敲除CnAβ基因对大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒的影响研究

论文摘要

本课题利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,敲除大鼠RBL-2H3细胞CnAβ基因以构建基因敲除细胞突变株,并探讨CnAβ基因对体外RBL-2H3细胞活化脱颗粒的影响。设计三个单向导RNA（single guide RNA,sgRNA）,靶向CnAβ基因的外显子1。以pX459质粒为骨架构建表达sgRNA的打靶载体。用脂质体3000转染法将构建好的质粒导入大鼠RBL-2H3细胞中,实现基因敲除。在嘌呤霉素筛选后,利用PCR扩增并测序初步检测靶基因的敲除情况。PCR验证3种细胞（成功敲除的细胞KO,空载体细胞MOCK,野生细胞WT）的转录情况;甲苯胺蓝染色检测大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒后的形态变化;WST-1法测定细胞活力及毒性作用;IgE刺激后检测诱导剂（DNP-BSA,C48/80,LPS）的最佳诱导时间和剂量及细胞的脱颗粒情况。研究获得具体结果如下:1.利用CRISPR/Cas9技术,大鼠RBL-2H3细胞CnAβ基因被成功敲除,通过PCR扩增检测到完整敲除外显子1附近381 bp（exon1整个敲除）。2.PCR扩增3种细胞后,凝胶电泳显示敲除成功的细胞无特异性条带,表明敲除CnAβ基因后无法在转录水平检测。3.3种细胞在A23187诱导脱颗粒后经甲苯胺蓝试剂染色于40倍油镜下观察其状态。当细胞脱颗粒完成后,细胞被染成浅蓝色,细胞整体变大,细胞膜边缘不整齐,胞质中有明显的颗粒,同时存在空泡结构。4.在培养基与WST-1为10:1的比例下培养3种细胞5天后,测定其生长曲线显示细胞在第一天处于对数生长期,其后便处于平稳期,且3种细胞生长趋势无差异,即敲除CnAβ基因对细胞生长无影响。5.WST-1毒性实验结果显示细胞生长趋势无差异,即敲除CnAβ基因对细胞生长无毒性作用。6.C48/80的最佳诱导浓度是100μg/ml,DNP-BSA的最佳诱导浓度是10μg/ml,而LPS的最佳诱导浓度是1μg/ml,三者的最佳诱导时间都是1 h。相比之下,DNP和C48/80诱导脱颗粒能力相当,LPS则较弱,但在敲除CnAβ基因后都明显降低了细胞的脱颗粒情况。综上所述,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除了大鼠RBL-2H3细胞CnAβ基因建立了细胞突变株。肥大细胞经刺激脱颗粒后变大变圆,染色变浅且有空泡结构出现。3种诱导剂（C48/80、DNP、LPS）诱导细胞脱颗粒的最佳浓度分别是100μg/ml,10μg/ml,和1μg/ml,最佳诱导时间是1 h。敲除CnAβ基因后都明显降低细胞脱颗粒的情况,但对细胞生长无影响。

论文目录

摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 过敏反应

1.1.1 过敏反应的概述

1.1.2 Ⅰ型过敏反应的效应细胞

1.1.3 Ⅰ型过敏反应的体外筛选指标

1.1.3.1 Ig E/FcεRI信号通路的交联

1.1.3.2 钙离子通道

1.1.3.3 脱颗粒介质

1.2 RBL-2H3细胞

1.3 钙调磷酸酶（CaN）

1.3.1 CaN的结构

1.3.2 CaN在组织中的分布及其功能

1.4 基因编辑技术

1.4.1 锌指核酶（ZFNs）

1.4.2 转录激活效应因子-TALENs

1.4.3 成簇的、规律间隔的短路回文重复序列CRISPR/Cas9

1.5 本论文的研究内容、目的及意义

1.5.1 研究内容

1.5.2 技术路线

1.5.3 研究目的及意义

第2章基因敲除细胞突变株的建立

2.1 实验材料

2.1.1 实验所用细胞来源

2.1.2 实验所用主要仪器

2.1.3 实验所用试剂耗材

2.1.4 实验所用引物序列

2.1.5 实验用培养基及主要试剂的配置

2.2 实验方法

2.2.1 RBL-2H3细胞的培养及传代，复苏，冻存

2.2.1.1 细胞的培养及传代

2.2.1.2 细胞冻存

2.2.1.3 细胞复苏

2.2.2 pCas9/gRNA的设计

2.2.3 pCas9/gRNA-CnAβ 载体构建

2.2.3.1 复苏PX459并提质粒

2.2.3.2 酶切实验

2.2.3.3 切胶回收实验

2.2.3.4 双链寡核苷酸合成

2.2.3.5 连接反应

2.2.3.6 转化大肠杆菌DH5α

2.2.3.7 载体测序验证

2.2.4 嘌呤霉素预实验确定药筛阳性克隆的终浓度

2.2.5 脂质体3000构建稳定细胞系

2.2.5.1 构建稳定细胞系并药筛出阳性单克隆

2.2.5.2 阳性单克隆细胞的检测

2.3 实验结果

2.3.1 酶切结果

2.3.2 热激法转化大肠杆菌DH5α

2.3.3 酶切验证

2.3.4 测序后电泳验证（阳性质粒提取）

2.3.5 阳性单克隆细胞检测

2.3.6 阳性单克隆序列比对

2.4 分析与讨论

2.5 小结

第3章 CnAβ 与细胞脱颗粒的关系

3.1 实验材料

3.1.0 PCR验证3种细胞的转录情况

3.1.0.1 Trizol提RNA并测定浓度

3.1.0.2 反转录cDNA

3.1.0.3 RT-PCR扩增

3.1.0.4 凝胶电泳检测其表达

3.1.1 实验所用主要仪器

3.1.2 实验所用试剂耗材

3.1.3 实验所用引物序列

3.1.4 实验用主要试剂的配置

3.2 实验方法

3.2.2 甲苯胺蓝染色

3.2.3 细胞活力测定

3.2.4 WST-1 检测细胞毒性

3.2.5 细胞脱颗粒情况

3.2.6 统计学方法

3.3 实验结果

3.3.1 转录结果

3.3.2 染色结果

3.3.3 细胞活力

3.3.4 细胞毒性

3.3.5 细胞脱颗粒

3.3.5.1 不同时间和浓度的C48/80 诱导3种细胞脱颗粒情况

3.3.5.2 不同时间和浓度的DNP-BSA诱导3种细胞脱颗粒情况

3.3.5.3 不同时间和浓度的LPS诱导3种细胞脱颗粒情况

3.4 分析与讨论

3.5 小结

第4章结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

4.2.1 CnAβ 对肥大细胞内炎症因子产生与分泌的影响研究

4.2.2 CnAβ 对肥大细胞内信号调节的影响研究

4.2.3 体外过敏反应研究

参考文献

致谢

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘洁

导师: 吴正理,李艳红

关键词: 肥大细胞,细胞,技术,基因,基因敲除,脱颗粒

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q78

总页数: 71

文件大小: 2746K

下载量: 46

敲除CnAβ基因对大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒的影响研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢