高产洛蒙真菌素的洛蒙德链霉菌的高通量筛选方法建立、复合诱变育种及基因工程改造

论文摘要

洛蒙德链霉菌S015（Streptomyces lomondensis S015）能够生物合成吩嗪类化合物洛蒙真菌素（Lomofungin）。而洛蒙真菌素是一种广谱抗生素,能够抗细菌、真菌及肿瘤,因此在很多领域都有其应用价值。由于S015菌株的洛蒙真菌素产量较低,难以满足研究和生产的要求,因此本论文从S015菌株出发,通过建立高通量筛选方法,复合诱变筛选及基因工程改造来构建其高产菌株。本论文根据洛蒙真菌素的2-丁酮溶液在紫外波长375 nm处有一个特征吸收峰的现象,确定了375 nm是能用来检测酸性的2-丁酮溶液中的洛蒙真菌素的一个特征波长。并且验证了溶液中洛蒙真菌素浓度和其A375值呈良好的正相关关系。所以将洛蒙德链霉菌的发酵液通过2-丁酮萃取等处理后的上层有机相的A375值作为快速判断其洛蒙真菌素含量的标志,同时结合利用24孔深孔板培养和酶标仪能同时对大量样本进行分析检测的优点,成功建立了高通量筛选高产洛蒙真菌素菌株的方法。随后利用该高通量筛选方法,从S015菌株出发,进行了6轮ARTP和紫外诱变交替的复合诱变育种,累计筛选了4,320株突变株,最终获得了高产菌株M6,其洛蒙真菌素产量为61.33 mg/L,是出发菌株S015的7.35倍,并且具有良好的遗传稳定性。将M6菌株与出发菌株S015进行对比,虽然两者在菌落形态上没有明显差异,但是M6菌株的细胞生长更为旺盛。在摇瓶发酵的过程中,M6菌株的细胞干重最大可达12.49 g/L,是S015菌株的2.21倍。获得高产菌M6后,将其洛蒙真菌素的前体分支酸的消耗途径中的trpE1、trpE2基因进行双敲除,洛蒙真菌素产量提升为81.89mg/L。在M6ΔtrpE1ΔtrpE2的基础上,过表达了全局调控基因afsR,使产量达到109.53 mg/L,比双敲株提升了33.75%,是野生型S015的13.13倍。之后还分别过表达了与洛蒙真菌素的前体分支酸的合成途径相关的8个基因,并对其中的aroB1、aroB2、aroK1和aroK2基因进行了组合过表达,但对产量的提升效果都不明显。最后,针对M6ΔtrpE1ΔtrpE2::afsR菌株,将其培养基中麦芽提取物浓度优化为14 g/L,并添加大豆油至1.5%,添加Fe3+离子至0.08 mmol/L,使其洛蒙真菌素最终产量为212.68 mg/L,是野生型S015菌株产量的25.50倍。本论文将突变菌株高通量筛选方法建立和不同诱变育种手段复合及基因工程改造相结合来提高目标产物产量,取得了良好的高产菌株筛选效果,可为其他抗生素及次级代谢产物的生产菌株筛选提供良好的借鉴。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 传统诱变育种

1.1.1 物理诱变

1.1.2 化学诱变

1.1.3 生物诱变

1.2 新型诱变育种

1.2.1 ARTP诱变育种

1.2.2 微波诱变育种

1.2.3 超高压诱变育种

1.2.4 复合诱变育种

1.3 高通量筛选方法

1.4 吩嗪类化合物

1.5 天然吩嗪类化合物的生物合成

1.5.1 吩嗪合成前体合成途径——莽草酸途径

1.5.2 吩嗪合成途径

1.6 洛蒙德链霉菌和洛蒙真菌素

1.6.1 洛蒙德链霉菌

1.6.2 洛蒙真菌素的合成途径

1.7 本研究的目的、内容和意义

第二章高产洛蒙真菌素的洛蒙德链霉菌的高通量筛选方法的建立

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 培养基

2.2.2 菌株及培养条件

2.2.3 试剂和仪器

2.3 实验方法

2.3.1 高通量筛选及验证方法

2.3.2 洛蒙真菌素产量测定

2.4 结果与讨论

2.4.1 洛蒙真菌素浓度与A375的关系

2.4.2 运用A375建立高通量筛选方法

2.4.3 检验并对比分析所建立的筛选方法

2.5 本章小结

第三章高产洛蒙真菌素的洛蒙德链霉菌的复合诱变育种

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 培养基

3.2.2 试剂和仪器

3.2.3 菌株

3.3 实验方法

3.3.1 ARTP诱变及筛选

3.3.2 紫外诱变及筛选

3.3.3 洛蒙真菌素产量测定

3.3.4 菌株干重测定

3.4 结果与讨论

3.4.1 致死率曲线

3.4.2 ARTP和紫外复合诱变及高通量筛选

3.5 菌株稳定性检验

3.6 菌落形态对比

3.7 细胞生长对比

3.8 本章小结

第四章高产洛蒙真菌素的洛蒙德链霉菌的基因工程改造

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 培养基及培养条件

4.2.2 试剂和仪器

4.2.3 菌株、质粒和引物

4.3 实验方法

4.3.1 质粒提取

4.3.2 基因组提取

4.3.3 PCR扩增、验证目的片段

4.3.4 DNA片段回收

4.3.5 双酶切DNA片段与载体、连接

4.3.6 菌株的保存

4.3.7 ET12567 感受态细胞的制备

4.3.8 基因缺失菌株构建

4.3.9 基因过表达菌株构建

4.4 结果与讨论

4.4.1 高产菌株M6中trpE1、trpE2 基因的敲除

4.4.2 trpE1、trpE2 基因的敲除对M6 菌株洛蒙真菌素产量的影响

4.4.3 过表达全局调控基因afsR对 M6 菌株洛蒙真菌素产量的影响

4.4.4 cutR和 cutS基因的敲除

4.4.5 cutR和 cutS双组分调控系统对M6 菌株洛蒙真菌素产量的影响

4.4.6 分支酸合成途径中aroA、aroB、aroC和 aroK基因的过表达

4.4.7 过表达aroA、aroB、aroC和 aroK基因对M6 菌株洛蒙真菌素的影响

4.4.8 组合过表达aroB1、aroB2、aroK1和aroK2 基因对M6 菌株产量的影响

4.4.9 培养基优化对M6ΔtrpE1ΔtrpE2::afsR菌株洛蒙真菌素产量的影响

4.4.10 培养基的正交实验优化

4.5 本章小结

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

附录1 本研究中所用试剂

附录2 本研究中所用仪器

附录3 本研究中相关基因序列

1 )洛蒙德链霉菌S015的trpE1 基因（1251 bp）:

2 )洛蒙德链霉菌S015的trpE2 基因（1482 bp）:

3 )洛蒙德链霉菌S015的aroA1 基因（816 bp）:

4 )洛蒙德链霉菌S015的aroA2 基因（1317 bp）:

5 )洛蒙德链霉菌S015的aroB1 基因（1080 bp）:

6 )洛蒙德链霉菌S015的aroB2 基因（1020 bp）:

7 )洛蒙德链霉菌S015的aroC1 基因（1134 bp）:

8 )洛蒙德链霉菌S015的aroC2 基因（1185 bp）:

9 )洛蒙德链霉菌S015的aroK1 基因（603 bp）:

10 )洛蒙德链霉菌S015的aroK2 基因（477 bp）:

致谢

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 金鸣

导师: 张雪洪

关键词: 洛蒙德链霉菌,洛蒙真菌素,高通量筛选,复合诱变,基因工程

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学,生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q78;Q933

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002854

总页数: 85

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