朱怡玲[1]2003年在《变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组、蛋白质组的比较》文中进行了进一步梳理氟化物防龋已有很长的历史，由于含氟牙膏的推广以及广泛而正确的使用，在近20年中，龋病在许多国家得到了明显的控制，各个年龄组龋病率下降，并在全球范围内同一时期发生，这一现象被认为主要是氟化物作用的结果。氟化物防龋的系统作用主要表现在能够影响牙釉质的性质和结构，产生耐酸的表面以及对致龋菌的抑制作用，作为牙菌斑的组成部分，抑制菌斑细菌的生长代谢，增强牙齿再矿化并抑制脱矿。但是，氟化物长期广泛应用可能导致耐氟菌株的产生。Brown等在1983年从每日应用1％NaF凝胶的口腔干燥症患者的牙菌斑中最早发现耐氟变形链球菌，从此引起学者们对变形链球菌耐氟菌株的研究。随后，耐氟菌株无论从体内或体外两种途径均可获得。研究证实，牙菌斑中经常暴露于氟环境的变形链球菌所产生对氟的适应性必然降低局部用氟所产生的抑龋效果，耐氟菌株较亲代野生菌株有更强的氟耐受力。耐氟菌株与亲代菌株对牙齿具有相同的粘附能力和脱矿能力，而且，在有氟化物存在的菌斑中，耐氟菌株产酸、耐酸能力大于亲代野生株，具有更强的致龋性。但是，关于耐氟菌株产生的机理，至今还处于推测阶段。本研究通过体外诱导产生耐氟菌株，利用SDS-PAGE、REA、AP-PCR技术，了解各菌种间基因型的分布，判定变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后，其 第四军医大学硕士学位论文因组、蛋白质组是否发生改变，为揭示耐氟菌株产生的机理及临床合理用氟提供实验依据。本研究分为叁个部分：第一部分：变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株的诱导 通过采用梯度增加 NaF浓度的方法体外诱导变形链球菌、远缘链球菌自发产生耐氟菌株门叫／ml，以 50 pg／ml递增），获得的耐氟菌株不仅能在无氟的培养基中稳定传代培养，而且重新转种至含有 1000pg／ml NaF的 TSA培养基中，仍可稳定生长。为进一步研究耐氟菌株的突变机理，提供了可靠的实验模型。第二部分：变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组、蛋臼质组 的比较 1．利用AP－PCR技术，从分子生物学水平上对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的基因组进行比较，判定变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后，其遗传型是否发生显着改变。结果显示，变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的DNA扩增条带几乎完全不同，耐氟菌株IngbrittfR ／f约2500hp、850hp、650hp缺少叁条扩增带，在约1000hp、550hp新增两条扩增带；175fR在850hp、450hp新增两条带，在约400hp 缺少一条带；6715于R则在约400hp、200hp新生两条带，指纹图谱与亲代菌株存在明显差异，说明耐氟菌株的基囚组己发生改变。 2．通过REA分析，将变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株的DNA用限制性核酸内切酶切割后，经琼脂糖凝胶电泳，可获得其独特的特征性“基因组指纹”图谱，比较这些有差异的特征性“基因组指纹”图谱，进一步说明变形链球茵、远缘链球菌及耐氟菌株基因组的差异。结果显示，变形链球菌、远缘链球菌耐氟突变后，基因组DNA酶切位点大小、数量及分布都发生改变，亲代菌株与耐氟菌株基因组DNA有明显差异。 3 第四军医大学硕士学位论文 3．细菌作为一个能独立进行新陈代谢的生命单位，必然含有大量各种各样的蛋白质，这些蛋白质参与了细菌的备种生命活动，也构成细菌的各种特征信息，故对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株可溶性蛋白、不可溶性蛋白进行SDS．PAGE分析，可了解细菌耐氟突变后是否具有遗传性的变异。结果显示，电泳图谱可分辨出的蛋白区带各不相同，耐氟菌株的蛋白区带中有些部位出现新生带，而有些部位则缺失，蛋白表达量上与亲代菌株也有差别，有些部位表达的蛋白量多，有些部位则少，蛋白组成上有显着差异。 以上实验结果进一步说明，耐氟菌株己具有自身的遗传特性，某些染色体DNA组型、IgG含量、同功酶、生化基因位点多态性等多方面可能都有其自身的特点，与亲代菌株相比，有明显的差异。通过这一结果，为在分于水乎上探索耐氟菌株突变机理提供了重要依据第叁部分：洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株生长抑制 的测定 耐氟菌株的出现，为氟化物防龋提出新的问题。本实验通过洗必泰对变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株生长抑制测定，以寻求一种新的防龋理念及防龋途径。本研究将醋酸洗必泰液稀释成不同的浓度，分别加入四种细菌的菌悬液，最后测得每一菌株的最低抑菌浓度（＊仁）、最低杀砍浓度（MB C），探讨洗必泰对耐氟菌株是否具有抑菌、杀菌作用。实验结果显示，洗必泰浓度在350叱／L时，对变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株均有明显的抑制作用，在400屹／L时，能完全杀灭变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株，提示洗必泰可有效抑制变形链球菌、远缘链球菌及耐氟菌株生长。
丁春燕[2]2006年在《变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的基因组比较》文中进行了进一步梳理目的:氟化物防龋已有很长的历史,长期局部高浓度氟化物的使用,可导致耐氟菌株选择性的生长。耐氟菌株的出现,给氟化物防龋提出了新的问题,如何避免耐氟菌株的出现而又能充分发挥氟化物的防龋作用,探讨耐氟菌株的耐氟机理便显得极为重要。本实验运用分子生物学技术对变形链球菌耐氟菌株与亲代株的基因组、蛋白组进行比较,判定变形链球菌耐氟突变后,其遗传型是否发生显着性改变。变形链球菌的致龋能力主要是它具有产酸和耐酸两大特性,而这种耐酸能力主要通过细菌的F-ATPase得以实现。通过测定并比较变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株的F-ATPase的活性,并进一步对其基因组进行比较,探讨耐氟菌株耐酸性提高的原因。为进一步研究其基因改变的具体部位及耐氟机理提供理论依据,为研究变形链球菌耐氟菌株耐酸性的增强机制奠定基础。 方法:1 提取变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的整体基因组,运用AP-PCR技术对其DNA进行对比研究;2 提取变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的可溶性蛋白组和不可溶性蛋白组,运用SDS-PAGE技术进行对比研究;3 将变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株通过甲苯处理,2个循环的液氮冷冻和解冻,制备透性细胞。将透性细胞悬液加入测试缓冲液中,测定不同时间段样品中水解ATP所释出的无机磷量来评价其膜上的ATPase活性高低;4 自行设计F-ATPase区域的引物,用PCR法对变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株F-ATPase的基因组进行比较研究。 结果:1 运用AP-PCR技术对变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的全菌DNA进行扩增,得出的条带不完全相同;2运用SDS-PAGE技术对变形链球菌耐氟菌株
殷晓萍[3]2004年在《变形链球菌基因型耐氟菌株体外诱导及其质子移位膜ATP酶活性研究》文中提出氟化物应用于龋病防治已有半个多世纪的历史，长期广泛使用氟制剂可导致耐氟菌株的产生。耐氟菌株具有比野生株更强的耐氟性，可以在高于自身耐氟水平的氟化物环境中生长。目前分为表型和基因型两种。基因型耐氟菌株因有稳定的高耐氟性，氟化物不能完全抑制其生长。基因型耐氟菌株一旦在牙菌斑中大量繁殖，其致龋能力将对牙菌斑的致龋性产生决定性作用。变形链球菌作为龋病的主要致病菌，其发生耐氟突变后的致龋毒力在国外愈来愈受到人们的关注，但在国内这方面的研究较少。 首先，本研究在国内首次采用直接诱导法在体外诱导分离变形链球菌基因型耐氟菌株，并与逐步诱导法进行了比较，还对所得耐氟菌株的生物学特性进行了初步探索。结果显示直接诱导法和逐步诱导法所获得的耐氟菌株均可稳定传代，为基因型耐氟菌株，且都有较高的耐氟水平(≥1000mg／LNaF)，都可将培养基的pH值降至5.5以下。虽然逐步诱导法的分离率要高于直接诱导法分离率十几倍，但是后者所得的耐氟菌株更接近于体内突变株自发产生的过程，其分离频率更能反映体内自发突变的频率，更具研究价值。 为了解变形链球菌耐氟菌株超微结构是否发生改变以及氟化物对细菌结构的影响，本研究使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对变形链球菌耐氟菌株和亲代野生株的超微结构进行了观察和比较。发现随着氟浓度增加，变形链球菌链变短，消失，细菌细胞壁降解，菌体溶胀变大，胞膜破裂胞质内容降解，核物质消失；氟浓度越大，细菌损伤越严重。耐氟菌株也有类似的变化规律，但变化程度轻于亲代株，在5mmol／L NaF作用下仍可见正常状态的细菌，而亲代株几乎无正常结构的细菌存在。变形链球菌发生耐氟突变后超微结构发生改变，体积变大及解链活动加强。 本研究测定氟化物和pH值对诱导的变形链球菌耐氟菌株(基因型)质子天津医科大学硕士学位论文移位ATP酶活性的影响，并和亲代野生株进行比较。结果表明在pH值为5.0、6.0、7.0时，氟化物对耐氟菌株和亲代野生株的质子移位ATP酶活性均有影响。但是pH值为5.0、6.0、7.0的含氟缓冲液中，耐氟菌株的质子移位ATP酶活性显着大于亲代野生株的质子移位AI，P酶活性。氟化物对耐氟菌株抑制作用显着小于亲代株野生株。 综上所述，逐步诱导法和直接诱导法均可用于诱导变形链球菌耐氟菌株。变形链球菌发生耐氟突变后超微结构有所变化。从结果可看出耐氟菌株不但具有致龋力而且致龋力大于亲代野生株，氟化物不能有效抑制耐氟菌株的生长。
赵洪岩[4]2011年在《采用非标记定量技术对变形链球菌耐氟菌株的差异蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理龋病是牙体硬组织的细菌感染性疾病,是最常见的口腔疾病,变形链球菌是其主要致病菌。氟化物作为目前使用最广泛的防龋制剂,对致龋菌的作用为氟防龋的重要机制之一。近年来,为提高并维持菌斑内较高氟水平,局部应用氟化物的浓度增加,间隔时间缩短,最可能的后果是耐氟菌株的产生。有报道国外学者从应用高浓度氟化钠凝胶防治猛性龋的患者口腔中分离出变形链球耐氟菌株；之后,又有学者从干燥症病人口腔中分离出变形链球菌耐氟菌株,这提示某些特殊人群的口腔中存在变形链球菌耐氟菌株。变形链球菌耐氟菌株产酸能力和耐酸性增强,致龋性较亲代菌株增强,并且耐氟菌株的基因组和蛋白质组均发生改变,但具体基因和蛋白还不能确定。虽然在正常人口腔中尚未分离出变形链球菌耐氟菌株,但氟化物的持续作用,体外耐氟菌株的诱导成功,都提示正常人群中亦可能产生耐氟菌株。耐氟菌株的出现,为氟化物防龋提出了新的问题,受到了国内外学者的密切关注,因而研究其发生、发展因素,对临床上合理应用氟化物及寻找新的防龋药物具有重要意义。本课题组的前期研究发现,变形链球菌耐氟菌株的ffh、dgk和dltc等耐酸相关基因较亲代菌株有不同程度的突变,但对耐酸相关基因编码蛋白的研究还比较缺乏。已有研究表明,仅有约2%的疾病与基因序列有关,而98%的疾病与蛋白表达密切相关。基因是遗传信息的携带者,而执行这些信息所蕴藏的生物学功能的是蛋白质,基因的表达产物蛋白质是生理功能的执行者,我们对蛋白质的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。发挥生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的,并不象基因组那样基本固定不变。同一细胞、同一组织、同一器官在不同的生理条件和不同的外界环境影响下,蛋白质的存在状态并不完全相同；病理状态下的细胞蛋白质组与正常生理条件下的也有所不同,这就需要通过差异蛋白质组学技术来进行研究。差异蛋白质组学是针对不同空间、不同时间上动态变化着的蛋白质组的整体进行比较,分析不同蛋白质组之间蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异,研究差异蛋白质及其功能。由于蛋白质自身具有的多样性、可变性和构象的复杂性等特点,使得蛋白质研究技术难度非常大,蛋白质组学研究能否成功,相当程度上取决于其技术水平的高低。差异蛋白质组学并不要求鉴定“全部”蛋白,而主要是找出有意义的差异蛋白,所以在技术上相对容易实现。对蛋白质在不同状态,不同环境,不同处理等情况下表达量的变化进行检测,这就需要用到蛋白质组学的定量技术。定量技术是整个蛋白质组学的精华部分,这种定量通常不必检测蛋白质在细胞内的绝对含量,而只需对其相对含量进行定量即可。定量蛋白质组学是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系内所有的蛋白质进行精确定量和鉴定的一门学科,这标志着蛋白质组学研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展。蛋白质组学研究中应用的定量方法主要有两种,一种是基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量,另外一种是基于质谱检测技术的定量,包括标记定量技术(Labeling quantitation)和非标记定量技术(Label-free quantitation)两种。基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量,此方法由于双向凝胶电泳本身的限制,不能对蛋白质实现绝对分离,不能有效检测出具有极端等电点的、分子质量太大和太小的蛋白质以及低丰度的蛋白质和膜蛋白,因而逐渐有被基于质谱的蛋白质组学非标记定量技术代替的趋势。从原理上看,标记定量技术的主要策略是对要比较的样本的蛋白质或者肽段分别进行轻和重的稳定同位素标记,从而使他们的分子量具有一定的差异,酶解后的肽段同时进行质谱分析,根据质谱上成对出现的轻重同位素峰的强度进行相对定量。非标记定量技术,未对研究样本进行标记,样本酶解产物分别进行质谱分析,然后根据峰面积或者肽段总次数对肽段和蛋白质进行相对定量。非标记定量技术(Label-free quantitation)不需要昂贵的同位素标签做内部标准,实验耗费低；对样本的操作也最少,从而使其最接近原始状态；并且不受样品条件的限制,克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷,因此它在定量蛋白质组学研究中受到了众多科学工作者的推崇,得到了越来越广泛的应用。目前,已经有一系列配套的非标记定量分析软件,其中包括本研究采用的GE公司开发的DeCyder MSTM,具有很好的定量准确性和可信性。DeCyder MSTM软件对液相色谱串联质谱数据非标记定量分析是将质谱数据由谱峰形式转化为直观的类似双向凝胶的图谱,谱图上每一个点代表一个肽段,而不是蛋白质；再比较不同样本上相应肽段的强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。本研究通过基于质谱的蛋白质组学非标记定量技术,利用液相色谱串联质谱和GE公司开发的DeCyder MSTM软件分析联用研究变形链球菌(UA159)耐氟菌株及其亲代菌株的蛋白质表达差异,发现并鉴定了明显差异蛋白67种,蛋白表达上调的为24种,蛋白表达下调的有43种。这些明显差异蛋白包括部分致龋毒力因子,其中与粘附有关的2种,为葡萄糖基转移酶和细胞表面粘附素PAC；与产酸相关的一种,为乳酸脱氢酶；与耐酸相关的4种,为F-ATP酶β-亚单位、信号识别颗粒蛋白质亚单位Ffh、分子伴侣DnaK和伴侣蛋白GroEL。同时应用GO (Gene Ontology)工具对差异蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞定位分析,并构建了变形链球菌耐氟菌株和其亲代菌株的差异蛋白质数据库。本研究的创新性体现在,首次应用蛋白质组学非标记定量技术对变形链球菌(UA159)耐氟菌株及其亲代菌株进行差异蛋白质组学研究,利用GE公司开发的DeCyder MSTM软件,并结合NCBI链球菌蛋白数据库,发现并鉴定了明显差异蛋白67种。同时构建了变形链球菌耐氟菌株和其亲代菌株的差异蛋白质数据库,为以后进一步研究变形链球菌和变形链球菌耐氟菌株致龋毒力因子相关基因及其编码的蛋白的功能打下基础。
胡利杰[5]2007年在《甘草、匙羮藤提取物对变异链球菌作用的初步研究》文中研究指明龋病是人类口腔的常见病、多发病，世界卫生组织已经把龋病列为人类重点防治的叁大非传染性疾病之一。变异链球菌是口腔中的常驻菌之一，同时也是龋病的主要病原菌。近年研究发现，某些中药如蜂房、五倍子等也具有抑制变异链球菌生长和产酸的能力，具有与化学制剂洗必泰、氟化钠相似的抗龋作用。甘草和匙羹藤在我国的中药研究中一直被认为具有抗菌、消炎的作用，但目前尚未见应用于口腔疾病治疗的报道。本研究拟通过细菌体外药物敏感实验，初步探讨甘草和匙羹藤提取物对变异链球菌生长和产酸的影响，同时以氟化物作为研究的对照药物，为进一步研究甘草和匙羹藤在口腔疾病治疗中的作用奠定基础。实验结果表明，甘草和匙羹藤提取物对变异链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.625％、2.5％；甘草提取物对变异链球菌的最小杀菌浓度(MBC)为10％，本实验未得出匙羹藤提取物的MBC。甘草和匙羹藤提取物对变异链球菌生长和产酸的抑制作用具有一定的剂量—效应关系。当甘草提取物浓度≤0.25％，匙羹藤提取物浓度≤1.25％时，它们对变异链球菌的生长和产酸均无明显的抑制作用，浓度为2.5％的匙羹藤提取物对变异链球菌的产酸亦无明显抑制作用。当甘草提取物浓度≥0.5％，匙羹藤提取物浓度≥2.5％时，在药物作用的最初32h内，对变异链球菌的生长有明显的抑制作用，但32h后，它们的抑制作用出现减弱的趋势。当甘草提取物浓度为0.5％和1％、匙羹藤提取物浓度为5％和10％时，在药物作用的最初32h内，对变异链球菌的产酸有明显的抑制作用，32h后，它们的抑制作用逐渐呈现减弱的趋势；2.5％的甘草提取物环境中，变异链球菌的产酸过程几乎被中止。综上所述，甘草和匙羹藤提取物对变异链球菌生长和产酸均有一定程度的抑制作用，尤其是在药物作用的最初32h内。虽然甘草和匙羹藤提取物对变异链球菌产生抑制作用的药物浓度相对较高，但因其具有副反应少，对机体不良作用小，以及不易产生抗药菌株等优点，因此，甘草和匙羹藤所表现出的抗龋活性仍具有进一步研究的价值和很好的应用前景。
方会清[6]2006年在《老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌临床分离株致龋性的研究》文中研究说明龋病是一种多种因素引起的细菌感染性疾病，变形链球菌是主要致龋菌。老年人由于免疫能力下降、唾液分泌减少等原因，易患龋病，龋病已成为老年人最常见的口腔疾病。 变形链球菌与致龋相关的主要作用：产酸、耐酸和黏附。其中产酸、耐酸性是其致龋的直接原因。而黏附于牙面是其致龋的必要步骤。变形链球菌通过合成胞外多糖(包括水溶性和水不溶性胞外多糖)来促进其黏附。水溶性胞外多糖在致龋中的主要作用是作为细菌胞外能源贮库及底物，而水不溶性胞外多糖则具有很强的黏性，在细菌黏附过程中起着重要作用。我国已进入老龄化社会，并且老龄人口以每年3％的速度增加，老年人龋病的防治日趋严峻，然而目前获得的变形链球菌遗传学和流行病学分布信息尚不能很好地说明其在老年人高龋患者菌斑中的致龋特点。 本课题通过收集老年人牙菌斑变形链球菌临床分离株，进行血清型、遗传型分析；体外培养分析其代谢产酸和在酸性条件下耐酸生存能力、合成胞外多糖的能力、体外黏附能力。并与标准菌株比较，分析其
展秀荣[7]2010年在《致龋性变形链球菌蛋白的初级晶体学研究》文中提出目的：龋病是口腔的常见病多发病,并已经成为严重危害人类健康及生活质量的疾病。目前,我国的龋病处于高发状态,迫切需要寻求有效的防龋方法来提高口腔健康防治水平。变形链球菌是人类龋病的主要致病菌,通过对变形链球菌进行结构基因组学方面的研究,更好地理解该菌基因的复杂性和特异性,其如何摄取营养、抵抗宿主防御以适应口腔环境,为新的防治龋病措施的发现和新药物的开发奠定基础。方法：蛋白质晶体学是结构基因组学的主要研究手段,可用于解析蛋白质叁维结构及基于结构的药物设计方面的研究。本实验利用北京大学结构生物学实验室高通量结构基因组学实验平台,通过靶基因筛选、高通量自动化基因克隆和表达、高通量蛋白纯化、晶体筛选、晶体衍射数据收集和晶体结构解析的一整套实验流程进行致龋性变形链球菌蛋白的结构基因组学研究。结果：本论文的主要工作是对变形链球菌基因组中的两个基因：SMU.2055、SMU.1254进行了蛋白纯化和晶体筛选工作。目的基因被克隆并连入pET28a载体中,SMU.2055、SMU.1254在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达、可溶性良好并获得了可溶性较高的蛋白。用金属镍螯合层析和凝胶排阻层析对蛋白进行纯化得到较为均一的目的蛋白,再以坐滴蒸汽扩散法初筛得到目的蛋白的晶体,并通过进一步的优化得到适合上机衍射和数据收集的晶体。其中,SMU.2055的蛋白晶体和其硒代甲硫氨酸蛋白晶体的衍射数据已经被收集,蛋白结构已解析(PDB：3LD2)。SMU.1254的蛋白晶体及其泡重原子晶体衍生物的衍射数据已经被收集,蛋白结构还在解析之中。结论：致龋性变形链球菌SMU.2055、SMU.1254蛋白的结构基因组学及蛋白质晶体学的研究,原子水平上深入了解变形链球菌中蛋白的结构和功能,为更好的研究变形链球菌蛋白在生物体内代谢及龋病发生、发展进程中的生物学功能作用奠定了基础。
张元鑫[8]2011年在《脱乙酰壳聚糖—叁氟乙酸对变异链球菌抑菌特性的体外研究》文中认为目的:龋病是人类口腔的常见病、多发病,世界卫生组织已经把龋病列为人类重点防治的叁大非传染性疾病之一。变异链球菌是口腔中的常驻菌之一,同时也是龋病的主要病原菌。壳聚糖(chitosan, CS)是甲壳素脱乙酰化的衍生物,是自然界中唯一的碱性多糖。独特的分子结构使其具有抑菌、抗肿瘤、增强免疫力、促进组织再生等功能。因其良好的生物相容性和可降解性,目前己被广泛的应用于医药领域。独特的理化性质使其便于制成膜、凝胶、微球等各种剂型,可满足多种施药途径的需要;特有的生物粘附性,有助于抵御唾液的冲刷和稀释。因而在龋病的预防和治疗方面,具有巨大的应用潜力。叁氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)是一种含氟有机酸,它是许多有机化合物的良好溶剂,如与二硫化碳合用,可溶解蛋白质。它也是有机反应的优良溶剂,是重要的有机合成试剂,由它可以合成各种含氟化合物。关于壳聚糖的抑菌效果已有不少报导,本研究拟探索脱乙酰壳聚糖-叁氟乙酸(CS-TFA)复合物对变异链球菌的抑菌效果以及对变异链球菌生长和产酸的影响。方法:测定CS-TFA对变异链球菌的抑菌效果,将CS-TFA加入变异链球菌培养基中,测定其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,壳聚糖和人工唾液作为对照组。取96孔板,采用对倍稀释方法用TPY液体培养基配制实验溶液。加入浊度A540 =0.33的菌液40μl后,液体总体积为200μl。将96孔板于37℃厌氧环境中培养48h,取出肉眼观察各孔中细菌生长情况。需通过离心(3500r/min,离心8min),菌细胞用PBS缓冲液洗两次,PBS缓冲液重悬后,观察叁组溶液对变异链球菌的抑菌作用。无细菌生长的最低浓度即该组溶液对变形链球菌的最小抑菌浓度(MIC)。离心前,挑取肉眼观察可能无细菌生长的溶液,划线接种于TPY琼脂平板,37℃厌氧培养,分别观察培养后24h、48h平板上有无菌落生长,无细菌生长的最低浓度即为该药物对变异链球菌的最小杀菌浓度(MBC)。用TPY液体培养基将药物配制成2倍终浓度的实验药液,加入TPY液体培养基0.5ml和浊度A540=0.33的菌液0.25ml后,液体总体积为l.5ml。各组均于37℃厌氧培养,在培养3h、22h、27h、32h、45h时,分批取出各试管,菌悬液混匀, 3500r/min离心8min,吸取上清液lml,平铺于玻璃平板上测定其pH值。结果:CS-TFA和壳聚糖的最小抑菌浓度分别为1.0和1.5g/l,最小杀菌浓度为20g/l和30g/l,人工唾液组的细菌生长迅速,在接种后16h达到最大浊度,而CS-TFA组(5.0 g/l)和壳聚糖组(4.5g/l)则表现出延迟生长,在接种后32h后达到最大浊度,CS-TFA抑菌效果要优于壳聚糖。CS-TFA组和CS组的最终pH值分别为5.75和4.73,人工唾液组的最终pH值为3.52; pH值稳定后,人工唾液加入CS-TFA后的pH值为4.55,实验结束后,CS-TFA组和CS组细菌存活率分别为80%和87%,而人工唾液组的细菌存活率为93%。结论:CS-TFA对变异链球菌的生长和产酸均有一定的抑制作用,是一种具有临床应用前景的防治龋病复合物。
刘鹏[9]2009年在《酪蛋白糖巨肽的制备及其抑菌特性的研究》文中认为酪蛋白巨肽(Casein Glycomacropeptide,CGMP)是一种来源于哺乳动物κ-酪蛋白,具有64个氨基酸残基(106-109)的糖肽。它是在干酪生产过程中,凝乳酶(或胃蛋白酶)水解κ-casein中Phe105-Met106的肽键所得到。CGMP具有不同的种类,主要是由于其不同的糖基化和磷酸化结构。CGMP已知具有多种生物活性,例如结合霍乱毒素和大肠杆菌毒素;抑制细菌和病毒的粘附作用;抑制胃液分泌;促进双歧杆菌增殖;调节免疫系统等。本文研究了胃蛋白酶水解酪蛋白制备CGMP的工艺条件,并发现了粗品CGMP对口腔致病菌-变形链球菌具有抑制作用。在本文中,CGMP是通过胃蛋白酶酶解牛乳酪蛋白产生的。实验研究了水解时间、温度、pH、酶与底物比这四个因素对CGMP生成量的影响。通过正交实验,得到最佳水解条件是:水解时间为40min,pH 1.8,温度为45℃,酶与底物比([E]/[S])为134.4U/g。通过间苯二酚-盐酸法,以CGMP标准品为对照,进行水解产物中CGMP的检测,实验结果表明:水解产物与CGMP标准品所显颜色相同。进而证明了该水解产物中确有CGMP存在。随后,实验通过间苯二酚-盐酸法,测定水解产物中唾液酸含量,并对照CGMP标准曲线,推算出水解产物中CGMP含量为30.74%。实验采用Tricine-SDS-PAGE电泳,对水解产物中的CGMP进行了鉴定,并考察其分子量的分布。实验结果表明水解产物中CGMP分子量约为7.0kDa和15kDa不等。采用滤纸片扩散法,研究粗品CGMP抑制变形链球菌生长的特性。实验发现:含有粗品CGMP的滤纸片周围抑菌圈清晰透明,证明粗品CGMP对变形链球菌具有明显的抑制作用。采用96-孔板法对粗品CGMP对变心链球菌的抑制作用进行定量研究。实验结果显示:粗品CGMP对变形链球菌的最小抑菌浓度为24mg/mL,此外当粗品CGMP浓度为12mg/mL、6mg/mL、3mg/mL时,粗品CGMP对变形链球菌的抑制率也较高,分别为:88%、73%、64%。
曾媛琴[10]2010年在《家蚕（Bombyx mori）耐氟性研究和细胞色素P450基因cyp6u1及cyp6α8的分子克隆与表达分析》文中指出氟中毒是严重危害人体健康的主要地方病之一,该病危害严重,不仅能够造成氟斑牙、氟骨症等硬组织的广泛损伤,还可引起全身软组织不同程度的广泛损害。阐明氟中毒致病机制,是当今研究的热点问题之一。细胞色素P450酶系也就是多功能氧化酶(MFO),是所有需氧生物体都存在的代谢酶系。细胞色素P450基因由35亿年前的一个共同祖先进化而成,是最古老和最庞大的超基因家族之一。它对代谢与转化内源物质和活化与降解外源化合物进行催化和调控。昆虫中的细胞色素P450酶系作用涉及生长、发育、取食等过程,其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对有毒物质的耐受性。家蚕(Bombyx mori是鳞翅目昆虫的模式生物,鳞翅目是昆虫中的第二大目。本研究基于家蚕基因组精细图和EST、全基因组基因芯片数据,对家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6ul和Bmcyp6a8基因进行了克隆和生物信息学研究。本论文的主要研究结果如下：1.家蚕耐氟性研究分析研究了家蚕添氟方法及桑叶氟浓度检测方法。桑叶用200ug/mLNaF浸渍15分钟,自然晾干。将桑叶研磨,加入1mol/L的HCl浸泡1小时(轻微震荡),pH5-6的TISAB缓冲液定容至50ml,氟离子选择电极检测氟浓度,能够精细地检测出桑叶的氟浓度值。筛选了家蚕耐氟性品种T6和敏感性品种734,检测出耐氟阈值200ug/mL。用200 ug/mL的NaF浸渍桑叶15min,4龄起蚕开始饲喂家蚕,发现耐氟性品种T6虽然体重增长速率低于清水对照组,但是仍然能够一直稳步成长至上蔟：而同时同等条件喂养的734却体重增长异常缓慢,至4龄后期,渐渐死亡,最终不能进入眠期,全部死亡。检测了NaF对家蚕食桑量的影响。相对于对照组,T6和734的添氟组食桑量都有所减少,但是734食桑量减少量异常,严重影响了正常生长；检测了NaF对家蚕蚕沙量的影响。统计显示,添氟组蚕沙量明显低于对照组。除了食桑量减少造成的蚕沙量减少,NaF造成家蚕排泄困难。检测了氟中毒家蚕体内氟含量和各组织的氟含量。统计显示耐氟品种T6和敏感品种734的蚕沙氟含量一直上升；敏感品种734排氟量在到达36ug后就直线下降,一直在36ug徘徊；T6排氟量到达233ug后开始下降。分析显示氟排泄是家蚕耐氟性的一种重要途径。检测了氟中毒家蚕T6各组织的氟含量,包括头、血液、表皮,中肠、马氏管、丝腺、精巢(卵巢),发现头部组织和马氏管中氟离子含量最高。头部组织对氟化钠的不敏感性与氟代谢相配合是家蚕耐氟性另一重要途径。检测了氟中毒家蚕蛾期和蚕卵的氟含量,发现蛾的氟含量约等于5龄7天的氟含量。检测了家蚕添氟组与对照组的乙酰胆碱酯酶含量和活性变化。结果显示,与对照组相比,添氟组头部酶原蛋白含量明显升高,乙酰胆碱酯酶活性呈规律性的明显降低。分析显示,家蚕乙酰胆碱酯酶是家蚕耐氟性的重要靶标之一。乙酰胆碱酯酶酶原蛋白量的增加弥补了活性的缺失,可能是耐氟品种头部组织对氟不敏感性的原因。2.家蚕细胞色素P450第六家族基因的克隆及功能研究采用生物信息学方法获得与果蝇cyp6ul基因同源的家蚕cyp6ul基因序列,实验结果表明,该基因ORF为1476 bp,编码491个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为56.15 kD,等电点为9.23。(GenBank登录号：HM130560)。同源性分析表明：Bmcyp6ul基因与蜜蜂同源基因cyp6AS13的相似性为56%：与拟南芥cyp72A82的相似性为48%；与人的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明,Bmcyp6ul基因在家蚕5龄第3天幼虫组织表达量很低,只在精巢组织稍有表达,推测该基因具有功能特异性。依据家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,RT-PCR克隆了家蚕Bmcyp6a8基因。结果表明,该基因ORF为1572bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为61.52kD,等电点为8.17,只有1个内含子。生物信息学分析显示,该基因位于第16号染色体,与野蚕cyp6AE8的相似性较高,同源性为93%,与棉铃虫的同源性为57%,与人的cyp3A43的同源性为33%。GenBank登录号为：GQ241737。从NCBI上下载人、果蝇、蜜蜂、斑马鱼、线虫的基因组与Bmcyp6a8进行比对,发现同源性基因全部是P450基因,构建进化树,Bmcyp6a8与蜜蜂第六家族基因聚集成簇。芯片表达图谱显示,Bmcyp6a8基因具有功能特异性。
参考文献：
[1]. 变形链球菌、远缘链球菌耐氟菌株与亲代菌株基因组、蛋白质组的比较[D]. 朱怡玲. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[2]. 变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株的基因组比较[D]. 丁春燕. 天津医科大学. 2006
[3]. 变形链球菌基因型耐氟菌株体外诱导及其质子移位膜ATP酶活性研究[D]. 殷晓萍. 天津医科大学. 2004
[4]. 采用非标记定量技术对变形链球菌耐氟菌株的差异蛋白质组学研究[D]. 赵洪岩. 吉林大学. 2011
[5]. 甘草、匙羮藤提取物对变异链球菌作用的初步研究[D]. 胡利杰. 四川大学. 2007
[6]. 老年人高龋患者牙菌斑中变形链球菌临床分离株致龋性的研究[D]. 方会清. 第四军医大学. 2006
[7]. 致龋性变形链球菌蛋白的初级晶体学研究[D]. 展秀荣. 兰州大学. 2010
[8]. 脱乙酰壳聚糖—叁氟乙酸对变异链球菌抑菌特性的体外研究[D]. 张元鑫. 大连医科大学. 2011
[9]. 酪蛋白糖巨肽的制备及其抑菌特性的研究[D]. 刘鹏. 天津科技大学. 2009
[10]. 家蚕（Bombyx mori）耐氟性研究和细胞色素P450基因cyp6u1及cyp6α8的分子克隆与表达分析[D]. 曾媛琴. 西南大学. 2010
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