一、核移植前激活牛受体卵子对供体核形态变化的影响（论文文献综述）
唐爽[1]（2010）在《核质相互作用对供体核重编程的影响》文中研究表明在农业生产和生物医学研究中,体细胞核移植都有着极其重要的应用,但是,克隆效率低下一直阻碍着体细胞核移植的进一步应用和发展。核移植的技术步骤较为复杂,很多相关的研究也一直围绕核移植操作流程中的受体卵母细胞的去核方法、融合过程、激活过程以及早期胚胎体外培养体系等方面进行了探讨。然而,由于克隆胚胎发育率的多变性和胎儿发育效率的低下性,除了从核移植的操作流程方面去探讨和改良外,同时还应该从生产重构胚胎的生物材料——即供体细胞和受体卵母细胞的来源、质量及表观遗传状态等——对于重编程的影响及二者之间的相互作用进行探讨和研究。本研究首先优化了牛卵母细胞体外成熟培养体系。本实验对比了四种不同的激素配比对牛卵母细胞体外成熟的作用,结果显示添加人尿促性腺激素（HMG）的成熟实验结果稳定,17β-雌二醇（E2）对牛卵母细胞成熟有一定的促进作用,HMG+E2联合使用可以得到高效稳定的成熟结果;在此基础上,比较了表皮生长因子（EGF）对牛卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育的影响,结果表明在成熟液中添加30 ng/ml EGF对牛卵母细胞的成熟质量、胚胎发育及降低胚胎细胞凋亡都有明显的促进作用。本研究最终确定的牛卵母细胞体外成熟培养液为:TCM-199中添加0.075 IU/ml HMG,1μg/ml E2,30 ng/ml EGF,10%（v/v）FBS。接下来本研究对比了血清饥饿法与接触抑制法在调整供体细胞周期中对核移植效果产生的作用。结果发现,虽然两种方法在重构胚的融合率、卵裂率和囊胚发育率上并无太大的差异,二者均可以得到较好的结果;但是血清饥饿处理会引起胚胎凋亡率增加,导致核移植胚胎质量下降。细胞的传代会对核移植结果产生影响,以第2-5代细胞的效果最好,但当传代次数过多后则会造成重构胚发育能力的下降;也会引起核移植囊胚凋亡率上升。根据以上结果,本研究在后续实验中均使用接触抑制法处理的第2-5代细胞为供体细胞。随后,本研究分别应用未成熟卵母细胞抽提物、成熟卵母细胞抽提物和孤雌激活的卵母细胞抽提物预处理供体细胞,通过对比处理细胞的全能性基因表达和脱乙酰化程度检测三种胞质抽提物对供体细胞的重编程效果。随后进行核移植实验,以正常核移植胚胎为对照比较了来自于三组不同抽提物预处理供体细胞的重构胚的体外发育情况和囊胚质量,从而分析牛卵胞质抽提物对供体细胞的重编程作用对体细胞核移植的影响。结果如下,三组胞质抽提物都能有效的重编程供体细胞;在三组抽提物中,成熟卵胞质抽提物使得供体核的表观遗传状态与受体胞质更为接近,因此对克隆胚胎发育率和囊胚质量有显着的促进作用。这些结果表明,用牛卵胞质抽提物预处理供体细胞能提高重构胚体外发育能力,相对于将供体核重编程到一个更低的分化状态,将供体核重编程到一个与受体胞质相一致的状态更有利于克隆胚胎的发育。本研究设计使用小鼠和牛两种在基因表达调控和发育程序上有着巨大差异的物种研究早期胚胎中供体核与胞质在指导发育上的作用,构建了小鼠-牛异种克隆胚胎,检测了异种胚胎的体外发育时间、胚胎形态、合子激活基因的表达情况,结果表明异种克隆胚胎在合子基因激活（ZGA）前的发育是由牛的卵胞质控制的,在发育时序和胚胎形态上都表现出牛胚胎的特性,同时小鼠的合子基因激活也受到牛卵胞质的作用而在8-细胞期才得以表达,并且激活是不完全的。小鼠的合子基因激活受到牛卵胞质的影响而延迟和不完全激活是造成小鼠-牛异种克隆胚阻滞在8-细胞期的一个原因。最后,本研究设计使用38.5℃正常培养的孤雌激活胚胎与41℃培养7 h的热激孤雌激活胚胎进行核质置换,分别构建热激核-正常胞质重构胚以及热激胞质-正常核重构胚,检测了核质置换胚胎的体外发育率、合子激活基因的表达和胚胎凋亡情况,以研究早期胚胎核与胞质对热激的应激反应,以及产生应激后二者之间的相互作用。结果如下,当正常核移入热激的卵胞质,重构胚的发育率显着下降;热激后的核质置换胚胎中存在合子基因激活不完全的现象,这种情况主要存在于热激胞质-正常核重构胚中;热激能诱导胚胎发生细胞凋亡,早期胚胎的胞质对热激更敏感并在后期的诱导凋亡中起到主导作用。这些结果表明,虽然热激对核和胞质都有损伤,但胞质对热激损伤更为敏感。早期胚胎受到热激后导致发育能力降低的易感性主要是由于胞质所引起的;早期胚胎受到热激可能会损伤到卵胞质中的母源因子,即使与正常核构成重构胚也依然会导致合子基因表达异常;并且胞质受到热激损伤会在热激诱导的凋亡机制中起到比核更大的作用。
隋进强[2]（2009）在《牛卵母细胞成熟前基因注射的研究》文中研究表明为研究特定基因或蛋白质在牛卵母细胞体外成熟过程中的作用,探索牛卵母细胞体外成熟的分子机理,需要建立一个能够检测基因或蛋白质在牛卵成熟过程中作用的技术平台。本课题从屠宰场采集牛卵巢,选择颗粒细胞层数3层以上、胞质均一的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes, COCs）,采用本实验室牛卵母细胞体外成熟培养方案,成熟培养牛卵母细胞。在体外成熟不同的时间（0和10h）剥离卵丘-卵母细胞外周的颗粒细胞,然后将卵母细胞置于成熟培养液中继续培养,跟正常体外成熟培养的（未剥离颗粒细胞）卵母细胞进行发育潜能上的比较。同时构建不同质粒,分别注射到10h剥离颗粒细胞的牛卵母细胞中,观察质粒及mRNA的表达情况。实验主要结果如下:1.体外成熟培养0h脱颗粒细胞的卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞在成熟率（19.51% vs.80.14%,P < 0.05）、卵裂率（27.08% vs.82.61%,P < 0.05）和孤雌激活胚胎囊胚率（7.69% vs.21.71%,P < 0.05）上差异显着;体外成熟培养10h后脱颗粒细胞的牛卵母细胞,与正常体外成熟培养的卵母细胞相比,在成熟率（82.71% vs.80.14%, P > 0.05）、卵裂率（83.01% vs.82.61%,P > 0.05）和孤雌激活胚胎囊胚率（19.30% vs.21.71%, P > 0.05）上无显着差异。结果证明在成熟培养10h,剥离颗粒细胞不会影响体外培养牛卵母细胞的发育潜能。2.构建注射质粒,酶切鉴定后向成熟培养10h脱颗粒细胞的卵母细胞内注射pVenus-H1foo mRNA、pVenus质粒、pDsRed1-N1质粒和pDsRed1-H1c质粒,pVenus-H1foo mRNA第二天荧光显微镜下观察到绿色荧光表达,pVenus质粒、pDsRed1-N1质粒和pDsRed1-H1c质粒在注射卵母细胞孤雌激活后胚胎的不同发育阶段同样得到表达。非功能标记基因显微注射组与未注射组在卵母细胞成熟率（81.42% vs.82.03%, P > 0.05）、卵裂率（75.24% vs.78.15%, P > 0.05）和孤雌激活胚胎囊胚率（17.42% vs.18.82%, P > 0.05）上差异不显着。研究结果提示:向成熟培养10h后剥颗粒细胞的无卵丘卵母细胞注射mRNA、非功能性基因都能够得到表达,同时这种显微注射技术方法对卵母细胞的后期发育影响不大,这一技术平台可以用于核移植胚胎重编程分子机制的研究。
黄雅琼[3]（2008）在《猪体细胞核移植相关技术研究》文中研究说明1.探讨了猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程和卵母细胞的发育潜力。（1）不同直径卵泡内的卵母细胞的成熟进程及各时相出现的时间存在差异。直径＞2mm的卵泡内的卵母细胞体外培养16 h,大部分发生GVBD（germinal vesicle breakdown）;卵母细胞GV期的比率由0h的68.00%下降到16h的15.38%;成熟培养20h时,终变期（diakinesis,DK）的比率达到峰值（27.06%）,而MⅠ的峰值（69.69%）出现在培养后28h;成熟培养32～44h时,Ana-Ⅰ/Tel-Ⅰ期的比率达到最高（53.33%）;成熟培养48h时,MⅡ期的比率达到最大值（63.64%）。（2）不同直径卵泡的卵母细胞体外成熟后的孤雌发育能力不同。直径＜2mm、直径2～6mm、直径＞6mm的卵泡的卵母细胞的成熟率分别为5.12%,66.63%和46.72%;分裂率分别为1.42%,72.19%和58.54%;囊胚率分别为0、28.76%和23.13%。直径＜2mm和＞6mm卵泡内的卵母细胞的卵裂率明显低于直径2～6mm卵泡的卵母细胞的卵裂率（P＜0.05）。直径2～6mm卵泡内的卵母细胞体外成熟较快,体外发育潜能较高。2.探讨了激素和生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果发现,在成熟液中添加0.1μg/mL FSH的卵母细胞成熟率显着高于添加0.01IU/mL人绝经期促性腺激素（hMG）的卵母细胞成熟率（P＜0.05）,但两组间的分裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。猪卵母细胞分别在添加有0、10、30、50、70或90ng/mL表皮生长因子（EGF）的成熟液中成熟培养后进行孤雌激活,50ng/mL EGF组的成熟率达到66.89%,孤雌激活的分裂率达到84.90%,囊胚率达到30.20%,成熟率显着高于其余各组,分裂率和囊胚率高于对照组。在成熟液中添加10ng/mL胰岛素样生长因子（IGF-I）显着提高猪卵母细胞的第一极体排出率。在成熟液中同时添加50ng/mL EGF和10ng/mL IGF-I显着提高猪卵母细胞的孤雌发育能力（P＜0.05）。分别使用以TCM-199、NCSU-23（North Carolina State University-23,北卡大学胚胎培养液）和PZM-3为基础液的成熟液进行成熟培养猪卵母细胞,各组间在分裂率,成熟率和囊胚率方面差异不显着（P＞0.05）,表明均可用于猪卵母细胞的体外成熟和体外培养。3.系统探讨了孤雌激活方法对猪卵母细胞孤雌发育效果的影响。结果发现:（1）浓度为9%的乙醇（EH）激活处理10min效果好于15min;（2）用9%EH激活处理10min后,再用2μmol/L 6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）培养处理3～4h的卵母细胞分裂率及囊胚率分别为82.86%和22.86%,显着高于再用10μg/mL放线菌酮（CHX）+10mmol/L SrCL2(Sr2+)、10 mmol/L Sr2++2μmol/L 6-DMAP、10μ/mL CHX+2μmol/L6-DMAP或10μg/mL CHX+2μmol/L 6-DMAP+10 mmol/L Sr2+培养处理3～4h的卵母细胞。（3）比较几种激活方法（5μmol/L Ion激活处理5min,9%乙醇激活处理10min,50 v/mm和50μs的电脉冲2次）的猪卵母细胞孤雌激活效果发现,离子霉素（Ion）的猪卵母细胞孤雌激活效果最好,囊胚率达到37.50%。（4）卵母细胞周围的卵丘细胞层数对其成熟后的孤雌发育有显着影响,4～6层和6层以上卵丘-卵母细胞复合体成熟后的孤雌激活分裂率（68.99%和75.36%）和囊胚率（32.56%和37.68%）显着高于其它组（p＜0.05）。4.对猪卵丘细胞、胎儿成纤维细胞和睾丸间质细胞的分离和传代培养进行了系统研究。结果发现,猪卵丘细胞单层的生长需要5～6d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。酶消化法和钢网过滤筛选法可获得猪睾丸间质细胞,猪睾丸间质细胞单层生长需要3～5d。猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后,复苏率为68.36%。通过培养和观察,猪胎儿成纤维细胞的生长形成有规则的生长曲线。5.对猪体细胞核移植的方法及影响因素进行了探索。（1）猪卵母细胞体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h后,分别进行去核构建重构胚,结果发现,成熟44h和48h的卵母细胞核移植后的融合率（58.99%和56.51%）、卵裂率（67.52%和65.73%）和囊胚率（22.78%和15.96%）较高,其中卵龄为44h的分裂率与囊胚率显着高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞（P＜0.05）。卵龄为48h的融合率高于卵龄为52h的卵母细胞（P＜0.05）。（2）盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view系统去核法的去核率分别为76.33%,100.00%,98.40%,前者低于后两者（P＜0.05）;三种去核方法去核的卵母细胞核移植后,分裂率以Hoechest染色法较低（P＜0.05）,但融合率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同注核方法（细胞质内注射法和透明带下注射法）的核移植效果研究结果显示,细胞质内注射和透明带下注射法的分裂率为（68.13%和60.37%）与囊胚率（6.44%和8.08%）差异均不显着（P＞0.05）。6.探讨了供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响。（1）比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现,胎儿成纤维细胞的融合率（64.74%）高于颗粒细胞（51.05%）和卵丘细胞（56.89%）,但三种细胞的卵裂率及囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（2）不同代数的胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现,6～9代的融合率显着高于3～5代和＞10代的成纤维细胞（P＞0.05）,但卵裂率和囊胚率差异不显着（P＞0.05）。（3）不同性别猪胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现:雄性胎儿成纤维细胞核移植的融合率和分裂率与雌性胎儿成纤维细胞相比差异不显着（P＞0.05）,但囊胚率显着低于雌性胎儿成纤维细胞（P＜0.05）。（4）100%长满汇合的胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70～80%汇合的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞（P＜0.05）,但囊胚率差异不显着。（5）猪胎儿成纤维细胞冷冻解冻后的核移植分裂率和囊胚率均显着低于新鲜和4℃冷藏的细胞（P＜0.05）,虽然融合率无显着差异（P＞0.05）,表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植。（6）表面光滑的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率均显着高于表面粗糙的猪卵丘细胞做供体细胞的核移植后的分裂率和囊胚率（P＜0.05）,虽然融合率差异不显着（P＞0.05）。（7）直径＜15μm的供体细胞核移植后的融合率显着低于直径＞30μm的供体细胞（P＜0.05）,直径20～3μm供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率（63.73%和21.54%）较高。（8）组织块法和酶消化法分离得到的供体细胞所构建的重构胚在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显着差异（P＞0.05）。
彭新荣[4]（2008）在《提高牛体细胞核移植效率的研究》文中指出为提高牛体细胞核移植和生产转基因动物的效率,本研究主要从囊胚发育率,囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡指数三个方面研究了供体细胞转染端粒酶和癌化对体细胞核移植的影响,卵母细胞胞质成熟与重构胚胎发育的关系,激活方法与重构胚发育的关系,以及核移植胚胎体外培养与胚胎发育和冷冻的关系。试验研究结果如下。1、本研究首先用含人端粒酶催化亚基（hTERT）基因和报告基因EGFP的表达载体转染了牛耳成纤维细胞系,通过RT-PCR,端粒酶活性分析和Western杂交证明hTERT可以整合在牛耳成纤维细胞基因组中并表达端粒酶蛋白,人的端粒酶基因与牛的端粒酶相关基因可以互相协作,表达端粒酶蛋白。hTERT在牛耳成纤维细胞中的表达延长了细胞寿命,建立了一株染色体条带正常,贴壁生长的牛耳成纤维细胞系,命名为HBC3。2、HBC3的生长曲线仍保持正常细胞的生物学特性,EGF和胰岛素对HBC3仍有明显的促生长作用,添加EGF和胰岛素后细胞的倍增指数分别为5.1和4.7,其中EGF的促生长作用比胰岛素促生长的作用显着（P <0.05）。HBC3细胞系仍需依赖血清维持生长。但是,端粒酶的表达明显降低了血清引起的细胞凋亡,流式细胞仪进行细胞凋亡分析,结果表明,第64代的HBC3细胞凋亡率明显低于第12代的牛耳成纤维细胞（BFC）细胞,差异极显着（P <0.01）。3、HBC3做供体细胞的核移植重构胚可以发育到囊胚,重构胚的囊胚发育率与对照组差异不显着。但是,HBC3的重构胚囊胚细胞数显着少于用BFC构建的核移植胚胎,HBC3的囊胚细胞凋亡数和凋亡指数也明显少于BFC的重构胚,且差异显着（P <0.05）。4、致癌物DMBA与促癌物TPA联合作用BFC,得到两株寿命延长的细胞系,分别命名为ABF11和ABF12。ABF11的形态为长梭形,ABF12的形态为三角形,两株细胞系均有端粒酶活性,对ABF12进行了生物学特性分析,细胞在接种后,有较长的生长潜伏期,后进入对数生长期,但没有正常细胞的生长平台期,ABF12和BFC细胞系在分别在含血清的培养液生长9天的倍增指数分别为5.3和4.3,差异显着（P <0.05）,试验结果表明ABF12细胞系已经失去了细胞接触生长抑制性。传代后ABF12和BFC细胞系在无血清的培养液里生长9天的倍增指数分别为5.0和-1.2,结果表明ABF12已经失去了对血清的生长依赖性。用软琼脂培养ABF12细胞系14d, ABF12在软琼脂内生长了172个单细胞克隆,结果表明ABF12细胞已经失去了贴壁依赖性。5、ABFE12细胞用于体细胞核移植后,能支持胚胎发育至囊胚阶段,但囊胚发育率低于对照组,差异显着（P <0.05）。通过染色分析,ABF12重构胚的囊胚细胞数与对照组差异不显着,但囊胚细胞的凋亡指数明显高于对照组,二者分别为0.124和0.081,差异显着（P <0.05）。6、牛卵母细胞成熟培养液中添加EGF显着提高了牛卵母细胞成熟率,用EGF培养的卵母细胞在做为受体胞质进行体细胞核移植后,体细胞重构胚的囊胚率和囊胚细胞数均显着高于不添加EGF的对照组（P <0.05）。凋亡染色分析表明,EGF培养的卵母细胞做受体后,重构胚胎的凋亡指数为0.062,比对照组显着降低（P <0.05）。培养液中添加EGF的卵母细胞在冷冻保存和体外受精后,卵母细胞的形态正常率、受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显着高于对照组。牛卵母细胞成熟培养液中添加VE后,牛卵母细胞成熟率和重构胚的囊胚率与对照组相比均差异不显着。凋亡染色分析表明,用VE培养的卵母细胞做受体胞质,重构胚胎的囊胚细胞凋亡指数为0.064,与对照组相比,显着降低了（P <0.05）囊胚细胞的凋亡指数。而用VE培养的卵母细胞冷冻保存后,卵母细胞的形态正常率,体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率均与对照组差异不显着。牛卵母细胞成熟培养液中添加OCS后,牛卵母细胞成熟率显着高于添加FBS培养组（P <0.05）,用OCS成熟培养的卵母细胞做胞质受体,进行体细胞核移植后,重构胚的囊胚率显着高于添加FBS的卵母细胞组（P <0.05）。囊胚细胞染色分析表明,OCS组的囊胚细胞数显着高于FBS卵母细胞组（P <0.05）,凋亡染色分析表明,OCS组的囊胚细胞凋亡指数为0.072,显着低于对照FBS组。而且,培养液中添加OCS的卵母细胞在冷冻保存和体外受精后,受精胚胎的卵裂率和囊胚率均显着高于对照FBS组（P <0.05）。7、比较了不同浓度精子提取物胞质内注射对牛核移植重构胚胎的卵裂率和囊胚率的影响,结果发现单独注射精子提取物可以很好的支持体细胞胞重构胚发育到囊胚阶段,其中注射5mg/ml精子提取物组的重构胚卵裂率和囊胚率均显着高于其他两个注射剂量组（P <0.05）。5mg/ml精子提取物组的囊胚细胞数显着高于其他试验组（P <0.05）,而5mg/ml精子提取物组的凋亡指数为0.071,显着低于其他组（P <0.05）。其次,比较了精子提取物联合其他激活方法使用与单独使用精子提取物激活对核移植胚胎的影响。结果表明,单独注射精子提取物或联合其他方法一起使用对体细胞核移植胚胎的的卵裂率,囊胚率,囊胚细胞数和囊胚细胞凋亡指数没有显着的影响。8、比较了传统的电激活和化学激活方法对核移植胚胎的影响,以及联合使用两种激活方法（电化学法）对核移植胚胎的卵裂率和囊胚率的影响,结果表明,电化学法激活核移植胚的卵裂率和囊胚率均显着高于单独使用电激活或化学激活方法。其次,比较了精子提取物与电化学方法对核移植胚胎的影响。这两种激活方法的卵裂率和囊胚率差异不明显,但是精子提取物激活的重构胚的囊胚细胞数明显要高于电化学法（P <0.05）,精子提取物法的囊胚凋亡指数也明显（P <0.05）低于后者。9、在牛体细胞核移植胚胎培养液中添加20ng/ml EGF,重构胚的囊胚发育率为34%,显着高于不添加EGF的对照组（P﹤0.05）。添加EGF的胚胎的囊胚细胞凋亡指数为0.062,显着低于对照组的细胞凋亡指数。对EGF组和对照组的胚胎进行冷冻保存并解冻培养,EGF组胚胎在解冻24h后的存活率显着高于对照组（P﹤0.05）,在解冻48h后的存活率也显着高于对照组（P﹤0.05）。在牛体细胞核移植胚胎培养液中分别添加0.1μg/ml和1μg/ml孕酮后均显着提高了重构胚的囊胚发育率均显着高于对照组21%的囊胚率。添加0.1μg/ml和1μg/ml孕酮组的细胞凋亡指数分别为0.090和0.085,两组之间的胚胎细胞凋亡数和凋亡指数均差异不显着,与对照组相比差异也不显着。不同孕酮组胚胎在解冻24h后的存活率与对照组差异不显着。在解冻48h后的存活率与对照组差异不显着。在牛体细胞核移植胚胎培养液中添加100μg/ml抗氧化剂VE并没有对核移植胚胎的卵裂率产生不利影响。添加VE显着提高了重构胚胎的发育率,降低了囊胚的凋亡指数,对照组的细胞凋亡指数为0.090,VE组为0.037,差异极显着（P﹤0.01）。10、首先,分别在核移植胚胎的冷冻保存液中添加海藻糖和蔗糖,用海藻糖冷冻的胚胎解冻后24h和48h的存活率显着（P﹤0.05）高于添加蔗糖的试验组。其次,分别对不同发育时期的核移植重构胚胎进行冷冻保存。解冻后桑胚的24h和48h的胚胎存活率显着（P﹤0.05）低于早期囊胚组和晚期囊胚组。
丁向彬[5]（2008）在《牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究》文中研究指明体细胞核移植的成功说明了高度分化的细胞仍具有支持发育的全能性,卵母细胞胞质中存在着将分化体细胞重编程至多能胚胎细胞状态的全部因子。但是,体细胞核移植的成功率却非常低,而且克隆动物存在不同程度的发育缺陷。目前普遍认为,体细胞核移植的低成功率以及发育异常和供体细胞核的不完全表观遗传重编程有关。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显着的调控作用。本文对牛体外受精（IVF）胚胎和体细胞核移植（SCNT）胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行分析,找出体细胞克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异,研究表观遗传状态对克隆胚体外发育能力的影响。1.研究卵母细胞成熟培养液中添加表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对其体外发育的影响,精子的不同处理方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响以及细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30 ng/mL EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率;精子经上浮法处理后可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞共培养可以显着提高受精后的囊胚发育率,可以用于牛IVF胚胎的体外培养。2.探讨了不同激活方法对牛核移植胚胎激活效果和体外发育的影响,以及细胞共培养体系对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,5μmol/L离子霉素联合2mmol/L 6-DMAP激活牛核移植胚胎的效果比较好,可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞饲养层共培养可以显着提高重构胚的囊胚发育率,比较适合作为体细胞核移植胚胎发育的共培养体系。3.采用免疫荧光染色技术,对牛IVF胚胎和SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行检测,研究克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异。结果表明,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显着高于IVF胚胎,从头甲基化时间提前;克隆胚胎4-细胞到囊胚阶段乙酰化水平低于体外受精胚胎,其中8-细胞阶段乙酰化水平显着低于体外受精胚胎。与体外受精胚胎相比,牛核移植胚胎附植前各阶段存在异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式。4.用DNA甲基化酶抑制剂（5-aza-dC）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-aza-dC（20nM,72h）处理供体细胞或者重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的表观遗传状态没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-aza-dC（20nM,72h）处理可以显着提高囊胚发育率和囊胚细胞数,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显着降低且与IVF胚胎相比差异不再显着,但组蛋白乙酰化水平没有明显改变。说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。5.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨组蛋白乙酰化变化与克隆胚胎体外发育的关系。结果表明,供体细胞经50nM TSA处理12h可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,而且2-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平升高;TSA处理重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对重构胚的表观遗传状态没有显着影响;供体细胞和重构胚均用低浓度TSA（50nM,12h）处理可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,8-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平显着增加且与IVF胚胎相比差异不再显着,但TSA处理对DNA甲基化水平没有明显影响。说明克隆胚胎组蛋白乙酰化水平影响其体外发育,增加2-细胞和8-细胞阶段组蛋白乙酰化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。6.联合应用5-aza-dC和TSA处理牛供体细胞和重构胚,研究两种试剂联合处理对重构胚发育的影响,以及对重构胚甲基化水平和乙酰化水平的影响。结果表明,5-aza-dC（20nM, 72h）联合TSA（50nM, 12h）处理供体细胞和重构胚可以更明显的提高克隆胚胎的体外发育能力,联合处理不但显着降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且显着增加了组蛋白的乙酰化水平,从而使克隆胚附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近与体外受精胚胎。说明异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式不利于克隆胚的体外发育,消除这种异常可以提高克隆胚的体外发育能力。进一步的实验表明,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。
易康乐[6]（2008）在《Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响》文中研究指明本研究系统评述了目前哺乳动物卵泡和卵母细胞发生分子调控机制的研究进展,探讨了生殖系a因子（Figla）和脑源性神经生长因子（BDNF）在猪和牛卵母细胞和胚胎的表达情况,进一步优化了猪和牛早期胚胎的体外培养体系。研究中首次克隆获得牛生殖系a因子全长cDNA序列585bp,编码194个氨基酸的成熟蛋白,其功能保守区与小鼠、人和类人猿等哺乳动物的同源性达到了90%以上;优化了SYBR Green I实时荧光定量PCR技术,使之能对牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因的表达进行较为准确的检测分析,从而使对微量材料进行大量的基因表达分析成为现实;首次证实了Figla和BDNF在猪和牛的卵母细胞和早期胚胎中均有表达,且BDNF在牛体细胞核移植囊胚中的表达量要显着低于体外受精和孤雌激活的囊胚;以现有培养体系为基础,添加BDNF可促进猪和牛体外培养的早期胚胎的发育。而添加神经生长因子（NGF）可促进牛体外培养的早期胚胎的发育。
张玉玲[7]（2008）在《人—山羊异质胚胎构建及胚胎干细胞的分离培养》文中研究说明人胚胎干细胞（hESCs）有分化为机体各种细胞的潜能,是再生医学、药物筛选及发育研究的一个重要来源。hESCs是从人胚胎细胞分离培养而来的,然而,人胚胎来源不足严重限制了hESCs的研究。以动物卵母细胞为受体、人体细胞为供体细胞的异质核移植技术为hESCs的研究提供了新的途径,本文尝试了用山羊卵母细胞为受体、人包皮成纤维细胞（HFFs）为供体构建人-山羊异质核移植（human-goat interspecies nuclear transfer, hgiNT）胚胎,并分离hESCs,旨在优化hgiNT方案,并为建立hESCs系提供技术帮助。研究内容如下:1.为了选择遗传均一的供体细胞用于核移植,本实验分别用条件培养液或用饲养层共培养对HFFs进行克隆分离和扩大培养,对照组在无饲养层的新鲜培养液中培养,Giemsa染色分析克隆细胞核型。结果:共培养组克隆存活率（31.43 %）显着高于对照组（5.56 %）（P<0.05）,与条件培养液组相近（27.27 %,P>0.05）;饲养层共培养组扩大培养率（11.43 %）显着高于对照组（0 %）（P<0.05）。7个细胞克隆中5个表现为正常核型（2n=44+XY）。结果表明,两种方法均能提高HFFs形成克隆的比例,且能保持细胞染色体核型正常,用于核移植前供体细胞的筛选。2.为了探索hgiNT条件,本实验首先对电融合参数进行了摸索,进而测试了融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响,最后对比了mSOFaa和G1/G2序贯培养法对重组胚胎体外发育的影响。结果最佳的融合电压、脉冲时程和脉冲次数分别为36 V、20μs和2次,最佳的融合与激活间隔时间为4 h,G1/G2序贯培养法的卵裂率和囊胚率均显着高于mSOFaa培养法（71.81 % vs. 64.78 %,9.73 % vs. 4.76 %;P<0.05）。结果表明:hgiNT的电融合参数及融合与激活间隔时间与受体卵母细胞供应方（山羊）体细胞核移植相似,而核移植胚胎的培养条件倾向于供体细胞供应方（人）的胚胎培养条件。3.本研究探讨了TSA对供体细胞或重构胚处理对hgiNT胚胎发育的影响。选择经5、25、50、75、100 nM TSA处理24 h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,结果在50、75 nM组,囊胚率有所增高（9.91 %、12.10 % vs. 8.47 %,P>0.05）;用5,25,50,75或100 nM TSA处理重构胚10 h,结果5、25、50、75 nM组的囊胚率均有所提高,其中25 nM组显着高于对照组（16.41 % vs. 7.63 %,P<0.05）。TSA处理供体细胞和重构胚均能显着提高克隆胚囊率,说明低甲基化的供体细胞有利于卵母细胞的重编程,推测TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平,因而提高了克隆胚的发育率。4.本实验（1）用10 mg/L的丝裂霉素-C分别处理HFFs、MEFCs和GEFCs饲养层1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,冷冻-复苏后培养12 h,统计复苏率,选择合适的处理时间;（2）用HFFs、MEFCs和GEFCs作饲养层,接种ICM,比较它们对hESCs的支持情况;（3）在不同密度的HFFs饲养层上,接种相同的ICM数,统计hESCs的贴壁率、克隆形成率、分化率,从中选择合适的饲养层密度。结果显示:（1）以10 mg/L丝裂霉素-C最佳处理时间为2 h;（2）HFFs和MEFCs饲养层均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化状态;（3）HFFs饲养层的最佳密度是3×104/mL。五、为了克服培养体系中异源性成份污染hESCs临床应用的限制,本实验采用无动物源性成份确定的HESCO体系对hgiNT胚胎来源的hESCs（iNT-hESCs）进行体外培养（HESCO组）,以HFFs为饲养层的常规培养体系为对照组（HFF组）,观察iNT-hESCs在两种培养体系中的生长状况,探讨HESCO体系对iNT-hESCs生长的支持情况。结果,HESCO组的iNT-hESCs有与HFF组相似的细胞形态、增殖速度、碱性磷酸酶活性和遗传稳定性;结果表明HESCO培养体系能支持iNT-hESCs的生长并能保持其未分化状态,这对iNT-hESCs用于临床治疗且有重要意义。
黄伟伟[8]（2007）在《牛体细胞核移植的研究》文中研究表明本研究以牛卵母细胞为材料,体外成熟培养牛卵母细胞,同时分离牛耳皮肤成纤维细胞和颗粒细胞为供核细胞,对牛卵母细胞体外成熟培养和核移植的影响因素进行了探讨,优化了牛体细胞核移植技术方案,为进一步进行转基因牛和分离牛ntESCs的研究奠定了基础。实验主要结果如下:1.供核细胞的准备从两头荷斯坦奶牛采取耳组织块,采用组织块法分离得2株成纤维细胞株BEF422和BEF274,并取第13代BFF422进行核型分析,核型正常（2n=60,XX）,证明细胞在传代培养过程中染色体数目未发生异常。可以作为供核细胞使用。利用成熟后的COCs的颗粒细胞,可以简单快速的分离得到颗粒细胞。2.牛卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集牛卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:⑴在基础培养液(TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF中分别添加FBS, NBS, BSA和PVA四种血清或血清替代物,其中添加10mg/ml BSA和10%FBS的成熟率无显着差异,但均显着高于10%NBS和1.0%PVA（P < 0.05）;激活后,添加10mg/ml BSA的分裂率显着高于其他三组（P < 0.05）, 10%FBS与1.0%PVA之间差异不显着,10%NBS分裂率最低。囊胚率1.0%PVA显着高于其他组,10mg/ml BSA和10%FBS之间囊胚率差异不显着,10%NBS囊胚率最低。表明添加10mg/ml BSA和10%FBS对牛卵母细胞成熟率和激活后胚胎发育率差异不大,二者可以相互代替用于牛卵母细胞体外成熟。⑵在无血清体外成熟培养体系中添加50μg/ml的尿嘧啶能提高牛卵母细胞的成熟率和囊胚率,与添加0,100,150μg/ml时的牛卵母细胞成熟率间存在差异显着（P < 0.05）,表明在成熟培养液中添加50μg/ml的尿嘧啶,既能促进牛卵母细胞的体外成熟,又能提高牛孤雌胚囊胚发育率。⑶在无血清体外成熟培养体系中添加不同浓度的ATP均不能提高牛卵母细胞的成熟率,但添加500,750μg/ml的ATP能提高牛卵母细胞激活后的囊胚发育率,与添加0,250μg/ml组相比存在差异显着（P <0.05）, 500,750μg/ml组间差异不显着（P >0.05）,但以添加500μg/ml时的囊胚发育率最高。表明在成熟培养液中添加ATP不能促进牛卵母细胞的体外成熟,但能提高牛孤雌胚囊胚发育率,尤其是添加500μg/mlATP的效果最佳。因此,使用TCM-199+2.5μg/mL丙酮酸钠+10mM/L HEPES+2mM/L谷胺酰胺+50μL/mL ITS+0.1 IU/mL hMG+1μg/mL E2+10 ng/mL EGF+10mg/ml BSA+50μg/ml尿嘧啶的无血清体外成熟培养体系比较有利于牛卵母细胞体外成熟和激活后胚胎发育。3.牛体细胞核移植⑴比较不同融合方案对牛重构胚融合及胚胎发育的影响。方案③（1.9KV/cm,10μs,一次电脉冲）的融合率（70.05%vs 59.48%,59.24%,33.07%, P <0.05）和激活后囊胚率（37.6%vs 20.24%,32.53%,18.92%, P <0.05）显着高于其他三组,表明方案③的融合效果最好,并能够促进重构胚的发育,提高囊胚率。⑵筛选最佳融合电压和脉冲时间。以方案③为基础方案,对融合电压和脉冲时间进行优化。结果显示1.9KV/cm的融合率,分裂率,囊胚率均高于1.8KV/cm和2.0 KV/cm组（P < 0.05）;10μs和15μs组之间的融合率,分裂率及囊胚率均高于20μs组（P < 0.05）,但二者之间差异不显着（P>0.05）,15μs囊胚率稍高于10μs。表明1.9KV/cm和15μs是较为适宜的融合电压和脉冲时间。⑶筛选最佳激活方法。离子酶素+6-DMAP的分裂率（91.6%vs 88.04%,87.5%,89.91%, P <0.05）和囊胚率（37.61%vs 34.93%,26.37%,32.65%, P <0.05）显着高于其他三组,表明离子酶素+6-DMAP能显着提高牛重构胚地发育率,是一种良好的激活方法。⑷筛选最佳激活时间。重构胚经电融合后间隔3h激活的分裂率（90.75% vs 83.51%,86.27%, P <0.05）和囊胚率（32.41% vs 27.28%vs16.05%, P <0.05）显着高于间隔1h和2h,表明延迟3h激活对牛重构胚体外发育有利。⑸筛选最佳重构胚培养体系。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2中分裂率（90.91%vs85.95%vs73.50%,P<0.05）和囊胚发育率（36.67%vs 27.88%vs18.60%,P<0.05）要显着高与SOFaa和CR1aa,而CR1aa培养液也也显着高与SOFaa,表明在三种胚胎培养液中序贯培养液G-1/G-2能更好的支持牛重构胚的发育。⑹共培养效果比较。牛重构胚在序贯培养液G-1/G-2和牛颗粒细胞共培养体系中无论是分裂率,还是囊胚率均显着高于单独使用G-1/G-2序贯培养液（P<0.05）。表明在与牛颗粒细胞共培养条件下,G-1/G-2序贯培养液才能更好的支持牛重构胚的发育。⑺不同供核细胞对牛体细胞核移植的影响。三种牛体细胞（颗粒细胞、成年成纤维细胞BEF422和BEF274）中,颗粒细胞的融合率（70.35%）,分裂率（94.07%）和囊胚率（40.94%）均显着高于成年成纤维细胞BEF422和BEF274 （P<0.05）。不同个体来源的成年成纤维细胞BEF422和BEF274之间融合率和分裂率无显着差异（P>0.05）,但BEF422的囊胚率显着高于BEF274（P<0.05）。表明颗粒细胞重构胚发育率要高于成年成纤维细胞,而不同个体来源的成年成纤维细胞重构胚发育率也有差异。⑻不同代数供核细胞对牛体细胞核移植的影响。BEF422的P20～21的融合率低于P6～7细胞（68.02% vs 73.72%）,但是分裂率（92.86%）和囊胚率（38.46%）显着高于P6～7细胞（P<0.05）。表明高代数的细胞作供核的核移植效率高于低代数的细胞。⑼不同品种受体对牛体细胞重构胚妊娠率的影响。进行了23次胚胎移植试验,214枚重构桑椹胚或早期囊胚移植给43头自然发情7d的受体牛,其中荷斯坦奶牛32头,秦川牛11头。移植75d后直检34头,7头妊娠,妊娠率20.59%。荷斯坦奶牛细胞重构胚移植的荷斯坦奶牛和秦川牛受体中,妊娠率无显着差异（P>0.05）。表明胚胎移植受体的品种差异对牛核移植胚胎的妊娠率影响不大。
赛务加甫[9]（2007）在《提高绵羊体细胞核移植效率的研究》文中研究表明本研究对绵羊卵母细胞体外成熟、卵母细胞冷冻保存、卵母细胞孤雌激活、绵羊同种和异种体细胞核移植及重构胚胎体外培养等关键技术进行了试验分析,以期提高绵羊体细胞核移植的效率,建立完善的核移植技术体系,为进一步获得体细胞克隆绵羊和异种克隆个体提供技术支撑。本研究内容包括以下几个方面:（1）在绵羊卵母细胞成熟培养液中添加孕酮等某些影响体外成熟的成份,确定绵羊卵母细胞的最佳成熟方案。（2）并通过对比不同冷冻保护剂对卵母细胞的冷冻保存效果,为核移植操作批量提供成熟的卵母细胞。（3）采用胞质注射法,建立精子提取物激活卵母细胞的方法,并且与离子霉素结合6-DMAP激活法和电激活法进行了比较,筛选出适宜激活方法。（4）体外分离培养得到道赛特绵羊和莎能奶山羊的耳皮肤成纤维样细胞,对绵羊皮肤成纤维细胞的生物学特性和不同细胞因子对其生长增殖的影响进行了研究,并对绵羊成纤维细胞和山羊成纤维细胞分别进行体外传代及冻存,为绵羊体细胞核移植和绵羊-山羊种间核移植试验提供了供体细胞。（5）绵羊孤雌激活胚、绵羊重构胚和绵羊-山羊种间重构胚分别置于不同的培养系统中培养,优化绵羊胚胎体外体系,增加胚胎的体外发育潜力。主要研究结果如下:1.绵羊卵母细胞体外成熟基础液中分别添加5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%发情牛血清（OCS）、5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%胎牛血清（FBS）、0.075 IU/mL HMG+OCS和0.075 IU/mL HMG+10% FBS,结果表明成熟液中添加OCS更有利于卵母细胞的成熟;添加5%～10%的BFF能够提高卵母细胞的成熟率,但20%BFF卵母细胞的体外成熟率下降;培养液中分别添加0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL孕酮,结果表明孕酮的最适添加剂量为0.5μg/mL。结果表明绵羊卵母细胞的体外成熟培养液组成为M199+10 mmol/L Hepes+0.38 mmol/L丙酮酸钠+ 25 mmol/L谷氨酰胺+1μg/mL 17β雌二醇（17β-E2）+5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%OCS+0.5μg/mL孕酮时其体外成熟培养效果最好。2.采用程序冷冻法对处于不同发育时期的绵羊卵母细胞进行冷冻保存,冷冻液Ⅰ～冷冻液Ⅳ对同一时期卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率、卵裂率和桑囊胚发育率均无显着影响,而冷冻液Ⅳ体外成熟24 h冷冻解冻后的卵母细胞发育率显着高于GV期和体外成熟10 h的卵母细胞,说明用乙二醇（EG）作为冷冻保护剂,添加0.1 mol/L海藻糖较合适对成熟培养24 h的绵羊卵母细胞进行冷冻保存;-6.5℃植冰时冷冻卵母细胞囊胚发育率显着高于其他组。采用玻璃化冷冻方法对绵羊GV期到体外成熟培养24 h卵母细胞进行冷冻保存试验证实,以玻璃化冷冻液Ⅱ作为冷冻剂,体外成熟培养24 h卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率最好,不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差,认为添加0.1 mol/ L海藻糖来进行卵母细胞的玻璃化冷冻可以起到保护作用,卵母细胞冷冻解冻后可以用作受体胞质进行核移植,重构胚的发育能力受冷冻处理的影响不显着。3.对绵羊卵母细胞以连续3次120 v/mm的直流脉冲进行电激活获得最佳激活效果,囊胚发育率显着高于脉冲1次和2次（P<0.05）;用分别注射不同剂量的精子提取物,对绵羊卵母细胞进行孤雌激活,结果表明最佳注射剂量为向每个卵母细胞注入精子提取物3 pL;分别用电激活法,离子霉素联合6-DMAP法和精子提取物胞质内注射法对绵羊卵母细胞进行激活,结果表明电脉冲的激活效果显着低于后二者的效果,且差异显着,精子提取物和离子霉素联合6-DMAP法的囊胚率差异不显着,均可以用于绵羊卵母细胞的激活。4.高糖DMEM较适宜于绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养和继代培养。以DMEM+50% NCS（new - born calf serum）,添加10% DMSO为冻存保护剂,进行冷冻保存的无角道赛特绵羊皮肤成纤维细胞,解冻细胞经体外56次传代培养,细胞形态维持在初始状况,保持了良好的遗传特性;添加EGF和胰岛素对绵羊皮肤成纤维细胞的生长均有促生长作用。5.卵母细胞体外成熟培养时间分别为1517 h、1921 h与2325 h时,随着培养时间的增加成熟率也增加,卵母细胞去核成功率随着成熟时间的延长而下降,试验认为卵母细胞体外成熟1921 h,既可以保证高的去核成功率,又可以保证卵母细胞较高的成功率,有利于提供充足的卵源;不经血清饥饿处理的供体细胞采用胞质注射法构建克隆胚,其胚胎发育率略高于血清饥饿处理组,但差异不显着。试验认为体外成熟培养1921 h的卵母细胞可以作为核移植受体细胞,未经血清饥饿处理的成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,可以获得较高的重构胚胎发育率。6.采用胞质内注射法构建绵羊皮肤纤维细胞重组胚,胚胎经离子霉素联合6-DMAP激活后,其细胞融合率、卵裂率和囊胚发育率均高于电融合法,同时结果表明重构胚用离子霉素联合6-DMAP或精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率相近,其中精子提取物的激活效果优于离子霉素激活法;激活间隔时间研究结果证实,卵母细胞注核后经体外培养3～4 h后再激活,可以获得较高的激活率。7.用冷冻的山羊成纤维细胞可以成功构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,种间体细胞核移植胚能够进行正常的早期发育,种间重构胚经离子霉素联合6-DMAP或者胞质注射精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率差异不显着（P>0.05）;用电脉冲融合法构建异种核移植胚胎时,其融合率、卵裂率和囊胚发育率均低于胞质注射法;不同山羊供体细胞进行山羊-绵羊异种核移植胚胎构建时,血清饥饿处理与否对种间核移植囊胚率无显着影响,表明山羊皮肤成纤维细胞可以不经过血清饥饿处理直接进行核移植。8.联合使用培养液能改善绵羊同种和异种重构胚的发育。即使用CR1aa+BSA培养重构胚3 d,再用SOFaa+5%FBS继续培养,获得的重构胚囊胚发育率较高。在胚胎培养液中添加孕酮可在一定程度上提高重构胚的卵裂率和囊胚率。其中以2.0和4.0μg/mL孕酮组的囊胚率最高,与对照组和其他孕酮浓度组差异显着。发现共培养体系对绵羊同种核移植重构胚的发育有显着的影响,而且在3 d更换1次新的饲养细胞单层对重构胚的发育有明显的促进作用。
华松[10]（2007）在《体细胞核移植及线粒体命运的研究》文中研究表明体细胞核移植突破了物种之间的“生殖隔离”限制,涉及物种之间在分子、细胞和生理水平上的相互作用。因此,该技术为研究核质互作的规律和特征及拯救濒危动物提供了新的途径。同时异种体细胞核移植也许是再现某些已经灭绝动物的唯一途径。但是由于卵母细胞核外遗传物质即线粒体DNA常被带入核移植胚中,使得目前的“克隆”并非真正意义上的“克隆”,实际上是一种带有供体和受体两种细胞mtDNA的异质体。因此为了提高体细胞核移植效率,同时也为得到完全意义上的克隆动物,我们重点研究了线粒体移植对牛体外胚胎发育的影响及体细胞核移植过程中线粒体的变化。1.制备牛和绵羊mtDNA实时荧光定量PCR标准品。用Primer 5.0软件设计牛和绵羊mtDNA荧光定量PCR特异性引物,将牛、绵羊卵母细胞直接裂解后作为PCR模板,PCR扩增目的片段后连接到pMD18-T载体上,用大肠杆菌DH5-α增值。最后对提取的质粒进行纯化,再分别按照梯度稀释进行荧光定量PCR。结果表明构建的牛、绵羊mtDNA定量PCR标准曲线分别跨越100～106和100～105数量级,两种标准曲线的线性关系良好。2.确定牛卵母细胞内线粒体的量与卵母细胞质量及随后胚胎发育之间的关系。根据颗粒-卵母细胞复合体表面特征将卵母细胞分为好和差两类。采用定量PCR的方法对卵母细胞内线粒体DNA进行检测,同时进行孤雌激活观察各类胚胎的发育。结果表明1)质量好的卵母细胞平均mtDNA拷贝数极显着高于差卵母细胞组;2)卵裂了的好卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显着高于卵裂了的差卵母细胞组;3)未卵裂的好卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显着高于未卵裂的差卵母细胞组;4)好卵母细胞组中,卵裂了的卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显着高于未卵裂的卵母细胞组。同时好卵母细胞48 h内卵裂率和第8 d的囊胚形成率及囊胚细胞数极显着高于差卵母细胞组。因此质量好的卵母细胞与差卵母细胞相比,前者含有更多的mtDNA,并且卵母细胞内mtDNA的量与卵母细胞的质量和随后胚胎的发育成正相关。3.研究颗粒细胞线粒体移植对牛体外胚胎发育的影响。采用分步离心法从颗粒细胞中提取线粒体,并分别注射到孤雌激活和ICSI胚内。结果表明无论是胞质内注射还是孤雌激活,注射了线粒体的差卵母细胞组在桑葚胚率、囊胚率及孵化囊胚率上与好卵母细胞组相比较,在统计学上无显着差异,但是显着高于未注射线粒体的差卵母细胞组;同样在囊胚细胞数上,好卵母细胞组和注射了线粒体的差卵母细胞组在统计学上无显着差异,但是他们都显着高于未注射线粒体的差卵母细胞组。因此,卵母细胞内线粒体的含量对于牛胚胎的早期发育非常重要,并且线粒体移植可以改善着床前胚胎的发育潜力。4.研究同种体细胞核移植胚内线粒体的变化。用线粒体特异性荧光探针对颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞内线粒体进行标记,再与去核的牛卵母细胞构建成胚胎,同时以未标记的供体细胞所构建的重组胚为对照。结果表明1)由颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞构建的重构胚在发育潜能上无差异;2)线粒体特异性荧光探针对重组胚的发育无影响;3)在16-细胞期前,各组能激发荧光的胚胎比率在统计学上无显着差异,而从桑葚胚开始,由颗粒细胞而来的胚胎能激发出荧光的比率要显着低于其他两类供体细胞构成的胚胎。说明核移植胚胎的发育潜能与供体细胞的类型无关,而颗粒细胞内线粒体在重组胚中被整合的效率要高于相应的胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞。5.构建牛-绵羊异种体细胞核移植胚。以牛卵母细胞为胞质受体,以绵羊胎儿成纤维细胞为供体细胞构建异种重构胚,并且对重构胚胎的染色体构成、胚胎形态及囊胚细胞进行了观察和分析。结果表明1)绵羊胎儿成纤维细胞在牛卵母细胞胞质的作用下能够去分化,构建的重构胚胎能够发育到囊胚阶段;2)66%的重构胚胎具有体细胞同样数目的染色体;3)重构胚胎的囊胚细胞数可以与绵羊孤雌激活胚胎的相比。说明绵羊胎儿成纤维细胞核能在去核的牛卵母细胞内进行去分化,并且构建的重构胚胎在核行和表型上比较正常。6.研究牛-绵羊异种体细胞核移植胚中线粒体的分配。采用荧光定量PCR的方式对牛-绵羊异种体细胞核移植早期胚胎及胚胎卵裂球中的mtDNA进行了定量分析。结果表明,从1-cell阶段到8-cell阶段,供体细胞mtDNA占受体胞质mtDNA的1%,而在16-cell阶段和囊胚阶段分别为0.6%和0.1%。说明随着异种重构胚的发育,两种来源的线粒体无论是在同一卵裂球内还是在同一胚胎内都是非均匀分配的。
二、核移植前激活牛受体卵子对供体核形态变化的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、核移植前激活牛受体卵子对供体核形态变化的影响（论文提纲范文）
（1）核质相互作用对供体核重编程的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.1 体细胞核移植的方法和程序 |
| 1.1.1 受体胞质的准备 |
| 1.1.2 供体细胞的选择 |
| 1.1.3 重构胚的构建 |
| 1.1.4 重构胚的激活 |
| 1.1.5 重构胚的培养 |
| 1.2 异种核移植研究进展 |
| 1.3 体细胞核移植技术存在的问题及应用前景 |
| 1.3.1 体细胞核移植存在的问题 |
| 1.3.2 体细胞核移植技术的应用 |
| 1.4 结语 |
| 第二章 体细胞重编程研究进展 |
| 2.1 通过核移植重编程体细胞 |
| 2.1.1 早期胚胎发育中的DNA 甲基化模式 |
| 2.1.2 核移植中异常的DNA 甲基化模式 |
| 2.1.3 组蛋白乙酰化修饰的作用 |
| 2.1.4 核移植过程中的组蛋白乙酰化变化 |
| 2.2 通过与干细胞融合重编程体细胞 |
| 2.3 胞质提取物诱导体细胞重编程 |
| 2.4 转录因子诱导体细胞重编程 |
| 2.4.1 Oct3/4（又称Pou5f1） |
| 2.4.2 Sox2 (SRY-related HMG box2) |
| 2.4.3 c-Myc |
| 2.4.4 Klf4 (Kruppel-like factor 4) |
| 2.4.5 Nanog |
| 2.4.6 Lin-28 |
| 2.4.7 iPS 细胞的应用和存在的问题 |
| 第三章 牛卵母细胞体外成熟培养体系的优化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用品 |
| 3.1.2 卵母细胞的采集 |
| 3.1.3 卵母细胞体外成熟培养 |
| 3.1.4 卵母细胞孤雌激活及体外培养 |
| 3.1.5 凋亡检测 |
| 3.1.6 实验设计 |
| 3.1.7 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同激素配比对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.2 EGF 对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 不同激素配比对牛卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.2 EGF 对卵母细胞体外成熟和胚胎发育的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 供体细胞对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用品 |
| 4.1.2 卵母细胞采集与体外成熟 |
| 4.1.3 供体细胞制备 |
| 4.1.4 核移植 |
| 4.1.5 凋亡检测 |
| 4.1.6 实验设计 |
| 4.1.7 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 血清饥饿法与接触抑制法对重构胚胎发育的影响 |
| 4.2.2 供体细胞传代对重构胚发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 血清饥饿法与接触抑制法的比较 |
| 4.3.2 供体细胞传代对核移植的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛卵胞质抽提物重编程供体细胞对克隆胚胎发育的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 卵母细胞采集与成熟 |
| 5.1.2 牛卵胞质抽提物的制备 |
| 5.1.3 牛卵胞质抽提物预处理供体细胞 |
| 5.1.4 处理细胞的RT-PCR 检测 |
| 5.1.5 处理细胞的免疫细胞化学分析 |
| 5.1.6 核移植 |
| 5.1.7 囊胚细胞计数 |
| 5.1.8 实验设计 |
| 5.1.9 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不耐氧链球菌溶血素处理后供体核DNA 的完整性 |
| 5.2.2 牛卵胞质抽提物对供体细胞的重编程作用 |
| 5.2.3 牛卵胞质抽提物重编程供体细胞对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 5.2.4 牛卵胞质抽提物重编程供体细胞对核移植囊胚质量的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 牛卵胞质抽提物对供体细胞的重编程作用 |
| 5.3.2 供体核与受体胞质的一致性对体细胞核移植的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 小鼠-牛异种核移植胚胎体外发育与合子激活基因的表达 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验用品 |
| 6.1.2 卵母细胞采集与成熟培养 |
| 6.1.3 供体细胞制备 |
| 6.1.4 核移植 |
| 6.1.5 小鼠受精卵采集与培养 |
| 6.1.6 RT-PCR |
| 6.1.7 实验设计 |
| 6.1.8 统计分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 小鼠-牛异种克隆胚的体外发育 |
| 6.2.2 小鼠-牛异种克隆胚的发育形态 |
| 6.2.3 小鼠合子激活基因在异种克隆胚中的表达情况 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 小鼠-牛异种克隆胚的体外发育 |
| 6.3.2 异种克隆胚中的合子基因激活 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 牛孤雌激活胚胎核质对热激的易感性差异及其相互作用 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验用品 |
| 7.1.2 卵母细胞采集与成熟 |
| 7.1.3 卵母细胞孤雌激活及热激处理 |
| 7.1.4 核置换 |
| 7.1.5 胚胎体外培养 |
| 7.1.6 RT-PCR |
| 7.1.7 凋亡检测 |
| 7.1.8 实验设计 |
| 7.1.9 统计分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 热激后核质置换胚胎的体外发育 |
| 7.2.2 合子激活基因在核质置换胚胎中的表达情况 |
| 7.2.3 热激后核质置换胚胎的凋亡情况 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 热激后核与胞质对胚胎发育的影响 |
| 7.3.2 热激后核与胞质对合子基因激活的影响 |
| 7.3.3 热激后核与胞质对胚胎凋亡的调控作用 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 实验用主要溶液的配制 |
| 附录2 实验用常规仪器 |
| 附录3 主要英文缩写检索表（字母顺序） |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）牛卵母细胞成熟前基因注射的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植供体核的重编程 |
| 1.1 DNA 甲基化 |
| 1.1.1 DNA 甲基化定义 |
| 1.1.2 甲基化的生物学功能 |
| 1.1.3 重构胚核重编程中甲基化变化 |
| 1.2 组蛋白乙酰化 |
| 1.2.1 核仁结构的修饰 |
| 1.2.2 组蛋白乙酰化 |
| 1.2.3 重构胚核重编程中组蛋白的乙酰化 |
| 1.3 X 染色体失活 |
| 1.3.1 X 染色体失活定义 |
| 1.3.2 重构胚中X 染色体失活 |
| 1.4 端粒 |
| 1.4.1 端粒定义及生物学特性 |
| 1.4.2 重构胚中端粒长度的变化 |
| 1.5 印记基因的表达 |
| 1.5.1 印记基因 |
| 1.5.2 印记基因在核移植重构胚中的变化 |
| 1.6 其他与发育相关基因的表达 |
| 1.6.1 重构胚中基因表达改变 |
| 1.6.2 调控胚胎发育的基因 |
| 第二章 体内发育胚胎与核移植重构胚胎发育过程中的异同 |
| 2.1 正常受精胚胎发育事件概述 |
| 2.1.1 细胞生物学变化 |
| 2.1.2 分子生物学机理 |
| 2.2 核移植胚胎发育过程的事件概述 |
| 2.2.1 细胞生物学变化 |
| 2.2.2 分子生物学机理 |
| 2.3 核移植胚胎发育事件的影响因素 |
| 2.3.1 卵细胞质量的影响 |
| 2.3.2 供体细胞状态的影响 |
| 2.3.3 卵细胞质与供体细胞核的协调互作 |
| 第三章 影响核移植重编程的因素 |
| 3.1 供体细胞的选择与处理对重编程过程的影响 |
| 3.1.1 供体细胞的选择 |
| 3.1.2 供体细胞的处理 |
| 3.2 受体细胞质的选择和处理对重编程的影响 |
| 3.3 核浆素对供体细胞的重编程的作用 |
| 3.3.1 核浆素的结构和生物学性质 |
| 3.3.2 核浆素对体细胞去分化的影响 |
| 试验研究 |
| 第四章 体外成熟不同时间剥离颗粒细胞对卵母细胞发育潜能的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 仪器和试剂 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 4.4.1 饲养层的制备 |
| 4.4.2 不同时间剥离颗粒细胞对卵母细胞发育的影响 |
| 第五章 质粒显微注射对卵母细胞发育潜能的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 仪器和试剂 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 观察转染细胞中H1c 的表达、定位情况 |
| 5.2.2 重组质粒pVenus-H1foo 的酶切鉴定 |
| 5.2.3 荧光显微镜下观察pVenus-H1foo mRNA 在卵母细胞内的表达及定位 |
| 5.2.4 质粒pVenus, pDsRed1-N1 和重组质粒pDsRed1-H1c 显微注射结果 |
| 5.2.5 显微注射对卵母细胞孤雌激活发育的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 5.4.1 mRNA、空质粒在卵母细胞中的表达 |
| 5.4.2 重组质粒在卵母细胞中的表达 |
| 本研究新见解 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）猪体细胞核移植相关技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植技术研究进展 |
| 1.核移植研究历史回顾 |
| 2.核移植技术程序 |
| 3.核移植胚胎的发育机理 |
| 4.影响核移植效果的因素 |
| 5.不同动物的核移植发展现状 |
| 6.核移植技术当前面临的问题 |
| 7.体细胞核移植的发展前景 |
| 8.核移植技术所生产的转基因食品安全性 |
| 9.体细胞核移植技术展望 |
| 10.结束语 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟过程中减数分裂进程的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞体外成熟培养体系建立与优化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 激活方法对猪卵母细胞孤雌发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪核移植供体细胞分离与传代培养 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第六章 猪体细胞核移植方法的摸索 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第七章 供体细胞种类及其培养处理方法对猪体细胞核移植效果的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写—中文对照表 |
| 图片与说明 |
| 个人简历 |
| 文献发表情况 |
| 致谢 |
（4）提高牛体细胞核移植效率的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 体外培养细胞的永生化 |
| 1.1 永生化的概念和永生化细胞的特性 |
| 1.2 细胞永生化的机理 |
| 1.2.1 端粒、端粒酶与永生化 |
| 1.2.2 p16~(INK4a)-CDK4/6-cyclin D-Rb-E2F 信号通路与永生化 |
| 1.2.3 p14ARF－MDM2-p53 信号通路与永生化 |
| 1.2.4 表观遗传与永生化 |
| 1.3 细胞永生化的方法 |
| 1.3.1 理化因素 |
| 1.3.2 转染病毒 |
| 1.3.3 转染原癌基因 |
| 1.3.4 转染TERT 基因 |
| 1.3.5 其他 |
| 1.4 细胞癌变与永生化 |
| 1.5 永生化的应用以及存在的问题 |
| 1.5.1 细胞分化与肿瘤发生的分子机制研究 |
| 1.5.2 细胞治疗与生物人工器官 |
| 1.5.3 药物代谢与毒理研究 |
| 1.5.4 生产转基因动物中的潜在应用价值 |
| 第二章 影响体细胞核移植效率的因素 |
| 2.1 胚胎凋亡与体细胞核移植 |
| 2.1.1 胚胎凋亡的影响因素 |
| 2.1.2 胚胎凋亡的检测 |
| 2.2 供体细胞与体细胞核移 |
| 2.2.1 细胞的传代次数对核移植的影响 |
| 2.2.2 供体细胞的组织来源对核移植的影响 |
| 2.2.3 细胞周期阶段对核移植的影响 |
| 2.2.4 使核供体与受体卵母细胞相协调 |
| 2.2.5 核的重编程 |
| 2.3 卵母细胞成熟 |
| 2.3.1 卵母细胞成熟的形态变化 |
| 2.3.2 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 2.3.3 卵母细胞成熟的调控因子 |
| 2.4 重构胚激活与体细胞核移植 |
| 2.4.1 物理激活 |
| 2.4.2 化学激活 |
| 2.4.3 精子提取物激活 |
| 2.5 胚胎培养与体细胞核移植 |
| 2.6 胚胎的冷冻保存 |
| 2.6.1 冷冻保护剂的种类 |
| 2.6.2 影响胚胎冷冻的其它因素 |
| 2.6.3 影响冷冻效果的其他因素 |
| 前言 |
| 第三章 人端粒酶催化亚基转染牛耳成纤维细胞 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞来源 |
| 3.1.2 试剂与用品 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 原代细胞培养和G418 致死浓度筛选 |
| 3.2.2 脂质体法转染pEGFP-hTERT 基因 |
| 3.2.3 抗性细胞克隆的挑取和保存 |
| 3.2.4 RT-PCR 检测 |
| 3.2.5 端粒酶活性检测 |
| 3.2.6 Western Blotting 检测 |
| 3.2.7 细胞软琼脂生长分析 |
| 3.2.8 染色体条带分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 基因转染与阳性单克隆的挑选 |
| 3.3.2 RT-PCR 检测阳性细胞克隆在m RNA 水平的表达 |
| 3.3.3 细胞端粒酶活性的检测 |
| 3.3.4 细胞端粒酶催化亚基的Western Blotting 分析 |
| 3.3.5 阳性细胞克隆HBC3 细胞系的传代 |
| 3.3.6 HBC3 细胞软琼脂生长分析 |
| 3.3.7 HBC3 细胞染色体条带分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 HBC3 细胞系的生物学特性检测和核移植 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 卵巢来源 |
| 4.1.2 试剂药品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 EGF 和胰岛素对HBC3 生长的影响 |
| 4.2.2 血清饥饿对HBC3 生长和凋亡的影响 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测BFC 和HBC3 细胞的凋亡 |
| 4.2.4 HBC3 的体细胞核移植 |
| 4.2.5 囊胚细胞计数和凋亡的影响 |
| 4.2.6 统计方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 EGF 和胰岛素对HBC3 生长的影响 |
| 4.3.2 血清饥饿对HBC3 生长和凋亡的影响 |
| 4.3.3 流式细胞仪检测HBC3 细胞的凋亡 |
| 4.3.4 不同供体细胞的核移植 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HBC3 的生物学特性 |
| 4.4.2 端粒酶活性与核移植重构胚的发育 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 细胞癌化对体细胞核移植的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 卵巢来源 |
| 5.1.2 试剂仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 牛耳成纤维细胞的化学致癌物处理 |
| 5.2.2 ABF11 和ABF12 癌化细胞系的分离和形态观察 |
| 5.2.3 ABF11 和ABF12 的端粒酶活性检测 |
| 5.2.4 ABF12 生长曲线的测定 |
| 5.2.5 血清饥饿对ABF12 生长和凋亡的影响 |
| 5.2.6 ABF12 的软琼脂生长试验 |
| 5.2.7 ABF12 的染色体条带分析 |
| 5.2.8 ABF12 的体细胞核移植试验 |
| 5.2.9 囊胚细胞计数和凋亡染色 |
| 5.2.10 统计方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 ABF11 和ABF12 细胞系的建立和形态观察 |
| 5.3.2 ABF11 和ABF12 的端粒酶活性检测 |
| 5.3.3 ABF12 生长曲线 |
| 5.3.4 血清饥饿对ABF12 生长的影响 |
| 5.3.5 ABF12 的软琼脂生长试验 |
| 5.3.6 ABF12 的染色体条带分析 |
| 5.3.7 ABF12 的体细胞核移植试验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 卵母细胞体外成熟对体细胞核移植的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 卵巢来源 |
| 6.1.2 试剂仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 卵母细胞的采集 |
| 6.2.2 卵母细胞体外成熟培养 |
| 6.2.3 卵母细胞的去核操作 |
| 6.2.4 供体细胞的准备 |
| 6.2.5 透明带下注射法核移植 |
| 6.2.6 核移植胚胎的激活 |
| 6.2.7 核移植胚胎的体外培养 |
| 6.2.8 卵母细胞的程序化冷冻 |
| 6.2.9 卵母细胞的体外受精和培养 |
| 6.2.10 胚胎细胞计数与凋亡染色 |
| 6.2.11 统计方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 成熟培养液中添加EGF 对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.3.2 成熟培养液中添加VE 对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.3.3 成熟培养液中添加血清对卵母细胞成熟和胚胎发育的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 结论 |
| 第七章 核移植胚胎的激活和发育阻滞 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 卵巢来源 |
| 7.1.2 精子提取物的获得 |
| 7.1.3 试剂仪器 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养 |
| 7.2.2 卵母细胞的去核操作 |
| 7.2.3 供体细胞的准备 |
| 7.2.4 核移植重构胚胎的构建 |
| 7.2.5 核移植胚胎的激活方法的比较 |
| 7.2.6 核移植胚胎的体外培养 |
| 7.2.7 孤雌激活胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.2.8 体外受精胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.2.9 胚胎细胞计数与凋亡染色 |
| 7.2.10 与统计分析 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 不同浓度精子提取物对体细胞核移植胚胎激活的效果 |
| 7.3.2 精子提取物结合电化学方法激活对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 7.3.3 电激活和化学激活方法对牛体细胞核移植体外发育的影响 |
| 7.3.4 孤雌激活胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.3.5 体外受精胚胎与核移植胚胎体外发育阻滞的比较 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 精子提取物对体细胞核移植胚胎的激活 |
| 7.4.2 精子提取物与电化学方法的激活效果比较 |
| 7.4.3 体细胞重构胚体外发育的阻滞 |
| 7.5 结论 |
| 第八章 重构核移植胚胎的体外培养和冷冻 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 卵巢来源 |
| 8.1.2 试剂仪器 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 卵母细胞的采集和成熟培养 |
| 8.2.2 卵母细胞的去核操作 |
| 8.2.3 供体细胞的准备 |
| 8.2.4 透明带下注射法核移植和电融合 |
| 8.2.5 核移植胚胎的激活 |
| 8.2.6 核移植胚胎的体外培养 |
| 8.2.7 囊胚细胞团计数和凋亡染色 |
| 8.2.8 核移植重构胚胎的程序化冷冻保存 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 EGF 对重构胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.3.2 孕酮对体外培养的核移植重构胚发育和冷冻保存的影响 |
| 8.3.3 VE 对核移植重构胚体外发育的影响 |
| 8.3.4 海藻糖对体外培养的核移植重构胚冷冻保存的影响 |
| 8.3.5 不同培养阶段的重构胚胎冷冻保存效果 |
| 8.4 讨论 |
| 8.4.1 EGF 对核移植胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.4.2 孕酮对核移植胚胎体外发育和冷冻的影响 |
| 8.4.3 VE 对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.4.4 海藻糖对核移植胚胎冷冻效果的影响 |
| 8.4.5 不同发育时期的核移植胚胎胚胎冷冻效果分析 |
| 8.5 结论 |
| 论文总结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳动物卵母细胞体外成熟与体外受精的研究进展 |
| 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟的机理 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的判断 |
| 1.1.4 卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 精子的体外获能与体外受精 |
| 1.2.1 受精作用机制 |
| 1.2.2 精子体外获能 |
| 1.2.3 体外受精 |
| 1.2.4 体外受精的影响因素 |
| 1.3 受精卵的体外培养 |
| 1.3.1 受精卵体外发育阻断 |
| 1.3.2 受精卵体外培养系统 |
| 1.3.3 影响体外受精卵体外发育的因素 |
| 1.4 小结与展望 |
| 第二章 哺乳动物细胞核移植的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 2.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 2.3 哺乳动物异种细胞核移植研究进展 |
| 2.4 哺乳动物细胞核移植的方法和程序 |
| 2.4.1 受体细胞的选择与去核 |
| 2.4.2 供体细胞的选择 |
| 2.4.3 细胞核的移植 |
| 2.4.4 重组胚的激活 |
| 2.4.5 重构胚的培养 |
| 2.5 哺乳动物核移植相关机理的研究进展 |
| 2.5.1 MPF 与核移植的关系 |
| 2.5.2 体细胞供体核的表观遗传重编程 |
| 2.6 影响哺乳动物核移植成功率的因素 |
| 2.6.1 核受体胞质对核移植的影响 |
| 2.6.2 核供体对核移植的影响 |
| 2.6.3 融合-激活方案对核移植的影响 |
| 2.6.4 核移植胚胎的体外培养对发育的影响 |
| 2.7 细胞核移植技术存在的问题和应用前景 |
| 2.7.1 细胞核移植技术存在的问题 |
| 2.7.2 细胞核移植技术的应用前景 |
| 第三章 牛卵泡卵母细胞体外受精的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 成熟液中添加EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.2.2 不同精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.2.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 EGF、Insulin 对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响 |
| 3.3.2 精液处理方法对牛卵泡卵母细胞体外受精的影响 |
| 3.3.3 体细胞共培养对牛体外受精卵体外发育的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 激活方法和共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.2.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 不同激活方法对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.3.2 不同共培养系统对牛核移植胚胎体外发育的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 牛体细胞克隆胚胎DNA 甲基化和组蛋白乙酰化分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 抗5－甲基胞嘧啶抗体和抗组蛋白H3(acetyl K18)抗体特异性检测 |
| 5.2.2 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核DNA 甲基化水平比较 |
| 5.2.3 牛体外受精胚胎和核移植胚胎各发育阶段单细胞核组蛋白乙酰化水平比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 DNA 甲基转移酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 5-aza-dC 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.2 5-aza-dC 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.2.3 体细胞和重构胚均用5-aza-dC处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 TSA 处理供体细胞对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.2 TSA 处理重构胚对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.2.3 体细胞和重构胚均用TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 5-aza-dC 联合 TSA 对牛核移植胚胎体外发育 及其表观遗传状态的影响 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 5-aza-dC＋TSA 处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响 |
| 8.2.2 不同个体来源成纤维细胞作核供体，供体细胞和重构胚均用5-aza-dC＋TSA 处理后对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 卵泡和卵母细胞发生的分子调控机制 |
| 1 生殖系a 因子 |
| 2 新生卵巢同源盒基因 |
| 3 Oct4、Sox2 和 Nanog |
| 4 KIT 配体（KITL）和 KIT |
| 5 抗苗勒激素 |
| 6 叉头转录因子2 |
| 7 神经营养因子和它们的受体 |
| 8 生长分化因子9 和骨形态发生蛋白15 |
| 9 成纤维细胞生长因子2 和成纤维细胞生长因子7 |
| 10 白血病抑制因子 |
| 11 胰岛素样生长因子家族 |
| 12 类固醇 |
| 第二章 哺乳动物体外受精、孤雌激活和核移植技术的研究进展 |
| 1 体外受精 |
| 1.1 研究概况 |
| 1.2 研究方法及进展 |
| 2 孤雌生殖 |
| 2.1 研究概况 |
| 2.2 卵母细胞孤雌激活的方法 |
| 3 细胞核移植 |
| 3.1 研究进展 |
| 3.2 哺乳动物核移植的基本操作程序 |
| 第三章 哺乳动物卵母细胞的成熟和早期胚胎的体外培养 |
| 1 卵母细胞体外成熟 |
| 1.1 研究简史 |
| 1.2 卵母细胞体外成熟的主要环节 |
| 1.3 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 2 胚胎的培养 |
| 2.1 胚胎的培养历史概况 |
| 2.2 培养液的种类，培养液的基本成分及其功用 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第一章 Figla 基因的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Figla 基因的 PCR 扩增 |
| 2.2 克隆片断测序结果 |
| 2.3 基因结构分析 |
| 2.4 磷酸化位点和激酶特异磷酸化位点的预测 |
| 2.5 Figla 基因序列二级结构预测 |
| 2.6 三级结构预测 |
| 2.7 保守结构域预测 |
| 2.8 Figla 基因m RNA 在各组织间的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SMART 技术 |
| 3.2 Figla 及其相关基因序列分析 |
| 3.3 Figla 基因功能预测分析 |
| 4 小结 |
| 第二章 牛和猪卵母细胞和早期胚胎中相关基因表达的检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 内参引物的鉴定与选择 |
| 2.2 比较不同方法提取卵母细胞和胚胎total RNA |
| 2.3 比较不同细胞保存方法对total RNA 提取的影响 |
| 2.4 比较不同保存方法对cDNA 品质的的影响 |
| 2.5 实时荧光定量 PCR 条件的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 荧光染料法在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育相关基因研究中的应用 |
| 3.2 从微量细胞中提取 RNA 技术 |
| 3.3 引物对实时荧光定量 PCR 的影响 |
| 3.4 模板、引物模板配比关系对实时荧光定量 PCR 的影响 |
| 3.5 内参基因的选择对基因表达相对定量结果的影响 |
| 4 小结 |
| 第三章 Figla 基因和BDNF 基因在猪和牛卵母细胞和早期胚胎中定量表达的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 牛 IVF、PA 和 NT 胚胎的制备和培养 |
| 1.2 猪 PA 胚胎的制备和培养 |
| 1.3 囊胚冷冻 |
| 1.4 荧光定量 PCR 分析 |
| 1.5 BDNF 荧光染色 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NT 胚胎的获得 |
| 2.2 猪和牛卵母细胞和早期胚胎的获得 |
| 2.3 引物的鉴定与选择 |
| 2.4 Figla 和 BDNF 基因表达水平 |
| 2.5 BDNF 在牛囊胚中的定位表达研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 基因表达的相对定量 |
| 3.2 Figla基因和BDNF基因在哺乳动物卵母细胞和早期胚胎中的表达 |
| 3.3 不同类型的胚胎在 mRNA 水平中表达差异的研究 |
| 4 小结 |
| 第四章 BDNF、NGF 对猪和牛早期胚胎发育的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 试验设计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 培养液中添加 BDNF 对牛 IVF 胚胎体外发育的影响 |
| 2.2 培养液中添加 BDNF 对牛 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.3 培养液中添加 NGF 对牛 IVF 胚胎体外发育的影响 |
| 2.4 培养液中添加 NGF 对牛 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.5 培养液中添加 BDNF 对猪 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.6 培养液中添加 NGF 对猪 PA 胚胎体外发育的影响 |
| 2.7 培养液中添加 BDNF 对牛颗粒细胞体外生长的影响 |
| 2.8 培养液中添加 NGF 对牛颗粒细胞体外增生的影响 |
| 2.9 颗粒细胞生长情况分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BDNF 与生殖系统的关系 |
| 3.2 NGF 与生殖系统的关系 |
| 3.3 颗粒细胞与胚胎发育的关系 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（7）人—山羊异质胚胎构建及胚胎干细胞的分离培养（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 动物细胞核移植的研究进展 |
| 1.1 同种动物核移植的研究现状 |
| 1.1.1 胚胎细胞来源的同种动物核移植 |
| 1.1.2 体细胞来源的同种动物核移植 |
| 1.2 异种动物核移植的研究现状 |
| 1.2.1 胚胎细胞来源的异种动物核移植 |
| 1.2.2 体细胞来源的异种动物核移植 |
| 1.3 动物体细胞核移植的机理 |
| 1.3.1 Ca~(2+)启动供体核的再程序化 |
| 1.3.2 MPF 对供体核的再程序化 |
| 1.3.3 卵子细胞质对供体核的再程序化 |
| 1.3.4 DNA 甲基化对供体核的再程序化 |
| 1.4 动物核移植的应用前景 |
| 1.4.1 治疗性克隆 |
| 1.4.2 畜牧业生产 |
| 1.4.3 核移植技术和转基因技术结合 |
| 1.4.4 保护濒危野生动物 |
| 1.4.5 理论价值 |
| 1.5 动物核移植存在的问题 |
| 第二章 胚胎干细胞的研究进展 |
| 2.1 胚胎干细胞的概念和基本特征 |
| 2.2 ESC 的胚胎来源 |
| 2.2.1 孤雌激活胚胎 |
| 2.2.2 胚胎生殖干细胞 |
| 2.2.3 体外受精胚胎 |
| 2.2.4 核移植胚胎 |
| 2.2.5 其他来源 |
| 2.3 胚胎干细胞研究历史 |
| 2.4 胚胎干细胞的生物学特征 |
| 2.4.1 形态学特征 |
| 2.4.2 核型分析 |
| 2.4.3 端粒酶活性 |
| 2.4.4 阶段性特异性胚胎细胞表面抗原的表达 |
| 2.4.5 转录因子Oct-4 的表达 |
| 2.4.6 碱性磷酸酶的活性 |
| 2.4.7 体内外分化能力 |
| 2.5 胚胎干细胞应用前景 |
| 2.5.1 克隆和生产转基因动物 |
| 2.5.2 动物发育生物学研究 |
| 2.5.3 组织器官修复和移植治疗研究 |
| 2.6 存在的问题展望 |
| 第三章 人胚胎干细胞建系方法的研究 |
| 3.1 HESCS 分离培养的方法 |
| 3.1.1 ICM 分离的方法 |
| 3.2 HESCS 培养体系 |
| 3.2.1 含饲养层的培养体系 |
| 3.2.2 无饲养层培养体系 |
| 3.3 胚胎干细胞的传代方法 |
| 3.3.1 机械法 |
| 3.3.2 酶消化法 |
| 3.4 HESCS 的鉴定方法 |
| 3.4.1 形态学鉴定 |
| 3.4.2 碱性磷酸酶活性 |
| 3.4.3 阶段特异性胚胎细胞表面抗原 |
| 3.4.4 端粒酶活性分析 |
| 3.4.5 全能性基因的表达 |
| 3.4.6 核型分析 |
| 3.4.7 分化潜能 |
| 3.5 问题与展望 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 第四章 人成纤维细胞单克隆的制备及扩大培养 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 主要液体的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 人皮肤组织的采集及原代培养 |
| 4.2.2 人皮肤成纤维细胞的传代培养及冷冻与复苏 |
| 4.2.3 细胞单克隆的制备与扩大培养 |
| 4.2.4 染色体Giemsa 染色的核型分析 |
| 4.2.5 试验数据的统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 细胞单克隆的分离与扩大培养 |
| 4.3.2 分离克隆的染色体核型分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 人-山羊异质核移植程序的优化 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 供体细胞的准备 |
| 5.2.2 卵母细胞的体外成熟及核移植 |
| 5.2.3 电融合 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 电压对人-山羊异质核移植电融合效率的影响 |
| 5.3.2 脉冲时程对人-山羊异质核移植电融合效率的影响 |
| 5.3.3 脉冲次数对人-山羊异质核移植电融合效率的影响 |
| 5.3.4 融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响 |
| 5.3.5 培养体系对重组胚胎体外发育的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 TSA 处理对人-山羊异质克隆胚胎发育的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 实验试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 TSA 处理供体细胞 |
| 6.2.2 卵母细胞的体外成熟及核移植 |
| 6.2.3 电融合 |
| 6.2.4 克隆胚胎的激活与培养 |
| 6.2.5 TSA 处理重构胚 |
| 6.2.6 试验数据的统计分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 TSA对供体细胞的影响 |
| 6.3.2 TSA 处理供体细胞对克隆胚早期发育力的影响 |
| 6.3.3 TSA 处理重构胚对克隆胚早期发育的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 不同饲养层对人胚胎干细胞支持情况 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验试剂 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.1.3 饲养层细胞的准备 |
| 7.1.4 细胞饲养层的制备 |
| 7.1.5 人-山羊异质核移植囊胚的生产 |
| 7.1.6 ICM 的分离 |
| 7.1.7 摸索适合hESCs 生长的饲养层条件 |
| 7.1.8 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 丝裂霉素处理时间对不同细胞复苏率的影响 |
| 7.2.2 不同类型细胞饲养层对hESCs 生长的影响 |
| 7.2.3 不同密度的饲养层对hESCs 生长的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 INT-HESCS 的无动物源性成份限定性培养 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 实验试剂 |
| 8.1.2 实验仪器 |
| 8.1.3 HFF 饲养层细胞的制备 |
| 8.1.4 iNT-hESCs 细胞的培养、传代 |
| 8.1.5 iNT-hESCs 的鉴定 |
| 8.1.6 统计学分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 HESCO 对人-山羊异质核移植来源的iNT-hESCs 生长支持情况 |
| 8.2.2 纤连蛋白对iNT-hESCs 生长的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）牛体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物核移植研究进展 |
| 1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.2 哺乳动物胚胎干细胞细胞核移植研究进展 |
| 1.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.1 牛体细胞核移植研究进展 |
| 1.3.2 其他动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4 哺乳动物异种体细胞核移植研究进展 |
| 1.5 哺乳动物体细胞核移植相关领域研究进展 |
| 1.5.1 利用体细胞核移植技术生产转基因动物的研究进展 |
| 1.5.2 治疗性克隆的研究进展 |
| 1.6 我国核移植研究进展 |
| 第二章 哺乳动物体细胞核移植理论基础 |
| 2.1 受体胞质 |
| 2.2 供体细胞 |
| 2.2.1 供体细胞类型对发育的影响 |
| 2.2.2 供体细胞周期对发育的影响 |
| 2.2.3 核供体细胞的传代次数和来源 |
| 2.3 核供体细胞与受体细胞之间的相互作用 |
| 2.4 核移植相关问题的研究进展 |
| 2.4.1 重构胚基因组的重编程 |
| 2.4.2 DNA 甲基化 |
| 2.4.3 组蛋白乙酰化 |
| 2.4.3 X 染色体失活 |
| 2.4.4 端粒 |
| 2.4.5 印记基因的表达 |
| 2.4.6 线粒体DNA 的命运 |
| 第三章 哺乳动物体细胞核移植研究存在的问题及应用前景 |
| 3.1 核移植研究中存在的问题 |
| 3.2 哺乳动物核移植的应用前景 |
| 3.2.1 体细胞核移植研究在基础科学研究中的作用 |
| 3.2.2 体细胞核移植研究在医学领域的作用 |
| 3.2.3 体细胞核移植研究与动物保护 |
| 3.2.4 体细胞核移植研究在畜牧生产的作用 |
| 试验研究 |
| 第四章 牛成纤维细胞和颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 仪器和试剂 |
| 4.1.2 试验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 牛耳皮肤成纤维细胞（BEF）的准备 |
| 4.2.2 颗粒细胞的分离与培养 |
| 4.2.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛耳皮肤成纤维细胞的分离和培养 |
| 4.3.2 牛颗粒细胞的分离和培养 |
| 4.3.3 牛耳皮肤成纤维细胞核型分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 BEF 的分离与培养,核型分析 |
| 4.4.2 供体细胞类型对克隆效率的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛卵母细胞体外成熟的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 血清及血清替代物对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.2 尿嘧啶对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.2.3 ATP 对牛卵母细胞体外成熟和激活胚胎发育能力的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 血清及血清替代物 |
| 5.3.2 尿嘧啶 |
| 5.3.3 ATP |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛体细胞核移植的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 仪器和试剂 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同融合参数的融合效率 |
| 6.2.2 不同融合电压对融合效率的影响 |
| 6.2.3 不同融合时间对融合效率的影响 |
| 6.2.4 不同激活方法对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.5 不同激活时间对牛重构胚发育的影响 |
| 6.2.6 不同培养液对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.7 与牛颗粒细胞共培养对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.2.8 不同供体细胞对牛体细胞核移植的影响 |
| 6.2.9 不同代数供体细胞对牛体细胞核移植的影响（BEF422） |
| 6.2.10 不同品种受体对牛体细胞核移植妊娠率的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 关于电融合 |
| 6.3.2 关于重构胚激活 |
| 6.3.3 关于重构胚培养 |
| 6.3.4 关于供核细胞 |
| 6.3.5 不同品种受体对牛核移植妊娠率的影响 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究新见解 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）提高绵羊体细胞核移植效率的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 哺乳类动物卵母细胞的体外利用开发 |
| 1.1 卵泡卵母细胞体外成熟 |
| 1.1.1 卵母细胞成熟概论 |
| 1.1.2 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.1.3 卵母细胞成熟的判断 |
| 1.1.4 卵母细胞的获取与分级 |
| 1.1.5 影响卵母细胞体外成熟的因素 |
| 1.2 卵母细胞冷冻保存的研究进展 |
| 1.2.1 卵母细胞冷冻保存原理 |
| 1.2.2 冷冻保护剂的种类 |
| 1.2.3 卵母细胞的冷冻方法 |
| 1.2.4 影响卵母细胞冷冻的因素 |
| 第二章 哺乳类动物核移植的研究进展 |
| 2.1 哺乳类动物胚胎细胞及干细胞核移植研究进展 |
| 2.2 哺乳类动物同种体细胞核移植研究进展 |
| 2.2.1 国外哺乳类动物同种体细胞核移植研究概况 |
| 2.2.2 国内哺乳类动物同种体细胞核移植研究概况 |
| 2.3 异种动物细胞核移植研究进展 |
| 2.3.1 国外异种动物细胞核移植研究历史概况 |
| 2.3.2 国内异种动物细胞核移植研究历史概况 |
| 2.3.3 异种动物细胞核移植相关问题的研究概况 |
| 2.3.4 提高动物细胞异种核移植尚待解决的问题 |
| 2.4 哺乳动物核移植相关机制的研究进展 |
| 2.4.1 MPF 与核移植的关系 |
| 2.4.2 卵母细胞激活 |
| 2.4.3 核的重编程 |
| 2.4.4 端粒及端粒酶问题 |
| 2.4.5 基因印迹问题 |
| 2.5 影响哺乳动物核移植的因素 |
| 2.5.1 核受体胞质的准备及其对核移植的影响 |
| 2.5.2 核供体的准备及其对核移植的影响 |
| 2.5.3 卵母细胞去核方法对核移植的影响 |
| 2.5.4 融合-激活方案对核移植的影响 |
| 2.6 体细胞核移植技术的应用前景和存在问题 |
| 2.6.1 体细胞核移植技术的应用前景 |
| 2.6.2 体细胞核移植存在的问题 |
| 前言 |
| 第三章 绵羊卵母细胞的体外成熟培养 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料及仪器 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同类型血清和促性腺激素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.2 添加不同浓度BFF 对绵羊母细胞体外成熟的影响 |
| 3.2.3 不同浓度的孕酮添加对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 不同类型血清对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.2 不同来源促性腺激素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.3 添加不同浓度BFF 对绵羊母细胞体外成熟的影响 |
| 3.3.4 不同浓度的孕酮对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 绵羊卵母细胞的冷冻保存试验研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料及仪器设备 |
| 4.1.2 冷冻液的配制及试验设计 |
| 4.1.3 绵羊卵母细胞的采集 |
| 4.1.4 卵母细胞的体外成熟 |
| 4.1.5 卵母细胞的程序化冷冻 |
| 4.1.6 卵母细胞的玻璃化冷冻 |
| 4.1.7 卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.1.8 卵母细胞冷冻效果的评定与数据的统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 在程序冷冻中不同冷冻液对绵羊卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.2.2 不同植冰温度对绵羊卵母细胞程序化冷冻的效果 |
| 4.2.3 不同玻璃化冷冻液对绵羊卵母细胞的冷冻效果分析 |
| 4.2.4 不同发育时期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的发育能力 |
| 4.2.5 不同浓度海藻糖对卵母细胞的冷冻效果的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 卵母细胞冷冻效果的评判标准 |
| 4.3.2 不同冷冻方法对卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.3.3 不同发育时期对卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.3.4 非渗透性保护剂与渗透性保护剂配合使用对卵母细胞冷冻效果的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 不同激活方法对卵母细胞的孤雌激活效果 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.3 数据统计方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不同参数的电激活对卵母细胞孤雌激活的效果 |
| 5.2.2 绵羊精子提取物对卵母细胞的激活效果 |
| 5.2.3 不同激活方法对绵羊卵母细胞的激活效果的比较 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 不同参数的电激活对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 5.3.2 精子提取物对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 5.3.3 离子霉素的对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 绵羊体细胞核移植的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 绵羊皮肤成纤维细胞的体外分离培养 |
| 6.1.3 绵羊同种体细胞核移植 |
| 6.1.4 统计方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 培养液对原代成纤维细胞培养结果的影响 |
| 6.2.2 消化传代对细胞纯化及生长的影响 |
| 6.2.3 培养液对传代细胞培养结果的影响 |
| 6.2.4 EGF 和胰岛素对细胞生长的影响 |
| 6.2.5 冻存对皮肤成纤维细胞形态及生物学特性的影响 |
| 6.2.6 去核时间与去核率对体细胞核移植结果的影响 |
| 6.2.7 不同核移植重构胚构建方法对体细胞核移植结果的影响 |
| 6.2.8 不同供体细胞的处理方法对体细胞核移植结果的影响 |
| 6.2.9 不同激活方法对体细胞核移植效果的影响 |
| 6.2.10 成纤维细胞注核后不同间隔时间激活对移植胚发育的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的生长特性 |
| 6.3.2 核移植重构胚的构建方法对体细胞核移植效率的影响 |
| 6.3.3 不同激活方法对体细胞核移植胚胎发育的影响 |
| 6.3.4 注核后激活间隔时间对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 山羊－绵羊异种体细胞核移植的研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 山羊皮肤成纤维细胞的体外分离培养及颗粒细胞的准备 |
| 7.1.3 山羊-绵羊种间体细胞核移植 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 组织块的保存和细胞培养 |
| 7.2.2 莎能山羊皮肤细胞冻存 |
| 7.2.3 不同激活方法对山羊-绵羊异种核移植胚胎发育的影响 |
| 7.2.4 不同核移植胚构建方法对山羊-绵羊异种体细胞核移植的影响 |
| 7.2.5 供体细胞不同处理方法对核移植结果的影响 |
| 7.2.6 受体细胞冷冻对异种体细胞核移植结果的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 培养液对皮肤成纤维细胞生长的影响 |
| 7.3.2 成纤维细胞的不同处理方法对异种体细胞核移植结果的影响 |
| 7.3.3 不同类型供体细胞对异种体细胞核移植胚效率的影响 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 提高体细胞核移植胚体外发育能力的研究 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 试验材料及仪器设备 |
| 8.1.2 培养液 |
| 8.1.3 绵羊卵母细胞的采集与体外成熟 |
| 8.1.4 共培养单层细胞的制备 |
| 8.1.5 体细胞核移植胚胎的获得 |
| 8.1.6 核移植胚激活 |
| 8.1.7 胚胎的体外培养 |
| 8.1.8 试验设计及统计分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 不同培养液组合对重构胚发育的影响 |
| 8.2.2 添加孕酮对胚胎发育的影响 |
| 8.2.3 不同共培养体细胞对绵羊核移植胚胎早期发育的影响 |
| 8.2.4 不同蛋白质添加物对颗粒细胞与核移植胚共培养的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 不同培养液组合对重构胚发育的影响 |
| 8.3.2 孕酮对重构胚发育的影响 |
| 8.3.3 共培养体系对重构胚发育的影响 |
| 8.3.4 蛋白添加物对胚胎发育的影响 |
| 8.4 小结 |
| 论文总结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）体细胞核移植及线粒体命运的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 哺乳动物异种体细胞核移植的研究进展 |
| 1.1 异种核移植技术的发展史 |
| 1.1.1 自然界的种间杂交 |
| 1.1.2 低等脊椎动物的异种间核移植 |
| 1.1.3 哺乳动物的异种受精和胚胎移植 |
| 1.1.4 哺乳动物异种间的胚胎移植 |
| 1.1.5 异种胚胎细胞核移植 |
| 1.1.6 异种体细胞核移植 |
| 1.2 异种核移植的理论背景 |
| 1.3 异种核移植的研究机理 |
| 1.3.1 细胞周期 |
| 1.3.2 MPF 的调控 |
| 1.3.3 Ca~(2+)启动核的再程序化 |
| 1.3.4 线粒体问题 |
| 1.3.5 卵胞质对供体核的再程序化作用 |
| 1.3.6 DNA 甲基/去甲基化 |
| 1.3.7 X 染色体失活 |
| 1.3.8 核质运输 |
| 1.4 影响异种核移植效率的因素 |
| 1.4.1 供体细胞周期 |
| 1.4.2 不同胞质受体或核供体 |
| 1.4.3 重构胚的性别 |
| 1.5 异种核移植遗传物质的检测 |
| 1.5.1 染色体分析 |
| 1.5.2 核DNA 分析 |
| 1.5.3 线粒体DNA 分析 |
| 1.5.4 端粒DNA 分析 |
| 1.6 异种核移植技术的应用前景 |
| 1.6.1 在医学领域中的应用 |
| 1.6.2 在畜牧业生产上的应用 |
| 1.6.3 拯救濒危动物 |
| 1.7 异种核移植存在的问题和解决办法 |
| 1.7.1 存在的问题 |
| 1.7.2 解决方法 |
| 1.8 展望 |
| 第二章 哺乳动物线粒体的研究进展 |
| 2.1 动物线粒体结构和功能 |
| 2.1.1 线粒体的D-loop 结构 |
| 2.1.2 线粒体功能 |
| 2.2 MTDNA |
| 2.2.1 mtDNA 拷贝数 |
| 2.2.2 mtDNA 的复制 |
| 2.2.3 mtDNA 的转录 |
| 2.2.4 线粒体蛋白质基因的翻译 |
| 2.3 线粒体基因与核基因相互作用 |
| 2.4 动物线粒体遗传学特点 |
| 2.4.1 母性遗传 |
| 2.4.2 父性遗传 |
| 2.5 核移植中线粒体的命运 |
| 2.5.1 胚胎细胞核移植中线粒体的命运 |
| 2.5.2 同种体细胞核移植中线粒体的命运 |
| 2.5.3 异种核移植中线粒体的命运 |
| 2.6 线粒体的分布与功能的关系 |
| 2.7 线粒体移植 |
| 2.8 研究前景 |
| 第三章 牛、绵羊MTDNA RQ-PCR 检测标准的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒和菌种 |
| 3.1.2 试剂和仪器 |
| 3.1.3 PCR 模板的制备 |
| 3.1.4 特异性引物设计 |
| 3.1.5 PCR 扩增 |
| 3.1.6 目的片段的克隆、鉴定 |
| 3.1.7 荧光定量PCR |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 特异性引物扩增结果 |
| 3.2.2 转化后鉴定结果 |
| 3.2.3 OD 值测定及质粒浓度换算 |
| 3.2.4 荧光定量PCR 扩增后标准曲线的形成 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 牛卵母细胞内线粒体的量与质量的关系 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 卵母细胞的采集与培养 |
| 4.1.4 牛mtDNA 定量PCR 标准曲线的制备 |
| 4.1.5 孤雌激活 |
| 4.1.6 模板的制备 |
| 4.1.7 mtDNA 定量PCR |
| 4.1.8 数据统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 mtDNA 定量 |
| 4.2.2 孤雌激活胚胎的发育 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 线粒体移植对牛孤雌胚和ICSI 胚发育的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 卵母细胞的采集 |
| 5.1.3 显微注射用玻璃针的制备 |
| 5.1.4 线粒体分离 |
| 5.1.5 线粒体染色 |
| 5.1.6 线粒体移植和ICSI |
| 5.1.7 线粒体移植和孤雌激活 |
| 5.1.8 胚胎培养和囊胚细胞计数 |
| 5.1.9 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 线粒体注射对ICSI 胚的影响 |
| 5.2.2 线粒体注射对孤雌激活胚的影响 |
| 5.2.3 胚胎发育过程中线粒体荧光变化 |
| 5.2.4 囊胚细胞数 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛体细胞核移植胚中线粒体命运 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂与材料 |
| 6.1.2 卵母细胞培养 |
| 6.1.3 供体细胞的准备 |
| 6.1.4 核移植和胚胎培养 |
| 6.1.5 统计分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 供体细胞培养 |
| 6.2.2 供体细胞类型对核移植胚的影响 |
| 6.2.3 荧光探针对胚胎发育的影响 |
| 6.2.4 荧光探针的检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 牛-绵羊异种核移植早期胚胎的发育 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试剂与仪器 |
| 7.1.2 绵羊胎儿成纤维细胞培养 |
| 7.1.3 卵母细胞成熟培养 |
| 7.1.4 核移植和胚胎培养 |
| 7.1.5 胚胎质量分析 |
| 7.1.6 染色体分析 |
| 7.1.7 统计分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 胚胎发育潜力 |
| 7.2.2 胚胎形态学特点 |
| 7.2.3 染色体数目 |
| 7.2.4 囊胚细胞数 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 牛-绵羊异种核移植胚中线粒体的命运 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料与试剂 |
| 8.1.2 核移植 |
| 8.1.3 牛、绵羊特异性引物设计和RQ-PCR 标准品制备 |
| 8.1.4 分离卵裂球 |
| 8.1.5 mtDNA 模板的制备 |
| 8.1.6 RQ-PCR 分析 |
| 8.1.7 统计分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 两种线粒体的分配 |
| 8.2.2 同一胚胎中mtDNA 的变化 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、核移植前激活牛受体卵子对供体核形态变化的影响（论文参考文献）
- [1]核质相互作用对供体核重编程的影响[D]. 唐爽. 西北农林科技大学, 2010(10)
- [2]牛卵母细胞成熟前基因注射的研究[D]. 隋进强. 西北农林科技大学, 2009(S2)
- [3]猪体细胞核移植相关技术研究[D]. 黄雅琼. 广西大学, 2008(12)
- [4]提高牛体细胞核移植效率的研究[D]. 彭新荣. 西北农林科技大学, 2008(11)
- [5]牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究[D]. 丁向彬. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [6]Figla和BDNF对猪和牛卵母细胞及早期胚胎生长发育的影响[D]. 易康乐. 吉林大学, 2008(11)
- [7]人—山羊异质胚胎构建及胚胎干细胞的分离培养[D]. 张玉玲. 西北农林科技大学, 2008(11)
- [8]牛体细胞核移植的研究[D]. 黄伟伟. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [9]提高绵羊体细胞核移植效率的研究[D]. 赛务加甫. 西北农林科技大学, 2007(01)
- [10]体细胞核移植及线粒体命运的研究[D]. 华松. 西北农林科技大学, 2007(06)