再灌注脑损伤后30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h共10组,每组12只;采用大脑中动脉阻塞致缺血再灌注损伤模型(MCAO),其它检测内容和方法同实验一。结果:①免疫组织化学法结果显示,正常对照组和假手术组中神经元Homer1a染色呈阴性,损伤组神经元Homer1a染色呈阳性,阳性染色呈颗粒状分布于胞浆、胞膜及突起结构;缺血再灌注损伤后30 min Homer1a蛋白开始表达,一直持续至伤后72 h,与正常对照组和假手术组Homer1a蛋白免疫评分相比,损伤后24h出现表达高峰(P<0.01),同时,Homer1a在损伤胶质细胞中也表达;Homer1b/c在各组神经元中均有一定程度表达,但表达量无明显变化;②与正常对照组和假手术组相比,缺血再灌注脑损伤后,Homer1a蛋白及其mRNA表达量出现30min(P<0.01)、3h(P<0.01)和24h(P<0.01)3个高峰,72h时仍维持较高水平(P<0.05);③Homer1b/c结果同实验一结果。结论:首先,缺血再灌注损伤后Homer1a表达有叁个高峰,伤后30min出现的第一个高峰,可能与缺血损伤和再灌注损伤“迭加”,在损伤早期共同刺激及早基因Homer1a大量表达,与Homer1b/c竞争结合mGluRs,降低其在突触部位的聚集量,减少细胞内Ca2+超载有关,DBI后无此表达高峰。其余两个表达高峰则与Homer1a调节mGluRs分布,及促进神经元和胶质细胞病理性凋亡有关;其次,缺血再灌注脑损伤后Homer1a表达时空变化规律与上述两个实验结果不同,可能与发生机制不同,缺血性脑损伤病理生理过程牵涉更多、更复杂信号通路有关。实验四大鼠脑损伤后,脑内Shank各亚型的表达改变及意义Shank是一种多结构域的骨架蛋白,可介导多种蛋白连接而成功能复合体,包括3个亚型,Shank1,Shank2和Shank3,在神经系统有广泛分布,对于维持神经元突触的形态和功能有重要作用[6-7]。文献报道,Shank蛋白通过调控Homer蛋白与mGluRs的锚定与信号传导过程,参与了突触可塑性、学习和记忆等的病理生理机制。但是脑损伤后不同亚型Shank蛋白的表达时空变化规律,以及与脑损伤的关系等都未见报道。目的:本课题拟在以往工作基础上,通过上述3种在体动物脑损伤模型,初步检测脑损伤后不同亚型Shank蛋白的表达时空变化规律以及与脑损伤的关系,力求寻找出关键性Shank分子,为探索脑损伤的发病机制及其相关治疗提供了实验依据。方法:取上述3种模型致损伤后的大鼠皮层组织进行检测。采用免疫组化染色法和Western blot法行蛋白定位定量测定,实时荧光定量RT-PCR法行mRNA测定。结果:①免疫组织化学法结果显示,在3种模型中,脑损伤前后,Shank的3个亚型- Shank1、Shank2和Shank3都阳性表达,它们的阳性染色都呈颗粒状分布于胞浆、胞膜及突起结构。②DAI后,Shank的蛋白定量和mRNA定量检测结果一致。Shank1,在所有组别都高表达,无变化趋势,损伤前后表达量一致(P>0.05);Shank2,正常组和假手术组都有表达,DAI后30 min其表达量开始增加,6h达到高峰(P<0.01),随后下降,72h又出现表达高峰(P<0.01);Shank3,正常组和假手术组都有表达,DAI后,30min到6h一直高表达(P<0.01),然后开始下降,至72h仍维持较高水平(P<0.05)。③DBI后,Shank的蛋白和mRNA定量检测结果一致。Shank2,正常组和假手术组都有表达,DBI后30 min其表达量开始增加,在3h到6h期间达到高峰(P<0.01),而DBI前后Shank1和Shank3亚型表达变化结果,和DAI前后此两个亚型结果基本一致。④缺血再灌注损伤后,Shank的蛋白和mRNA定量检测结果一致。Shank1,正常组和假手术组都有表达,损伤后30min其表达量开始增加,出现2个高峰,3h(P<0.01)和12h(P<0.01),随后下降,至72h仍维持较高水平(P<0.05);Shank2,在所有组别都高表达,无变化趋势,损伤前后表达量一致(P>0.05);Shank3,正常组和假手术组都有表达,损伤后30min其表达量开始增加,3h达到最高峰(P<0.01),然后开始下降,至12h开始下降明显(P>0.05),至72h时表达量和正常组表达量一致(P>0.05)。结论:我们首次在脑损伤后,对脑皮层组织中Shank的表达变化及意义进行研究。首先,Shank各亚型在损伤前后都有表达,但表达量有明显变化,证明Shank可能在维持和调节神经元兴奋性方面发挥重要的功能,而且各亚型蛋白通过结合不同的信号分子,参与不同的信号通路共同调节神经元功能;其次,DAI和DBI后,损伤刺激可诱导Shank2和Shank3基因快速表达,可能与损伤后,大量谷氨酸释放,Shank和动态表达的Homer1a相结合,改变信号传导信息,共同影响细胞兴奋性,而Shank1表达不受神经元兴奋性活动调节,这些变化提示动态表达的Shank2和Shank3可能与持续表达的Shank1共同调节Homer、mGluRs以及其他信号分子的结构和功能,影响细胞内Ca2+超载,共同调节神经元的兴奋性;再次,缺血性损伤后Shank各亚型表达变化和创伤性脑损伤后Shank亚型表达变化差异很大,提示3种类型脑损伤病理生理过程可能不一致,复杂多变的信号通路在各种脑损伤的发病机制中发挥不同的作用;最后,脑内Shank各亚型在不同类型脑损伤后有不同表达变化,提示其可能成为潜在的靶向诊治脑损伤的目标。第二部分:Homer在脑胶质瘤中表达、功能及作用机制的研究脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其发生率约占颅内肿瘤的45%,恶性脑胶质瘤患者术后中位生存期尚不足一年[8-9]。脑胶质瘤治疗困难的根源与其所具有的恶性生物学特性密切相关。研究表明,脑胶质瘤表现有过度增殖、对抗凋亡以及旺盛的血管形成等恶性表型[10-11]。揭示决定脑胶质瘤恶性生物学行为的关键基因对于攻克人类这一顽疾有着重要的科学意义和临床应用价值。结合文献和我们预实验结果发现,Homer在人脑胶质瘤的细胞凋亡和血管形成过程中扮演重要角色,提示Homer与人类肿瘤的形成和发展有着密切关系。目前,未见有关Homer与脑胶质瘤发生与发展关系的研究,Homer在脑胶质瘤恶性增殖、抗凋亡以及血管形成中的作用很不清楚。基于此,本课题从以下叁个方面进行了研究。实验一Homer1在人脑胶质瘤中的表达及意义目的:研究Homer1在人脑胶质瘤中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学化方法、Western-blot和实时荧光定量RT-PCR检测Homer1蛋白在3株人脑胶质瘤细胞系(U251、U87和SHG-44)、60例人脑胶质瘤组织和5例正常人脑组织中的表达水平。结果:①免疫组化结果显示:SHG-44和U87细胞中Homer1a染色呈强阳性,在U251细胞中弱阳性染色,肿瘤细胞的阳性染色都呈颗粒状分布于胞核、胞浆、胞膜及突起结构。3株细胞系中Homer1b/c染色呈阴性;Homer1a蛋白在人脑胶质瘤及正常人脑组织中的表达阳性率及免疫反应评分(IRS)分别为61.8%、4.35±3.99和1.2%、0.09±0.35(P均<0.01);Homer1a蛋白表达阳性率和IRS与脑胶质瘤Ⅰ~Ⅳ级病理级别间呈“U”型关系,其中Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ级间差异非常显着(P<0.01),Ⅳ和Ⅱ、Ⅲ级间差异非常显着(P<0.01),Ⅰ和Ⅳ级、Ⅱ和Ⅲ级间差异显着(P<0.05),良、恶性脑胶质瘤之间Homer1a蛋白表达阳性率差异显着(P<0.05);Homer1b/c在人脑胶质瘤标本中不表达。②Homer1a蛋白及其mRNA在SHG-44和U87细胞中高表达,在U251细胞中低表达。Homer1b/c蛋白及其mRNA在3株细胞系中均无表达;Homer1a蛋白表达水平与Homer1 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05);其他结果,mRNA表达情况和蛋白表达情况一致。结论:以上结果提示Homer1a蛋白和mRNA在人脑胶质瘤中有表达,并与脑胶质瘤的发生和发展密切相关;Homer1b/c不参与人脑胶质瘤发生和发展。实验二人Homer1基因真核干涉表达的构建和鉴定目的:构建人Homer1基因真核干涉表达载体,并转染人脑胶质母细胞瘤U87细胞。方法:根据人Homer1a基因序列,设计、合成了针对人Homer1的特异性RNAi片断,并克隆入pGCsi载体,构建了Homer1a shRNA真核干涉表达载体pGCsi-H1。通过脂质体介导的基因转染方法将将干涉载体pGCsi-H1和空载体pGCsi质粒以及阴性对照质粒pGCsi-NC分别转染入人脑胶质母细胞瘤U87细胞,暂时分别命名为U87-H1、U87-P和U87-NC。结果:实时荧光定量RT-PCR检测证实U87-H1细胞Homer1 mRNA表达受到明显抑制, Western blot检测证实U87-H1细胞Homer1a蛋白表达也受到明显抑制。结论:Homer1 shRNA成功抑制了Homer1 mRNA和蛋白表达,这为进一步研究Homer1a在胶质瘤中的生物学意义和其作用机制奠定了实验基础。实验叁重组人pEGFP-N1-Homer1-GFP基因表达质粒的构建目的:克隆人Homer1基因的全长cDNA,并构建其真核表达载体。方法:从人脑组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增Homer1基因的全系列cDNA。将Homer1基因插入真核表达载体pEGFP-N1中EGFP基因的5‘端,获得与EGFP融合表达的真核表达质粒pEGFP-N1-Homer1-GFP。结果:经双酶切及测序鉴定证实人Homer1基因的真核表达载体构建成功。免疫印迹法证实人Homer1基因的表达。结论:成功克隆了人Homer1编码区序列,并构建了其真核表达载体,为胶质瘤等中枢神经系统恶性肿瘤的治疗奠定基础。
王爱平[6]2016年在《泻火化瘀通窍法影响大鼠耳蜗缺血再灌注损伤Caspase-8/3及Fas系统的实验研究》文中研究指明目的:当各级听中枢或听神经、螺旋器的毛细胞发生病变,导致对声音的感受与神经冲动的传导发生障碍,此即为感音神经性耳聋,是耳鼻喉科的临床常见病和多发病,内耳血流障碍是导致其发生的主要因素。越来越多的研究证实,缺血后的再灌注损伤会加重缺血导致内耳血流障碍。缺血再灌注损伤是一个复杂的病理和生理过程,是多个因素和靶点参与的反应。在近些年中医治疗内耳疾病的报道中,活血化瘀类药物最为常用和有效,其次是清肝泻火类药物,本实验中,将活血化瘀与清肝泻火联合用药结合形成泻火化瘀通窍法,以达到增加疗效的目的。本实验旨在探索(1)血管阻断法在大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型造模中的应用;(2)泻火化瘀通窍法对血管阻断法大鼠耳蜗缺血再灌注损伤的影响;(3)探明泻火化瘀通窍法改善耳蜗缺血再灌注损伤的分子作用机制。材料与方法:动物造模与分组:采用血管阻断法造模,造模成功后,将大鼠分为五组,每组12只,分别为正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组。实验方法:正常组:不给药;模型组:造模成功后,正常饮食不给药。清肝泻火组:造模成功后一天,每天分两次给予清肝泻火药物灌胃,每次2ml,每只大鼠均连续灌胃7天;行气活血化瘀组:造模成功后一天,每天分两次给予行气活血化瘀药物灌胃,每次2ml,含药物2g,每只大鼠均连续灌胃7天;泻火化瘀通窍组:造模成功后一天,每天分两次给予泻火化瘀通窍药物灌胃,每次2ml,共含药物5g,每只大鼠均连续灌胃7天。实验指标:(1)各组大鼠分别与造模后、用药前和用药后7天检测听觉脑干诱发电位ABR阈值;(2)用解剖显微镜对耳蜗基底膜铺片毛细胞进行观察;(3)TUNEL法检测细胞凋亡;(4)制备耳蜗组织匀浆,采用TBA法和可见光法对耳蜗组织的MDA含量和CAT活性进行检测;(5)荧光定量PCR技术检测Caspase-8、Caspase-3的mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹(western blot)检测Caspase-8、Caspase-3的蛋白表达;(6)实时荧光定量PCR检测耳蜗组织中Fas、FasL mRNA水平变化;westernblot检测耳蜗组织中fas、fasl蛋白表达水平的变化;(7)梯度pcr检测耳蜗组织中xiap、xaf1mrna水平变化;westernblot检测耳蜗组织中xiap、xaf1蛋白表达水平的变化。统计学处理:采用spss18.0统计软件,计量数据以均数±标准差sx)(±表示,单因素方差分析(one-wayanova),组间比较采用最小显着差法(lsd)方法,以p<0.05和p<0.01作为显着性和极显着性差异的标准。结果:1.泻火化瘀通窍组治疗后听觉脑干诱发电位abr阈值显着低于模型组、清肝泻火组和行气活血化瘀组(p<0.05-0.01)。正常组的阈值最低,与其他组相比具有显着性差异p<0.05。2.耳蜗基底膜铺片基底膜外毛细胞显微结构观察显示:正常组外毛细胞分布呈叁排,可清晰看到外毛细胞分布均匀,排列整齐,无明显缺失;模型组、清肝泻火组见外毛细胞大部分变形,排列严重紊乱,崩解破坏,大片缺损,细胞连接消失,纤毛倒伏严重,外毛细胞结构出现极其严重的破坏,出现坏死和凋亡;行气活血化瘀组见外毛细胞排列较为整齐,部分变形,部分出现坏死;泻火化瘀通窍组见外毛细胞排列整齐,散在缺失,个别轮廓不清。模型组及清肝泻火组外毛细胞损伤较重,细胞出现凋亡和坏死,泻火化瘀通窍组及行气活血化瘀组外毛细胞损伤相对较轻,且行气活血化瘀组损伤相对于泻火化瘀通窍组损伤更为明显。3.正常组阳性细胞荧光基本分布在血管纹区域,基底膜上几乎无表达。模型组与药物干预组的基底膜上的叁排外毛细胞荧光信号明显增多、增强,与正常组相比差异有统计学意义(p<0.01);而与模型组相比,泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组的毛细胞荧光信号明显减少(p<0.01),散在分布在基底膜上,且泻火化瘀通窍组这一表现更加明显(与行气活血化瘀组比较有统计学意义,p<0.05)。而清肝泻火组的毛细胞信号较泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组则明显增强(p<0.01)。4.耳蜗组织中丙二醛(mda)含量与cat活性测定结果显示:模型组和清肝泻火组的mda含量最高,显着高于其他各组(p<0.05),说明模型组和清肝泻火组两组大鼠的耳蜗微循环障碍最严重,泻火化瘀通窍组与清肝泻火组和模型组比较具有显着差异(p<0.05)。正常组的cat活性最高,显着高于其他组(p<0.05);泻火化瘀通窍组的cat活性显着高于行气活血化瘀组,差异具有统计学意义(p<0.05),与清肝泻火组及模型组相比较具有极显着差异(p<0.01)。5.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中caspase-8mrna和caspase-3mrna的表达量。结果显示与正常组相比,其余各组caspase-8和caspase-3mrna的表达均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01~0.05),而与模型组、清肝泻火组相比,行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组caspase-8和caspase-3mrna的表达则明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。westernblot检测各组caspase-8、caspase-3蛋白表达,结果与mrna表达结果类似,与正常组相比,其余各组caspase-8和caspase-3蛋白表达均明显增高,差异具有统计学意义(p<0.05),而与模型组、清肝泻火组相比,行气活血化瘀组和泻火化瘀通窍组caspase-8和caspase-3蛋白表达则明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。泻火化瘀通窍组较行气活血化瘀组表达显着降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中fasmrna和faslmrna的表达量,结果显示与正常组相比,模型组及清肝泻火组fas、faslmrna的表达水平显着增高,差异具有统计学意义(p<0.01~0.05),而与模型组与清肝泻火组相比,行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组fas、faslmrna的表达水平显着降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。westernblot检测各组fas、fasl蛋白表达,泻火化瘀通窍组fas、fasl蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组显着降低,差异具有统计学意义(p<0.01);而行气活血化瘀组fas、fasl蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也又显着降低,差异具有统计学意义(p<0.01);而清肝泻火组、模型组fas、fasl蛋白表达水平比正常组则明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01)。泻火化瘀通窍组较行气活血化瘀组表达显着降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。7.检测正常组、模型组、清肝泻火组、行气活血化瘀组、泻火化瘀通窍组耳蜗组织中xiap、xaf1mrna的表达。正常组呈现较低表达,与其他各组相比有极显着差异(p<0.01);泻火化瘀通窍组和行气活血化瘀组xiapmrna表达水平较清肝泻火组、模型组明显增高(p<0.01);但是清肝泻火组和模型组两组xiapmrna表达水平没有明显差异(p>0.05)。正常组的xiap蛋白有表达,模型及药物干预各组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.01);泻火化瘀通窍组xiap蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组显着增高(p<0.05,p<0.01);而行气活血化瘀组xiap蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也显着增高(p<0.05);但是清肝泻火组和模型组两组xiap蛋白表达水平没有明显差异(p>0.05)。正常组中xaf1mrna有表达,模型组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.01);泻火化瘀通窍组xaf1mrna表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组明显降低(p<0.05,p<0.01),;然而清肝泻火组与模型组两组xaf1mrna表达水平没有明显差异(p>0.05);行气活血化瘀组xaf1mrna表达水平也较正常组明显增高(p<0.01)。正常组的xaf1蛋白有表达,模型及药物干预各组表达水平与正常组相比明显增高(p<0.05);泻火化瘀通窍组xaf1蛋白表达水平较行气活血化瘀组、清肝泻火组、模型组明显降低(p<0.05,p<0.01);同样的,行气活血化瘀组xaf1蛋白表达水平较清肝泻火组、模型组也由明显降低(p<0.01);然而清肝泻火组与模型组两组xaf1l蛋白表达水平没有明显差异(p>0.05)。结论:1.血管阻断法可用于建立大鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型,该建模方法操作简单、可靠性高、造模成功率高、对动物的伤害小,模型动物均出现耳蜗缺血再灌注损伤,值得推广应用。2.大鼠耳蜗缺血再灌注损伤可显着提高听阈,模型建立成功后24h时听阈即显着增加(p<0.05),7d后听阈维持无明显变化。3.泻火化瘀通窍法具有缓解耳蜗缺血再灌注损伤、降低大鼠听觉脑干诱发电位和改善大鼠损伤后听力的作用。4.泻火化瘀通窍法可有效改善血管阻断法引起的大鼠耳蜗缺血再灌注损伤,降低mda含量,提高cat活力,且优于行气活血化瘀法。5.泻火化瘀通窍法能够明显抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织caspase3、caspase8的表达,优于行气活血化瘀法。6.泻火化瘀通窍法可能通过抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织caspase3、caspase8的表达抑制毛细胞凋亡。7.fas和fasl基因和蛋白均参与大鼠耳蜗微循环障碍损伤,泻火化瘀通窍法能够明显抑制大鼠耳蜗缺血再灌注损伤耳蜗组织fas和fasl的表达,且优于行气活血化瘀法。8大鼠耳蜗微循环障碍后耳蜗凋亡现象与XIAP及XAF1的表达相关,泻火化瘀通窍法可能通过提高XIAP的表达抑制XAF1的表达来抑制细胞凋亡的发生。9泻火化瘀通窍法抑制细胞凋亡能力高于活血化瘀法。
刘轲[7]2004年在《脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管基底膜损伤的保护作用》文中提出缺血性脑卒中作为临床危、急、重病之一,发病既有其慢性复杂的病理基础,又有其凶险多变的急性演变过程,且其发病率和死亡率均随年龄增加而增高。在我国,随着老年人口的增多及老龄化社会的到来,深入研究老年缺血性脑卒中的发病机制,寻求有效的治疗方案显得十分迫切。 脑缺血再灌注损伤是引起多种脑血管病的重要病理生理机制,抗脑缺血再灌注损伤是治疗脑梗死的有效措施。在脑缺血再灌注损伤机制中,细胞内蛋白酶起着重要作用,能够水解细胞外基质的两个主要酶系统为基质金属蛋白酶系统和纤溶酶原激活系统。目前,从细胞外基质成分改变及其相关降解酶类,动态研究脑缺血再灌注微血管损伤病理生理的机制甚为少见,尤以老年动物为研究对象国内尚未见报道;在开展对老年缺血性脑血管疾病的实验研究中多使用青年动物,忽视了人类脑血管疾病中增龄因素的重要性,致使实验研究结果与临床有较大差距;以解毒降浊、益气活血方药治疗老年脑缺血再灌注损伤的实验研究资料报道较少,特别以解毒降浊、益气活血方药对脑缺血再灌注血管基底膜成分改变及其相关降解酶类系统表达变化影响的研究国内尚未见报道。本课题以老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管细胞外基质的损伤与气虚血瘀,浊毒损络为研究的切入点,从脑微血管结构、基底膜IV型胶原和层连蛋白等变化揭示老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤的特点;从脑微血管基底膜MMPs、TIMP与PA、PAI 的变化揭示老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管基底膜损伤机制。从脑微血管结构、基底膜IV型胶原和层连蛋白等变化证实脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤具有保护作用;从脑微血管基底膜MMPs、TIMP与PA、PAI的变化揭示脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管损伤的保护机制。1 老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤变化及脑脉通的保护作用 采用大脑中动脉阻塞(MCAO)线栓法复制大鼠局灶性脑缺血3h、再灌注6h、12h、24h、3d、6d 动物模型。将青年和老龄大鼠分为青年假手术组、青年模型组(根据缺血及再灌注时间不同分为缺血3h、再灌注6h、12h、24h、3d、6d组)、老龄假手术组、老龄模型组(分组时间点同青年模型组)、脑脉通中剂量组(分组时间点同上,0.90g·kg-1·d-1)、尼莫地平组(分组时间点同上,6.00mg·kg-1·d-1)、脑脉通大剂量组(观察再灌注 24h、3d 两个时间点,1.80g·kg-1·d-1)、脑脉通小剂量组(分组时间点同脑脉通大剂量组,0.45g·kg-1·d-1)。应用整体观察包括神经功能评分、脑组织含水量、梗死面积等及一般形态学方法包括HE染色、透射电镜等技术对比研究老龄与青年大鼠脑缺血/再灌注后不同时间点整体和形态学变化特征的异同及脑脉通对其影响。 结果:①神经症状积分变化 青年大鼠模型组间比较:I/R 12h～I/R 6d组高于I 3h、I/R 6h 组;I/R 24h 组高于I/R 12h 组。老龄大鼠模型组间比较:I/R 12h～I/R 6d 组高于I3h;I/R 24h、I/R 3d 组高于I/R 6h 组;I/R 24h 组高于I/R 12h、I/R 6d 组;I/R 3d 组高于I/R 6d组。与青年大鼠模型组相同时间点比较:老龄大鼠模型组I/R 24h、I/R 3d增高。与老龄大鼠模型组相同时间点比较:脑脉通大、中剂量组I/R 24 h 和脑脉通中剂量 I/R 3d组下降。②脑组织含水量变化 青年大鼠组间比较:I/R 12h～I/R 6d组高于青年假手术组;
胡玉海[8]2012年在《不同经穴针刺对脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠PKC表达影响的研究》文中研究表明目的：观察针刺不同经穴对脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠PKC表达的影响，探讨针刺不同经穴治疗该病的作用机理，为针刺治疗痉挛性瘫痪、缓解肌张力增高提供实验依据。方法：将动物随机分为8组，每组20只，分别为：空白组、模型组、假手术组、阳经针刺组、阴经针刺组、阴阳经针刺组、GABAB激动剂组（巴氯芬组）和mG1uR1拮抗剂组（MCPG组）采用改良线栓法制备大鼠MCAO模型，再灌注3小时后运用ZeaLonga4分制评分标准进行神经行为学评分；造模成功后第3天开始治疗，连续治疗14天，每日一次；采用神经电生理H反射评价模型和治疗效果；采用RT-PCR法检测大鼠脑干中PKC表达.结果：1、患侧H波潜伏期，阳经针刺组较模型组明显延长，和模型组、阴经针刺组、阴阳经针刺组、巴氯芬组、MCPG组比较有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；患侧H反射恢复曲线显示，阳经针刺组H/M值最高为1.078±0.1283，和模型组、阴经针刺组、阴阳经针刺组、巴氯芬组、MCPG组比较均有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；2、阳经针刺组明显降低大鼠脑干中PKCmRNA表达（P<0.05）；阴经针刺组和阴阳经针刺组比较，有统计学意义（P<0.05）。结论：1、针刺明显抑制H反射的亢进和改善H反射恢复曲线，抑制脊髓运动神经元兴奋性；2、针刺治疗降低脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠脑干中PKCmRNA的表达，组间比较差异具有统计学意义；3、针刺治疗缓解中风后偏瘫痉挛状态，其作用为阳经最强，阴阳经次之，阴经最弱。
阿木拉[9]2012年在《不同经穴针刺对脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠PKA表达影响的研究》文中研究指明目的：通过观察针刺不同经穴对脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠PKA表达的影响，探讨针刺治疗脑卒中偏瘫痉挛状态的生物学机制，揭示针刺不同经穴治疗该病的作用机理，为针刺治疗脑卒中后偏瘫痉挛状态提供理论依据。方法：采用改良线栓法制备大鼠MCAO模型，再灌注3小时后运用ZeaLonga4分制评分标准进行神经行为学评分；造模成功后第3天开始治疗，连续治疗14天，每日一次；采用神经电生理H反射评价模型和治疗效果；运用逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）法检测大鼠脑干组织中PKA的表达。结果：1、右侧H波潜伏期，阳经针刺组较模型组明显延长，和模型组、阴经针刺组、阴阳经针刺组、巴氯芬组、MCPG组比较有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；右侧H反射恢复曲线显示，阳经针刺组H/M值最高为1.078±0.1283，和模型组、阴经针刺组、阴阳经针刺组、巴氯芬组、MCPG组比较均有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；2、阳经针刺组显着提高大鼠脑干和脊髓中PKA的表达，和模型组、阴经针刺组、阴阳经针刺组、巴氯芬组、MCPG组比较均有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。结论：1、针刺可明显抑制H反射的亢进和改善H反射恢复曲线，抑制脊髓运动神经元兴奋性，缓解大鼠偏瘫痉挛状态；2、针刺治疗提高脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠脑干组织中PKA的表达，叁组针刺组相比较，阳经针刺组疗效显着，其次为阴阳经组，再次为阴经针刺组；3、揭示针刺脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠的生物学机制，表明针刺对脑卒中偏瘫痉挛状态具有缓解作用，为临床针刺治疗该病提供实验依据。
张信[10]2002年在《大鼠脑干缺血模型制备—脑干缺血早期病理变化及对血流影响的观察》文中指出目的：脑干缺血模型的建立对于脑干缺血性损伤的病理、病理生理及药理学的研究具有重要意义，但国内外学者对此模型的研究较少，各人所用方法和所选动物也不尽相同，且国内对此模型的研究均集中在犬等大型动物，而大鼠与之相比具有很多优点，因此我们尝试制作鼠脑干缺血模型，对脑干缺血后的早期病理变化进行了观察，并对脑干血流的影响进行了探讨。 方法：雄性Wistar大鼠，分为手术组和假手术组，手术组暴露基底动脉后于上下两点凝闭基底动脉，而假手术组只切开硬膜而不电凝基底动脉。观察动物基底动脉闭塞后的神经症状。应用亚甲兰和TTC(2，3，5-氯化叁苯基四氮唑)染色确定缺血范围及程度。应用激光多普勒技术测量基底动脉闭塞前及闭塞后30、60、120分钟血流值。分别在基底动脉闭塞后2、6、12、24小时杀死动物，取脑干组织分别进行光镜和电镜观察。 结果：两点电凝基底动脉后大鼠出现不同程度呼吸不规则、抽搐、呃逆、瞳孔扩大、对光反射迟钝、肢体瘫痪、眼球震颤、甚至出现昏睡等神经症状。亚甲兰及TTC染色显示缺血区主要位于桥脑及延髓上部小部分区域。基底动脉闭塞后脑干局部血流较闭塞前显着降低。光镜结果：梗塞2小时部分神经元核染色加深、胞体缩小，尼氏体减少；6小时可见部分神经元核固缩，胞体皱缩、溶解，并出现变性坏死灶、髓鞘脱失和血管出血现象；12小时髓鞘脱失更加严重；至24小时，神经元变性坏死明显增多，部分区域有髓鞘断裂缺失。电镜结果：梗塞2小时神经细胞核和胞浆轻微水肿，核染色质松散，星形胶质细胞核可见凋亡倾向；6小时胞浆明显水肿，完全退变崩解，血管外可见较多红细胞渗出；12小时神经细胞线粒体肿胀非常明显，空泡较多，星形胶质细胞可见凋亡细胞核，大部分突触失去正常结构；24小时神经细胞、星形胶质 细胞仅可见残留的凋亡细胞核，胞浆内的细胞器几乎完全丢失。 结论：①两点电凝基底动脉后大鼠出现呼吸不规则、抽搐、呢逆、瘫痪、 瞳孔变化、眼球震颤、意识障碍等神经功能障碍与临床脑干梗塞患者所出现的 症状有相似之处，可用来模拟某些临床病理过程。②病理学观察发现脑干缺血 2小时即可出现超早期病理变化，并随时间的延长缺血性损害逐渐加重。③脑 干局部血流值在基底动脉闭塞后比闭塞前明显降低，说明基底动脉闭塞效果可 靠，并可了解血液动力学变化④本模型优点：大鼠脑血管解剖接近人类，手 术操作相对简单，缺血部位恒定，动物不易死亡，重复性好，费用低，适合于 急性脑干缺血的病理、病理生理学研究。
参考文献：
[1]. 大鼠脑干缺血再灌注模型制备—脑干缺血再灌注损伤病理和脑干血流变化[D]. 朱子龙. 天津医科大学. 2004
[2]. 缺血预处理对大鼠脑干缺血再灌注损伤影响的实验研究[D]. 孙星亮. 泸州医学院. 2012
[3]. 依达拉奉预处理对大鼠脑干缺血再灌注损伤的保护机制研究[D]. 李娇红. 泸州医学院. 2012
[4]. 大鼠脑干缺血再灌注时间窗的实验研究[D]. 周莉. 泸州医学院. 2012
[5]. Homer和Shank基因表达改变在脑损伤和脑胶质瘤病理过程中的意义[D]. 张磊. 第四军医大学. 2009
[6]. 泻火化瘀通窍法影响大鼠耳蜗缺血再灌注损伤Caspase-8/3及Fas系统的实验研究[D]. 王爱平. 辽宁中医药大学. 2016
[7]. 脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注微血管基底膜损伤的保护作用[D]. 刘轲. 北京中医药大学. 2004
[8]. 不同经穴针刺对脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠PKC表达影响的研究[D]. 胡玉海. 黑龙江省中医研究院. 2012
[9]. 不同经穴针刺对脑卒中偏瘫痉挛状态大鼠PKA表达影响的研究[D]. 阿木拉. 黑龙江省中医研究院. 2012
[10]. 大鼠脑干缺血模型制备—脑干缺血早期病理变化及对血流影响的观察[D]. 张信. 天津医科大学. 2002
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