韩新运[1]2003年在《甘蔗抗黑穗病性检测SCAR标记的建立》文中认为由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd．)引起的甘蔗黑穗病是甘蔗栽培上最主要的病害之一，在世界各植蔗区普遍发生，造成感病品种蔗茎产量和蔗糖分的严重损失，在旱地甘蔗上为害更为严重，培育抗病品种是最有效的措施。迄今甘蔗抗黑穗病性鉴定，仍采用人工接种田间种植的表型进行鉴定，但通过此法对抗性的确定至少需两年新植或一新一宿的种植鉴定，周期长、工作量大，难以对大规模的样品进行测试，只能在高代进行且存在环境的互作效应，针对抗病性的早代选择盲目性大。分子标记辅助选择是基于基因组核酸水平的差异，不存在环境的互作效应，因此，可显着提高鉴定的准确性和选择效率。本研究的目的是建立可检测甘蔗抗黑穗病性的SCAR标记。本文通过预备试验，优化了甘蔗RAPD反应组份和反应程序，建立了适于甘蔗的RAPD反应条件。采用随机引物PCR扩增，对杂交亲本Ya71-374、Co1001及其部分杂交后代进行了RAPD分析，筛选到与抗、感特异的多态性片段各一条，片段大小分别约为700bp和800bp。采用T-MD 18克隆载体，对700bp片段进行克隆，通过PCR和酶切鉴定，筛选阳性重组克隆子用于测序。测序结果显示该片段的实际长度为702bp，根据其两端的序列，设计了一对上、下游长度分别为23bp和22bp的引物，并对上述材料进行PCR检测。结果显示所有材料均扩增出一条702bp的条带，但感病亲本和感病个体中还扩增出一条长约400bp的多态性片段；初步研究还显示一组用于常规抗性鉴定的标准对照种也有类似的标记结果，从而将RAPD标记转化为SCAR标记，该SCAR标记有望用于甘蔗抗、感黑穗病基因型的鉴定。其上、下游引物的序列如下： 上游引物：5’TTCCCCCGCTGCCCTCTTTTCTT3’ 下游引物：5’TTCCCCCGCTCGGACACCTGTT3’
许莉萍[2]2000年在《甘蔗抗感黑穗病池的构建和抗病基因分子标记》文中研究表明由甘蔗黑穗病菌（Ustilago sictaminea Syd.）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性的主要病害，在世界各植蔗区普遍发生，造成感病品种蔗茎产量和蔗糖分的严重损失，在旱地甘蔗上为害更为严重，公认控制该病最经济有效的途径是种植抗病品种。美国、巴西，古巴和中国等主要产蔗国均把抗黑穗病性作为甘蔗育种的主要目标之一，抗病性鉴定的方法直接影响抗病育种的成效。迄今，育种实践上仍是采用人工接种田间种植抗病性鉴定，且抗病性评价指标单一，有其固有的局限性，急需完善这种鉴定法并发展分子标记辅助选择法（MAS）。利用MAS，首先必需找到与抗病基因稳定连锁的标记，而有关该基因的分子标记国内外尚未见报道。本研究利用高抗与高感黑穗病的亲本杂交（CO1001×Ya71-374）所产生的分离材料，通过2次新植和1次宿根的人工接种试验，补充和完善人工接种田间种植抗性评价的方法，提出以标准品种作参照，多指标聚类分析评价抗病性的方法，并利用BSA方法，筛选出与甘蔗抗黑穗病基因稳定连锁的RAPD标记，为进一步利用MAS和抗黑穗病基因的克隆打下基础。 相关分析结果表明，病害流行参数SDD、IPmax、Ymax和AUDPC之间的两两相关均达0.05或0.01的显着水平，且并不因作物季的不同而异，说明前人以单一的IPmax、Ymax或AUDPC作为抗病性评价指标有一定的合理性。 抗性稳定性分析表明，不同抗性类型的材料其抗病性在新植→宿根，新植→新植的重演性差异明显，重演率从10.0％～100.0％。具极端抗性水平（如高抗或高感）的材料其重演率高，其次为抗或感，中等抗性类型的重演率极低。说明具极端抗性的材料通过较少次数的接种鉴定就可得到较可信的结果。 抗性鉴定结果表明，同一材料各病害流行参数值在不同作物季是各异的，且大多数供试材料在同一作物季，依照单一的Ymax、IPmax或AUDPC进行抗病性大小排序的结果是不同的，说明了设置标准对照种及多指标综合评价抗性的必要性。通过LP、SDD、IPmax、Ymax和AUDPC等参数的聚类分析并参照标准对照种，对供 试材料的抗病性作出评价，构建了可用于目的性状江锁标记的抗、感池。 通过PCR反应参数的优化，建立了稳定的甘蔗RAPD分析体系。即在25 v L 反应混合液中，含二．spL10XpCRbuffCFglsngig板DNA，2．0mmd．LJMg’”，120if mol．L” dNTPs和 IU Taq酶，采用 10个低严紧度和 35个高严紧度相结合的 PCR循 环体系，可获得稳定的RAPD结果。 用抗、感池DNA为模板，以RAPD为主翌技术，用118个10iner引物进行 PCR，经BSA重复检测，只有引物Sa表现抗、感池DNA间的差异，且在两池个 体上得以证实，扩增出一条抗病基因型所特有的分子量约520hp的多态性片段，证 明了这一多态性片段的可靠性，记为Sa－520。 扩展实验结果显示，Sa在池外同一家系其它抗病个体及抗病甘蔗品种上也扩增 出这条多态性片段，而在池外同一家系其它感病个体上和感病甘蔗品种上不存在， 再一次证明了Sa－520与抗病基因的稳定连锁关系。
阙友雄[3]2008年在《甘蔗与黑穗病菌互作的分子应答研究》文中研究指明由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)引起的甘蔗黑穗病是一种世界性病害,也是我国甘蔗生产的最主要真菌性病害,造成甘蔗感病品种蔗茎产量和蔗糖分的严重损失,并曾先后淘汰了一些丰产高糖的当家品种。解析甘蔗与黑穗病菌互作的分子应答,开拓分子育种途径就显得非常重要。本研究在综合应用RAPD、SRAP和ITS叁种标记技术系统分析我国甘蔗黑穗病菌分子分化基础上,利用cDNA芯片、2-DE技术、MALDI-TOF-TOF/MS以及定量PCR等技术研究了甘蔗与黑穗病菌互作后的分子应答。结果表明,甘蔗黑穗病菌的分子分化同其地理来源相关,具有地域性特点,但与寄主品种无关,不存在共分化机制。研究结果还显示,ITS序列不适合于甘蔗黑穗病菌的系统发育分析。基于芯片杂交和蛋白组学研究,获得了36个上调表达基因和20个差异表达蛋白。这些上调表达的基因其功能涉及光合作用、离子转运和核酸代谢等多个途径,与转录因子、蛋白合成与修饰及信号转导相关的基因也上调表达,另有1个NBS类抗病基因;而差异表达蛋白分别参与蛋白质合成、信号转导、光合作用,另有1个为促进植保素合成的细胞色素C过氧化物酶、1个NBS类抗病蛋白和3个未知蛋白。根据拟南芥RPS2基因、烟草N基因和亚麻L6基因的保守结构域,设计简并引物,采用RT-PCR技术从甘蔗基因组DNA和cDNA中,克隆了11条NBS类抗病基因类似物。对编号为EF155648的NBS序列采用RACE技术,获得了一条2985 bp全长cDNA序列(Accession number:EF155654),记作SNLR,该基因包括一个2661 bp的完整开放读码框(ORF)和一个29 bp的poly-A,属于non-TIR-NBS-LRR类抗病相关基因。定量PCR分析表明,SNLR基因可能与黑穗病抗性有关。此外,本研究还利用RAPD和BSA相结合的方法,筛选了能够应用于甘蔗黑穗病抗性评价的分子标记并成功转化为SCAR标记SC619,该标记具有应用于育种辅助选择的潜力。综上所述,甘蔗与黑穗病菌互作的分子应答在转录水平和翻译水平同时发生,甘蔗对黑穗病菌的抗性是众多基因和各种功能蛋白共同参与的一个分子适应过程,研究结果为深入解析甘蔗抗黑穗病分子机制提供了试验依据。而SNLR基因的克隆和SC619标记的开发为转基因育种和标记辅助选择提供了技术储备。另外,病原菌分子分化研究可以为抗病性鉴定中病原菌的选择和品种区域布局提供依据。
黄文华[4]2005年在《甘蔗杂交后代遗传变异分析与标记检测群体构建》文中进行了进一步梳理甘蔗是最重要的糖料作物,占我国食糖产量的90%以上,同时它也南方地区生产燃料乙醇的最佳可再生能源作物,品种改良对提升甘蔗产业竞争力意义重大。迄今,常规有性杂交和系谱选择育种仍然是甘蔗品种改良最重要的方法,但是,甘蔗遗传背景复杂,杂交后代群体庞大,品种育成的概率约为1/300000,提高杂交后代优良株系选择的准确性和效率是关键。另一方面,我国80%蔗区为旱地,由黑粉菌(Ustilago scitaminea)引起的甘蔗黑穗病在旱地甘蔗上发生严重,该病已成为我国甘蔗生产上最严重的真菌性病害,发病蔗茎无商业价值,因此,抗黑穗病育种已成为近15年来甘蔗育种的主要目标之一,而抗病性鉴定的准确性和效率直接影响抗病育种的成效。 分子标记辅助选择可显着提高鉴定的准确性和效率,但取决于所用标记与目标性状连锁的紧密程度和可靠性。已证明集群分离混合池法(BSA)和分子标记技术结合是筛选连锁标记的有效方法,建立可用于标记检测分析的甘蔗目标性状分离群体是筛选与目的基因连锁标记的前提。为此,在国家863项目(2002AA241031)、农业部948项目(2003—Q06)和国家自然科学基金项目(30170639)的资助下,本研究以高糖、感黑穗病的亲本CP84-1198为母本,高产、抗病亲本科5为父本,配置杂交组合1,考察其中的108个(F1代)和105个(无性世代)后代;高糖、高抗黑穗病的亲本ROC20为母本,以高产、感黑穗病亲本桂73-167为父本,配置杂交组合2,考察其中的150个后代。在对两个组合杂交后代群体F1代和无性世代主要经济性状遗传变异和两次新植人工接种抗黑穗病性鉴定的基础上,构建了两个可用于检测与甘蔗糖分性状和甘蔗抗黑穗病性状连锁标记的群体,为标记的筛选以及分析甘蔗抗黑穗病性与主要经济性状连锁遗传关系提供研究材料和遗传背景。主要结果和结论如下: (1) 两个组合杂交后代群体主要经济性状变异模式分析结果表明:锤重和丛重的变异系数大,达40%以上,说明性状离散度大;其次是有效茎数;株高、茎径和锤度的变异系数小,在15%以下,而锤度的变异系数最小,约为10%,说明特定组合后代的株高、茎径和锤度离散度小,而锤度的离散度最小,故生产性组合亲本应选择这些性状突出的材料。组合1的株高、丛重和锤重整体优于组合2,但
张玉叶[5]2015年在《甘蔗受黑穗病菌胁迫下microRNA差异表达及其靶基因功能分析》文中研究说明甘蔗(Saccharum spp.)是我国最重要的糖料作物和能源作物,蔗糖占我国食糖总产的92%。由黑粉菌(Sporisorium scitamineum, S. scitamineum)引起的甘蔗黑穗病(sugarcane smut),严重危害甘蔗生产,导致产量和蔗糖分降低,给我国甘蔗产业造成了巨大的经济损失。培育抗黑穗病甘蔗品种是控制甘蔗黑穗病危害的最经济有效的手段。植物与病原互作的分子机制包括转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后水平等多方面调控机制。随着生物技术的发展,有关甘蔗与黑穗病菌互作分子机制的研究有了长足进步,但是尚未见利用高通量测序技术鉴定甘蔗受黑穗病菌胁迫后microRNA (miRNA)差异表达及其靶标基因预测和功能分析的报道。本研究首次利用高通量测序技术鉴定甘蔗受黑穗病菌胁迫下miRNA的差异表达,从甘蔗小RNA高通量测序与niRNA鉴定注释、差异miRNA筛选和实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)表达验证与表达模式分析、差异miRNA的功能分析及其靶基因预测和靶基因表达分析等叁个方面入手,系统比较了甘蔗与黑穗病菌互作系统的亲和与不亲和互作间在转录后水平上miRNA的调控机制,以期为甘蔗抗黑穗病分子机理的研究提供niRNA水平的佐证,丰富和深化甘蔗抗黑穗病的分子机理研究,进而为培育抗黑穗病甘蔗品种提供miRNA水平的理论依据。miRNA具有重要的生物学功能,在植物受到生物和非生物胁迫的过程中发挥重要调控作用,其介导的转录后水平的基因调控是生物体内一条重要的小RNA调控路径。本研究以甘蔗抗黑穗病无性系崖城05-179 (YA05-179)和感黑穗病甘蔗品种新台糖22 (ROC22)为研究材料,以接种黑穗病菌蔗芽作为处理组(YAT、RT),接种清水作为对照组(YACK、RCK),应用高通量HiSeq测序技术鉴定甘蔗受黑穗病胁迫下48h的miRNA差异表达,对所获得的小RNA序列注释并筛选出差异表达的miRNA,利用生物信息学技术与数据库结合对其靶向基因进行预测。实验对筛选出的部分差异miRNA进行实时定量验证,并进一步分析了甘蔗与黑穗病菌互作Oh、12h、48h和96h不同时间点miRNA与其部分靶基因的表达模式。研究旨在找到甘蔗在黑穗病菌胁迫下发挥关键调控作用的miRNA及其靶基因,为甘蔗抗黑穗病分子育种提供miRNA和基因资源。主要研究结果如下：1.四个甘蔗样品的送样质量良好,分别测序得到符合要求的干净序列为RCK 36396588条、RT27812972条、YACK 27464468条、YAT 28290231条,且杂质序列含量都少于1%,故高通量测序获得的小RNA质量高。结合多个数据库对测得的sRNAs进行筛选注释,其中RCK测序获得264个已知miRNA,RT有263个,YACK有260个,YAT有262个。此外,在RCK、RT、YACK和YAT中分别预测出137、140、111和119个新miRNA。有碱基分布统计分析结果显示,四个小RNA文库中在植物中含量较多的长度为21 nt和22 nt的新niRNA序列首位点碱基U所占比例较大；在序列碱基11位点,四个样品的新miRNA序列的碱基都偏向于A,符合miRNA序列特征,说明新miRNA序列的预测结果可行性高。2.在ROC22中,筛选出231个已知miRNA,其中35个在黑穗病菌胁迫处理样品和清水接种对照样品间发生显着差异表达(|log2一ratio|>1,P<0.05)；涉及10个上调表达和25个下调表达的miRNA:在对照组与处理组样品中表达量差异倍数最高达4.6倍。在YA05-179中,两个样品中共有的已知miRNA为208个,对照组与处理组中发生显着差异表达niRNA有11个；涉及2个上调表达和9个下调表达的miRNA:对照组与处理组样品中表达量差异倍数最高达2.1倍。在ROC22和YA05-179中,筛选出的差异表达的已知miRNA,下调表达的占多数,且大部分miRNA的种类和表达趋势是相同的。在ROC22中,筛选出的显着差异表达(|log2-ratio|>1,P<0.05)的新miRNA有16个,而YA05-179中有6个；其在单一品种特有的比较多,且在两个品种中没有发现共同显着差异表达的新miRNA。本研究针对筛选出的16个差异表达的已知miRNA和新miRNA,利用qRT-PCR对其在ROC22与YA05-179两个品种中27个表达结果进行测序结果验证,相符率达到了85.2%,可见本研究的测序结果可靠性较高。3.甘蔗是个高度杂合的异源多倍非整倍体作物,其全基因组测序尚未完成,因此本研究注释的miRNA未知序列占小RNA序列的绝大多数,随后对所注释的miRNA在甘蔗受黑穗病菌胁迫时对应靶基因的预测及分析数据也不完整。差异表达的已知miRNA预测出的靶基因数,YA05-179少于ROC22,但差异表达的新miRNA对应的靶基因数目在YA05-179中明显多于R022。靶基因生物功能分析中,GO归类为生物过程(biological process)、细胞组分和元件(cellular components)分子功能(molecular function)。两个品种中,差异表达的已知miRNA靶基因的分类情况与差异表达的新miRNA所匹配的靶基因序列统计情况相似,即在生物过程分类中靶基因主要分布在细胞过程与代谢过程,细胞组分和元件分类中靶基因主要分布在细胞、细胞组分和细胞器中,分子功能分类中靶基因主要分布在结合与催化活性。KEGG通路富集分析显示,差异miRNA调控的靶基因参与了一系列miRNA调控靶基因生理生化途径或抗病相关生理代谢和信号转导途径,表明甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制是一个复杂网络调控系统。研究发现,miR5077、 miR5671、miR5044、miR5261、miR5783、miR5221、miR6478和miR948的靶向基因在MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、植物激素信号转导(Plant hormone signal transduction)和植物-病原菌互作 (Plant-pathogen interaction)中发挥重要作用并构建了相关蛋白网络调控图。4.从miRNA靶基因中筛选了在甘蔗EST文库中有生物功能注释的序列,并针对所筛选出的差异表达的已知miRNA和新miRNA所对应的部分靶基因进行了qRT-PCR表达分析。结果显示,在已知miRNA与其靶基因的表达分析中,大部分miRNA与其靶基因呈负调控模式,即niRNA过表达时,靶基因的表达量呈下降趋势；其中8个靶基因中有7个靶基因的表达在12h后基本相符,且在48h时匹配度最高。这也从另一方面说明甘蔗受黑穗病菌胁迫后miRNA对靶基因的调控作用在48h达到最高。研究还揭示,本研究中已知miRNA与靶基因表达丰度预测与功能分析的可靠性高,但在候选的新miRNA及其靶基因定量表达结果之间的负调控趋势的符合率就没有那么高,故还需对新miRN A的预测与分析作进一步的挖掘。
林剑伟[6]2008年在《利用cDNA-AFLP分析甘蔗与黑穗病菌互作后的基因差异表达》文中进行了进一步梳理甘蔗黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)引起的一种最主要的甘蔗真菌性病害,严重影响蔗茎产量和质量。抗黑穗病育种一直是甘蔗育种的重要目标和当前生产上急需解决的关键问题。为此,本研究以甘蔗高抗黑穗病品种NCo376为试验材料,利用cDNA-AFLP和银染技术,研究了黑穗病菌优势小种2胁迫下甘蔗基因的差异表达,获得了136个差异表达片段,从中挑取40个差异片段,经过克隆、测序和RT-PCR标记验证后,筛选到37个诱导后差异表达的片段,其中31条为特异表达(诱导或缺失)片段,6条为表达量差异(上调或下调)的片段。在NCBI上进行blastx同源性分析显示,34条差异表达基因序列可能在甘蔗与黑穗病菌互作响应中起作用,其功能涉及细胞拯救与防御、细胞内运输、新陈代谢、核酸代谢、转录、蛋白合成与修饰及信号传导等生物学过程;其余2条差异表达序列与玉米mRNA序列同源性高,达86%和80%,1条与甘蔗叶绿体DNA序列同源性高,达96%。此外,为了验证差异表达基因的真实性,研究还选取其中3个差异表达基因(SUC09、SUC06和SUC10),以甘蔗组织为材料,利用RT-PCR标记,研究了接种组0-72h时间段之间7个时间点的基因差异表达,并证实了所获得基因序列为真实的诱导表达序列。研究结果为甘蔗抗黑穗病分子育种奠定物质和技术基础,也填补了甘蔗与黑穗病菌互作后基因差异表达研究的不足。
参考文献：
[1]. 甘蔗抗黑穗病性检测SCAR标记的建立[D]. 韩新运. 福建农林大学. 2003
[2]. 甘蔗抗感黑穗病池的构建和抗病基因分子标记[D]. 许莉萍. 福建农林大学. 2000
[3]. 甘蔗与黑穗病菌互作的分子应答研究[D]. 阙友雄. 福建农林大学. 2008
[4]. 甘蔗杂交后代遗传变异分析与标记检测群体构建[D]. 黄文华. 福建农林大学. 2005
[5]. 甘蔗受黑穗病菌胁迫下microRNA差异表达及其靶基因功能分析[D]. 张玉叶. 福建农林大学. 2015
[6]. 利用cDNA-AFLP分析甘蔗与黑穗病菌互作后的基因差异表达[D]. 林剑伟. 福建农林大学. 2008