李付广[1]2004年在《人食管癌Eca-109细胞膜肿瘤抗原筛选的研究》文中提出目的： 肿瘤疫苗(tumor vaccine)是指给机体直接或间接输入的具有抗原性的成分，它可刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应，用于治疗肿瘤。肿瘤细胞的抗原(antigen，Ag)绝大部分为细胞膜蛋白。收集其进行研究，对于寻找高效肿瘤抗原具有重要意义。本研究采用改良的Neville法和弱酸洗脱法收集不同分子量的人食管癌细胞株Eca-109细胞膜蛋白，寻找能引起免疫反应的肿瘤抗原，筛选出高效肿瘤抗原的大致范围，为食管癌的免疫治疗提供依据。 方法： 1．提取Eca-109细胞膜蛋白：使用改良的Neville法先提取细胞膜。然后在pH 6.3的条件下，用去垢剂(detergent)Triton Ⅹ-100和辛基β-葡糖苷(octyl β-glucoside)，把细胞膜上的蛋白溶解下来，以超滤法纯化膜蛋白并分组。 2．以超滤法纯化膜蛋白并分组：以超滤法将膜蛋白从以Triton Ⅹ-100作去垢剂的成分中按分子量大小分出＜3KD、3～10KD、＜10 KD、10～30 KD四个组；从以辛基β-葡糖苷做去垢剂的成分中分离出30～100 KD、＞100 KD两个组，并测定各组膜蛋白浓度。 3．测定膜蛋白的浓度：用Bradford检测法，在pH 6.3、波长595nm处，制作蛋白标准曲线，测定含有去垢剂的各组膜蛋白浓度，推导出适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂／mg膜蛋白)。 4．检测Eca-109细胞的HLA表型及筛选健康志愿者：使用HLA引物试剂盒，琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)观察聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增后的DNA产物，鉴定出Eca-109细胞的HLA表型。采用血清学HLA分型技术，寻找至少有一个HLA Ⅰ类基因位点与Eca-109细胞HLA相匹配的健康志愿者。 5．人外周血DC的培养：取筛选出的志愿者的外周血，密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用含粒细胞-巨噬郑州大学2004年博士学位论文人食管癌Eca一109细胞膜肿瘤杭原筛选的研究细胞集落刺激因子(granuloeyte一macro坤昭e eolo妙stimulati飞factor， GM一CSF)、白细胞介素一4(inierieukin一4，IL一4)及该志愿者血清的即Ml 1640培养液调整细胞密度后，加入24孔板中培养。于培养的第4天，根据一定比例加入膜蛋白，第6天加入LPS促进DC成熟，于第7天收获成熟的悬浮DC。 冷冻保存抗原负载的成熟DC:含有10%DMSO和5%葡萄糖的纯自身血清作为冻存液，可以将密度为10 xl护/ml抗原负载的成熟DC，以每分钟降温1℃，放置于液氮的气相中保存。 6.人外周血T细胞的培养:在IL一2维持下，流式细胞仪检测此志愿者PBMC的分化情况。根据检测结果，再收获PBMC，经过换培养瓶及PHA刺激，以含hIL一2的RPMI 1 640培养液常规培养PBMC4周，收集纯化的T细胞。 7.MTT法测定致敏T细胞的细胞毒活性:以纯化的T细胞为效应细胞，加入抗原负载的成熟DC，以8:l、16:l、32:l的效靶比分别加入Eea.1 09细胞(其为靶细胞);同时设阳性对照组、阴性对照组及效应对照组，各组设3个复孔，用MTT法在%孔板中测定CTL的细胞毒活性。 8.弱酸洗脱法:单层生长的Eca一109细胞每天按如下方法处理:去掉培养液，PBS洗叁次，每瓶加5ml构椽酸一磷酸盐缓冲液(pH3.3)室温作用lmin，使MHC分子变性，释放MHC分子结合的肤入上清液。肿瘤细胞经PBS洗3次，用培养液继续培养。每瓶细胞最多酸洗3次弃去。含有肤的酸洗液经过seP一Pak C18柱脱盐、真空浓缩和Microeon YM·3(Millipore)超过滤，一ZooC冻存。 9.反相高效液相(RP一HPLC)分析:Eca一109细胞细胞膜酸洗肤用HPLC分离，流速lml/min，用O%~70%梯度(v八护)0.085%TEA的乙睛溶液(B液)洗脱，水相为含0.085%TFA的水溶液。手动收集各峰，脱盐、浓缩和干燥，一20℃冻存。 10.肿瘤特异性细胞毒性〔CTL)T淋巴细胞的体外诱导:取该志愿者负载不同组分抗原肤的DC作为刺激细胞，在刺激细胞培养孔中加入自身外周血淋巴细胞，于24h后，再加入等体积的含ZOU/m lth一IL一2继续培养，每3天换液1次。每7天应用刺激细胞重复刺激淋巴细胞1次，共培养21天。 11.”c:释放试验检测cTL杀伤活性:Eca一109细胞为靶细胞，在4 xl护细胞中加入100 p Ci Na25’CrO;，在室温中放置lh，不时摇动。用大量HankS液充分洗涤细胞3次，除去游离铬，配成5 x10勺m1肿瘤细胞悬液。细胞以50:1效靶细胞比加入96孔U一底培养板(200 pl/孔)培养4h。每个样品设置3个复孔，收集培养上清，用Y计数仪检测上清CPM值。含有淋巴细胞、不负载抗原DC和靶细胞的孔为对照孔。 结果:郑州大学2004年博士学位论文人食管癌Eca一109细胞膜肿瘤抗原筛选的研究 1.在pH 6.3的条件下，适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂/mg膜蛋白)，在使用辛基p一葡糖昔时为6:1;使用肠妞。nX一100时为2:1。 2.Eea-log细胞的HLA的基因分型为A，03，A，24;B，35，B，37;n盼l’01，DRBI’12;DRB3。并找到一例表型为A03杂合子的健康志愿者。 3.PBMC的分化情况:健康人PBMC，只在IL一2维持下，用流式细胞仪检测其分化情况。B细胞于第1周时基本死亡，第3周时完全消失;NK细胞于第1周时明显增加，于第4周时
孙涛[2]2003年在《人食管癌Eca-109细胞膜抗原筛选的初步研究》文中指出目的 肿瘤疫苗(tumor vaccine)是指给机体直接或间接输入的具有抗原性的成分，它可刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应，用于治疗肿瘤。肿瘤细胞的抗原(antigen，Ag)绝大部分为细胞膜蛋白。收集其进行研究，对于寻找高效肿瘤抗原具有重要意义。本研究采用改良的Neville等方法收集不同分子量的人食管癌细胞株Eca-109细胞膜蛋白，寻找能引起免疫反应的肿瘤抗原，筛选出高效肿瘤抗原的大致范围，为食管癌的免疫治疗提供依据。 方法 树突状细胞(dendritic cells，DC)是已知抗原递呈能力最强的能激活初始T细胞的抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，APC)，细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes，Tc，CTL)是进行特异性肿瘤免疫的主要效应细胞，辅助性T细胞(helper T cell，T_H，Th)在抗瘤免疫中也具有不可缺少的作用。纯化的这叁种细胞，加上超滤法提取的膜抗原，能形成特异性抗肿瘤免疫反应。根据反应的强弱，可筛选出高效肿瘤抗原的大致范围。 1．提取Eca-109细胞膜蛋白：使用改良的Neville法先提取细胞膜。然后在pH 6.3的条件下，用去垢剂(detergent)Triton X-100和辛基β-葡糖苷(octyl β-glucoside)，把细胞膜上的蛋白溶解下来。 2．测定膜蛋白的浓度：用Bradford检测法，在pH 6.3、波长595nm处，制作蛋白标准曲线，测定含有去垢剂的各组膜蛋白浓度，推导出适当的去垢剂与膜蛋白之比郑州大学2003届硕士研究生毕业论文人食管癌Eca- 109细胞膜抗原筛选的初步研究 (即mg去垢剂/mg膜蛋白)。 3.以超滤法纯化膜蛋白并分组:以超滤法将膜蛋白从以TritonX一100作去垢剂的成分中按分子量大小分出<3KDa、3一10KDa、
李付广, 杜英, 孙涛, 董子明[3]2006年在《人食管癌Eca-109细胞膜肿瘤抗原的筛选》文中提出目的:从人食管癌Eca109细胞入手,筛选出食管癌高效细胞膜肿瘤抗原的大致范围。方法:采用敏感的序列特异性引物聚合酶链反应(PCRSSP)来确定Eca109细胞人主要组织相容性复合体(HLA)基因分型,用HLA血清学分型技术筛选健康志愿者;改良的Neville法结合超滤法纯化膜蛋白并分组:<3000、3000～10000、<10000、10000～30000、30000～100000、>100000、总膜蛋白共7个组,各组抗原负载树突状细胞(DC),以DC激活的T淋巴细胞为效应细胞,Eca109细胞为靶细胞,设效靶比为81、161、321,用MTT法检测效应细胞杀伤率。结果:Eca109细胞HLA的基因分型为A03,A24;B35,B37;DRB101,DRB112;DR52;DRB3;筛选到1例表型为A03杂合子的健康志愿者。根据MTT检测,在效靶比为81、161和321时,膜蛋白相对分子质量小于10000组的肿瘤细胞杀伤率与未使用去垢剂的总膜蛋白组相比差异无统计学意义(P>0.05),而相对分子质量小于3000组的杀伤率最高,与各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Eca109细胞膜蛋白中存在能引起特异性的抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞免疫反应的肿瘤抗原,相对分子质量小于3000的膜蛋白成分中可能存在人食管癌的高效肿瘤抗原。
郑峰[4]2013年在《抗原呈递元件基因甲基化对哈萨克族食管鳞癌发生的作用研究》文中提出目的：食管癌是较常见的恶性肿瘤之一，我国食管癌的发病率和死亡率居世界第一，每年约有16～20万人死于此病。新疆是食管癌高发区之一，其中哈萨克族发病率最高，比其他少数民族高2～3倍，病死率在全国少数民族中占第一位。食管癌作为新疆的常见病和多发病，已严重影响了本地区各族人民的身体健康。哈萨克族生活习惯及居住环境特殊，是较好的研究人群。利用新疆哈萨克族食管癌疾病资源，开展食管癌的基础研究，建立肿瘤分子标志物体系，结合临床研究来明确食管癌发病原因，对于新疆食管癌的预防、诊断及临床治疗具有重大意义。食管癌的病因复杂，目前普遍认为食管癌是多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病，然而其发生和发展的确切机制仍不太清楚。在对哈萨克族食管癌高发区流行病学调查工作中，发现哈萨克族食管癌具有家族聚集现象，并且遗传免疫因素在食管癌的发生中起着一定的作用。大量研究表明，人类白细胞抗原Ⅰ类分子(human leukocyte antigenclass Ⅰ，HLA-Ⅰ)表达低下或缺失，可导致肿瘤细胞逃逸宿主免疫监视，从而与肿瘤发生密切相关。HLA-Ⅰ类分子是机体免疫应答信息产生和传递的基础，主要功能是将细胞内源性抗原肽呈递到细胞表面，实现CD8+T细胞对自身抗原的识别和免疫监视。而此内源性抗原肽呈递过程必须在抗原呈递元件(antigen processing machinery，APM)的协助下才能完成。APM成员蛋白是一组抗原呈递相关蛋白，负责协助HLA-Ⅰ类分子组装、负载和提呈内源性抗原肽，介导抗肿瘤的T细胞免疫功能。APM成员蛋白表达下调可影响正常的抗原呈递过程，使肿瘤逃避免疫监视而增加肿瘤发生和发展的风险。DNA甲基化是肿瘤表观遗传学调控的一个重要方式，肿瘤细胞基因组整体水平低甲基化和启动子区高甲基化是已被公认的肿瘤表观遗传性机制。APM基因启动子区的异常甲基化可引发基因表达沉默，导致功能蛋白的表达下调或缺失，从而促进肿瘤的发生和发展，在宫颈癌、膀胱癌、头、颈部肿瘤中已有报道，但有关食管癌的研究很少。本研究拟从表观遗传学角度，以HLA-Ⅰ和APM成员基因为候选基因，利用新疆哈萨克族食管癌病变资源，从基因表达调控层次，分析APM成员基因启动子区异常甲基化与哈萨克族食管鳞癌发生之间的关系。方法：(1)采用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfate sequeneing PCR，BSP)法检测人食管鳞癌ECa109细胞DNA中基因启动子区甲基化位点。利用在线数据库提供的人类基因组计划资源，对HLA-B、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、ERAP1，Tapasin和ERp57等8种基因启动子区设计特异性PCR引物，经基因启动子区目的CpG岛片段的PCR扩增、克隆和测序，获得基因启动子区甲基化相关的序列和CpG位点信息。(2)收集新鲜哈萨克族食管癌及癌旁正常食管组织标本50例，提取组织DNA。选取前一步研究中筛选出来的HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5种基因，利用MassARRAY甲基化检测技术，对候选基因启动子区CpG岛甲基化水平进行定量分析，明确食管癌和癌旁正常组织中总体及单个CpG位点甲基化水平的差异。(3)采用免疫组织化学SP法，检测LMP7、Tapasin、ERp57和HLA-Ⅰ蛋白在食管癌组织中的表达水平。使用SPSS16.0统计分析软件包对数据进行处理，采用非参数秩和检验分析以上4种蛋白表达水平与食管癌患者临床病理特征的关系。采用Spearman等级相关分析检验LMP7、Tapasin、ERp57与HLA-Ⅰ蛋白表达水平的相关性，采用方差分析检验LMP7、Tapasin、ERp57基因甲基化和蛋白表达水平的关系。P值取双侧，以a=0.05为临界值。结果：(1)在人食管鳞癌ECa109细胞DNA中，HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5种基因启动子区的目的CpG岛均发生了不同程度的甲基化，发生甲基化的CpG位点占所有CpG位点的比例分别为10/14、8/8、2/22、5/12和18/18。而TAP1、LMP2、ERAP1等3种基因启动子区没有发现甲基化位点。(2)根据MassARRAY技术对50例哈萨克族食管癌及癌旁正常组织中的甲基化定量检测结果，发现LMP7、Tapasin和ERp57基因在食管癌中的甲基化水平高于癌旁组织(P＜0.05)，HLA-B和TAP2基因在食管癌和癌旁组织中的甲基化水平无差异(P＞0.05)。进行单个CpG位点甲基化水平分析显示：LMP7基因启动子区CpG_5、CpG_9、CpG_20、CpG_21、CpG_22位点；Tapasin基因启动子区CpG_1、CpG_6位点；ERp57基因启动子区CpG_1位点的甲基化水平在食管癌和癌旁正常组织之间存在统计学差异(P＜0.05)。对3种基因甲基化水平与肿瘤临床病理特征进行分析，发现LMP7和ERp57基因甲基化与食管癌患者TNM分期有关，Ⅰ期+ⅠⅠ期组的甲基化水平高于ⅠⅠⅠ期+ⅠV期组；LMP7、ERp57基因甲基化与肿瘤分化程度有关，中、低分化组的甲基化水平高于高分化组；ERp57基因甲基化与肿瘤的血管侵袭性有关，侵袭血管生长组的甲基化水平高于不侵袭血管生长组，以上差异均有统计学意义(P＜0.05)。(3)免疫组化结果显示：食管癌组织中HLA-Ⅰ、Tapasin、LMP7和Erp57蛋白均有明显的表达下调或缺失，与癌旁正常组织相比有统计学意义(P＜0.05)。HLA-Ⅰ蛋白表达下调与肿瘤分化程度、肿瘤侵润深度密切相关；LMP7蛋白表达下调与肿瘤分化程度、肿瘤侵润深度、肿瘤血管侵袭性生长、淋巴结转移、TNM分期密切相关；Tapasin蛋白表达下调与肿瘤分化程度、肿瘤侵润深度密切相关；ERp57蛋白表达下调与淋巴结转移、肿瘤血管侵袭性生长、肿瘤侵润深度、TNM分期密切相关，以上差异均有统计学意义(P＜0.05)。在食管癌组织中，HLA-Ⅰ与LMP7、Tapasin、ERp57蛋白表达水平呈正相关(r值分别为0.823、0.721、0.378，P值均＜0.05)。LMP7、ERp57基因在不同甲基化水平之间的蛋白表达水平差异有统计学意义(P＜0.05)，随着基因启动子区甲基化水平的增高，相应蛋白的表达水平降低。而Tapasin基因在不同甲基化水平食管癌组织中的蛋白表达水平没有统计学差异(P＞0.05)。结论：(1)在人食管鳞癌ECa109细胞中，HLA-B、TAP2、LMP7、Tapasin和ERp57等5种基因启动子区的CpG岛均发生了不同程度的CpG位点甲基化，可能是导致人食管鳞状上皮细胞癌变的重要原因。(2)在新疆哈萨克族食管癌组织标本中，LMP7、Tapasin和ERp57基因甲基化水平异常增高，并与肿瘤的临床病理特征密切相关，是导致哈萨克族食管癌发生的高危因素。LMP7基因启动子区的CpG_5、CpG_9、CpG_20、CpG_21、CpG_22位点；Tapasin基因启动子区的CpG_1、CpG_6位点；ERp57基因启动子区的CpG_1位点与基因的甲基化密切相关，可能是调控相应基因启动子区甲基化的关键位点。(3)在新疆哈萨克族食管癌组织标本中，HLA-Ⅰ、LMP7、Tapasin和Erp57蛋白出现明显的表达下调和缺失，并与食管癌的临床病理特征密切相关，说明HLA-Ⅰ及APM成员蛋白协同参与了食管鳞状上皮的免疫应答，可以防止食管癌的发生，对机体有保护作用。APM成员LMP7、ERp57基因启动子区甲基化，可以抑制基因蛋白表达，影响HLA-Ⅰ分子的组装和呈递，造成HLA-Ⅰ在肿瘤细胞表面的下调或缺失，使肿瘤细胞逃避了机体的免疫监视和杀伤，导致了肿瘤的发生，可能是新疆哈萨克族食管癌发生的表观遗传学机制。
李付广, 金戈, 董子明[5]2006年在《人食管癌Eca-109细胞M_r小于3000膜蛋白肿瘤抗原肽的筛选》文中提出目的:寻找被T细胞识别的食管癌细胞抗原肽,为食管癌免疫治疗奠定基础。方法:应用pH3.3的枸橼酸磷酸盐缓冲液间隔24h多次酸洗贴壁生长的Eca109细胞,获得人主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(HLAⅠ)类分子结合的多肽,经超过滤,反相HPLC色谱层析得到不同组分多肽,DC递呈抗原肽刺激特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应,51Cr杀伤实验检测CTL对肿瘤细胞杀伤作用。结果:Mr小于3000的混合多肽经过反相HPLC可获得50多个组分,混合肽、P17、P29和P41组分体外诱导实验表明可以诱导出较强的CTL反应。结论:酸洗法能有效获得HLAⅠ类分子结合的多肽抗原,Mr小于3000的多肽成分中3个组分存在能引起特异性的抗肿瘤CTL免疫反应的肿瘤抗原,具有潜在的免疫治疗作用。
李付广, 孙涛, 董子明, 杨红艳[6]2004年在《人食管癌Eca-109细胞膜抗原筛选的初步研究》文中研究说明目的 从人食管癌Eca 10 9细胞入手 ,寻找能引起CTL免疫反应的肿瘤抗原 ,筛选出高效肿瘤抗原的大致范围。方法 采用敏感的序列特异性引物 聚合酶链反应 (PCR SSP)来确定Eca 10 9细胞HLA基因分型 ,用HLA血清学分型技术 (Terasaki改良的微量细胞毒试验 )筛选健康志愿者 ;用MTT法测定致敏T细胞的细胞毒活性。结果 Eca 10 9细胞的HLA的基因分型为A 0 3 ,A 2 4;B 3 5 ,B 3 7;DRB1 0 1,DRB1 12 ;DRB3 ;筛选到一例表型为A0 3杂合子的健康志愿者。根据MTT检测 ,Eca 10 9细胞小于 10KD膜蛋白免疫原性较未使用去垢剂的总膜蛋白的免疫原性高 ,小于 3KD膜蛋白的免疫原性最高。结论 Eca 10 9细胞膜蛋白中存在能引起特异性的抗肿瘤CTL免疫反应的肿瘤抗原 ,其中小于 3KD的膜蛋白成分中可能存在人食管癌的高效肿瘤抗原
李付广, 杜英, 孙涛, 杨红艳, 董子明[7]2006年在《人食管癌Eca-109细胞膜蛋白的分离和纯化》文中研究表明目的:建立人食管癌Eca109细胞系膜蛋白分离和初步纯化方法。方法:使用改良的Neville法提取细胞膜,在pH6.3的条件下,用去垢剂TritonX100和辛基β葡糖苷把细胞膜上的蛋白溶解下来,以超滤法纯化膜蛋白并分组。结果:在pH6.3的条件下,适当的去垢剂与膜蛋白质量之比使用去垢剂辛基β葡糖苷时为61;使用TritonX100时为21。超滤法将膜蛋白分为相对分子质量<3000、3000～10000、<10000、10000～30000、30000～100000、>100000共6个组分。结论:获得适当的去垢剂与膜蛋白质量比,并获得了不同的膜蛋白组分,为进一步研究人食管癌Eca109细胞肿瘤抗原奠定了基础。
夏丽洁[8]2014年在《新疆家蚕抗菌肽的优化表达及抗肿瘤机制研究》文中研究表明抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的一类小分子活性多肽,在生物先天免疫及获得免疫中起重要作用。目前,抗肿瘤化疗药物大多会损伤正常细胞,引起严重的副作用,甚至导致耐药性,人们迫切需要开发新型的广谱特效抗肿瘤药物。与传统抗肿瘤药物相比,抗菌肽具有独特的肿瘤细胞选择性杀伤机制和胞膜溶解机制等优势,毒副作用小,使其极有可能成为新一代抗肿瘤药物。但是由于抗菌肽的分子量小,分离纯化困难,从天然资源中提取抗菌肽非常有限;化学合成成本太高,不能满足实际需要;通过基因工程技术在微生物中大量表达抗菌肽极大的促进了抗菌肽的研究和应用。本研究采用实验室前期从新疆家蚕Bombyx mori体内获得的抗菌肽基因,构建至不同的表达载体,通过原核系统和真核系统优化表达获得新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ。采用抑菌圈分析法检测CecropinXJ的最小抑菌浓度,通过透射电子显微镜观察其对多种病原菌的抑杀作用,并对抗菌肽的热稳定性、酸碱稳定性及溶血活性进行研究,结果表明CecropinXJ具有较强的热稳定性,酸碱耐受性和较低的溶血活性。采用MTT法检测CecropinXJ对8株肿瘤细胞及人胚肾上皮正常细胞增殖的影响,筛选出敏感株人食管癌Eca109细胞进行体内外抗肿瘤机制研究。通过扫描电镜,激光共聚焦显微镜观察新疆家蚕抗菌肽对人食管癌Eca109细胞骨架的影响,通过RT-PCR和western blot检测细胞骨架相关基因和蛋白的变化;通过流式细胞仪检测Eca109细胞凋亡率和细胞周期变化情况,扫描电镜、透射电镜、倒置荧光显微镜观察细胞形态学变化,western blot检测凋亡和周期相关蛋白的变化情况;建立裸鼠和Balb/c小鼠Ecal09细胞移植瘤模型,进行实验治疗学观察。通过病理组织学和免疫组化方法,观察相关细胞因子含量的变化。采用肿瘤体积和瘤重等指标,观察CecropinXJ对移植瘤小鼠的抑制效应;通过流式细胞仪检测新疆家蚕抗菌肽联合多种化疗药物对人食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的影响;通过核酸免疫法制备鼠抗新疆家蚕抗菌肽多克隆抗体,激光共聚焦显微镜观察抗菌肽在肿瘤细胞内的定位情况,探讨新疆家蚕抗菌肽的抗肿瘤作用机理。主要研究结果如下:(1)重组原核表达载体pET32a-CecropinXJ在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、培养温度为37℃的条件下诱导5 h,目的蛋白的表达量可达10 mg/L,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,经金属螯合层析进一步纯化后的CecropinXJ融合蛋白纯度可达90%以上。由此实现了 CecropinXJ在大肠杆菌中高效、可溶性表达的目的。通过亲和层析Ni-NTA纯化的重组抗菌肽cecropinXJ在温度范围为4℃到100℃,pH值范围为pH 3.0至12.0内,对金黄色葡萄球菌的抑杀作用具有较高的稳定性。重组抗菌肽CecropinXJ对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.4 μM,同时,可抑制多种人源癌细胞增殖。(2)pYES2/CT/α Factor-CecropinXJ在酿酒酵母INVScl菌株中诱导重组蛋白表达120 h后,总蛋白的分泌量最高可达1.437g/L,重组CecropinXJ约为总蛋白的79.45%。重组CecropinXJ具有广谱的抑菌活性,其对大肠杆菌ATCC25922的最小抑菌浓度为0.81μμM。新疆家蚕抗菌肽通过直接破坏微生物细胞膜的作用方式抑制微生物生长。即使当抗菌肽浓度高达200μm 时,CecropinXJ对红血细胞溶血作用较小。因此,CecropinXJ可选择性地作用于细菌的细胞膜。在温度范围4℃至100℃内,pH值范围为2.0至12.0时,纯化的重组抗菌肽CecropinXJ对大肠杆菌ATCC25922仍保留较高的稳定性。(3)CecropinXJ可诱导Eca109细胞微管,微丝及细胞表面微绒毛结构浓度依赖性损伤,且可抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。同时,CecropinXJ引发的微管解聚与肌动蛋白聚合密切相关,且具有浓度依赖性和时间依赖性下调α-actin,β-actin,γ-actin,α-tubulin和β-tubulin骨架基因的表达。(4)新疆家蚕抗菌肽具有时间和浓度依赖性抑制Eca109细胞增殖,细胞形态学检测观察肿瘤细胞内出现凋亡小体并能使Hoechst 33258荧光染料染色加深,细胞凋亡检测说明CecropinXJ具有诱导细胞凋亡的作用,并使细胞周期阻滞在G2/M期,使细胞内线粒体膜电位下降并使细胞内活性氧水平提高。同时,裂解PARP并导致caspase-3激活,影响细胞凋亡周期相关蛋白的表达。裸鼠移植瘤实验结果表明CecropinXJ对小鼠肿瘤体积增长具有一定的抑制作用,10 mg/kg抗菌肽组与生理盐水对照组相比其抑瘤率具有显着差异(p<0.05),但对小鼠体重及小鼠脾重无显着影响,说明该药物没有明显的毒副作用。(5)建立Balb/c荷瘤小鼠模型,探讨新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ对Eca109细胞荷瘤小鼠作用后,是否通过影响机体免疫应答发挥抗肿瘤作用。移植瘤实验表明,10 mg/kg CecropinXJ对Eca109细胞移植瘤具有显着的抑制作用。10 mg/kg CecropinXJ给药组肿瘤体积和肿瘤重量与生理盐水对照组相比,具有显着差异(p＜0.05)。CecropinXJ抑制肿瘤生长过程中,可抑制肿瘤组织癌细胞的浸润生长现象,上调表达VEGF和bFGF,而对小鼠体内脏器无影响。与对照组相比,CecropinXJ对荷瘤小鼠的抑瘤作用不能够显着促进CD4,IL-4和IFN-y的表达,同时也不涉及脾脏中DCs表面分子的表达(p>0.05),但对TNF-α的表达具有显著的促进作用(p<0.01)。这说明CecropinXJ可以显着抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长,在该过程中,可能并不通过影响机体免疫应答发挥抗肿瘤作用。(6)新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ与化疗药物阿霉素(doxorubicin,ADM)、卡铂(Carboplatin,CBP)、顺铂(Dichloro-Diamineplatinum,DDP)、环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)分别单独用药或联合用药均可抑制Eca109细胞的增殖作用,联合用药组与各药物单独处理组相比,细胞凋亡率,活性氧水平及线粒体膜电位均具有显着性差异(p<0.05)。在体外实验中,抗菌肽与化疗药物ADM、DDP和CTX联用对Eca109细胞具有增殖抑制作用和凋亡诱导作用。新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ与ADM、DDP和CTX联合作用Eca109细胞具有协同作用,而与CBP联合作用Eca109细胞则具有拮抗作用。(7)新疆家蚕抗菌肽处理Eca109细胞不同时间后,分别用抗菌肽抗体和荧光标记的二抗处理,激光共聚焦观察的结果表明,随着抗菌肽作用时间的延长,CecropinXJ首先破坏细胞膜表面微绒毛结构,通过裂解细胞膜逐步向细胞质中渗透,造成细胞内含物泄漏,细胞膜萎缩,最后进入细胞核,杀伤肿瘤细胞。
周剑[9]2018年在《食管癌微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞参与细胞恶性表型的调控机制研究》文中研究说明目的:本研究首先探讨了M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2型TAMs)浸润与食管癌患者预后的相关性,并分析食管癌组织中M2型TAMs浸润的临床病理学意义。其次,通过构建M2型TAMs与食管癌细胞的体外共培养体系,探讨共培养对食管癌上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。最后,收集共培养上清,运用抗体芯片筛选共培养后差异表达的蛋白因子,研究M2型TAMs分泌的蛋白因子对食管癌细胞EMT及迁移、侵袭能力的影响,初步探讨M2型TAMs参与调控食管癌细胞恶性表型的相关分子机制。方法:1)Meta分析食管癌组织中M2型TAMs浸润的临床病理学意义;通过免疫组化(Immuno histo chemical,IHC)染色检测食管癌组织中M2型TAMs的浸润,分析M2型TAMs浸润与患者预后的相关性及M2型TAMs浸润的临床病理学意义;2)构建M2型TAMs与食管癌细胞共培养体系,观察共培养后食管癌细胞的形态学改变,运用q RT-PCR和Western-blot检测共培养后食管癌细胞EMT相关标志物的表达,通过细胞增殖试验(MTT Assay)、细胞迁移试验(Wound-healing Assay)、细胞侵袭试验(Transwell Assay)检测共培养对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响;3)抗体芯片筛选共培养后差异表达的蛋白因子,观察M2型TAMs所分泌的蛋白因子诱导对食管癌细胞形态学改变的影响,运用qRT-PCR和Western-blot检测蛋白因子诱导后食管癌细胞EMT相关标志物的表达,通过MTT试验、Wound-healing试验、Transwell试验分别检测蛋白因子诱导对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,初步探讨M2型TAMs参与调控食管癌细胞恶性表型的相关分子机制。结果:1)Meta分析结果表明,M2型TAMs浸润与食管癌患者淋巴结转移、临床分期及T分期具有统计学相关性。免疫染色结果表明,食管癌及癌旁对照组织中均可见M2型TAMs浸润,M2型TAMs在食管癌中浸润密度明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。临床病理学分析表明,M2型TAMs浸润与食管癌患者淋巴结转移(P=0.018)和T分期(P=0.021)具有统计学相关性(P<0.05),与患者年龄(P=0.862)、性别(P=0.249)、临床分期(P=0.563)、肿瘤直径(P=0.898)无统计学相关性(P>0.05);Kaplan-Meier(K-M)生存曲线分析表明,M2型TAMs浸润与食管癌患者预后呈现出负相关的趋势(P=0.000);2)食管癌细胞与M2型TAMs共培养后发生形态学改变,qRT-PCR和Western-blot结果表明,共培养后食管癌细胞上皮标志物表达减少,而间质标志物表达增加。细胞功能学试验结果表明,共培养后食管癌细胞迁移、侵袭能力增强,而细胞增殖能力无明显改变;3)抗体芯片结果表明,M2型TAMs与食管癌细胞共培养后,IL-1β(上调829.43倍)和MCP2(上调808.41倍)表达明显增加,与非共培养组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。IL-1β和MCP2诱导后,食管癌细胞发生EMT,细胞迁移、侵袭能力明显增强,但IL-1β诱导后食管癌细胞增殖能力无明显改变。此外,Western-blot结果表明,IL-1β和MCP2诱导可激活NF-κB信号通路,使用NF-κB通路抑制剂(BAY11-7082)则可减弱NF-κB信号通路的磷酸化水平。结论:1)M2型TAMs在食管癌组织中的浸润密度明显高于癌旁对照组织,M2型TAMs浸润与患者预后及淋巴结转移、T分期具有统计学相关性;2)M2型TAMs与食管癌细胞共培养,可引起食管癌细胞发生EMT,增强食管癌细胞的迁移和侵袭能力;3)M2型TAMs分泌的IL-1β和MCP2,可引起食管癌细胞发生EMT,增强食管癌细胞的迁移和侵袭能力。M2型TAMs分泌的IL-1β和MCP2有可能通过激活NF-κB信号通路参与调控食管癌细胞的恶性表型。
陈东晓[10]2005年在《负载HPV16E6/18E7基因树突状细胞疫苗的构建及其抗食管癌细胞的体外实验》文中研究说明目的:1、用脐血CD34+细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下体外分化扩增树突状细胞(Dendritic Cell,DC),检测其表面分子CD83的表达以及对T淋巴细胞增殖的影响。2、提取HPV16E6/18E7质粒,并将之转染树突细胞,构建负载HPV16E6/18E7基因的树突状细胞疫苗,检测其目的基因的表达及活化T淋巴细胞的作用。3、测定食管癌细胞EC-109的HPV类型,将负载HPV18E7基因的树突状细胞在体外行抗食管癌实验:观察E7-DC疫苗与T淋巴细胞作用,检测活化后CTL抗肿瘤的细胞毒活力。
参考文献：
[1]. 人食管癌Eca-109细胞膜肿瘤抗原筛选的研究[D]. 李付广. 郑州大学. 2004
[2]. 人食管癌Eca-109细胞膜抗原筛选的初步研究[D]. 孙涛. 郑州大学. 2003
[3]. 人食管癌Eca-109细胞膜肿瘤抗原的筛选[J]. 李付广, 杜英, 孙涛, 董子明. 郑州大学学报(医学版). 2006
[4]. 抗原呈递元件基因甲基化对哈萨克族食管鳞癌发生的作用研究[D]. 郑峰. 新疆医科大学. 2013
[5]. 人食管癌Eca-109细胞M_r小于3000膜蛋白肿瘤抗原肽的筛选[J]. 李付广, 金戈, 董子明. 郑州大学学报(医学版). 2006
[6]. 人食管癌Eca-109细胞膜抗原筛选的初步研究[J]. 李付广, 孙涛, 董子明, 杨红艳. 胃肠病学和肝病学杂志. 2004
[7]. 人食管癌Eca-109细胞膜蛋白的分离和纯化[J]. 李付广, 杜英, 孙涛, 杨红艳, 董子明. 郑州大学学报(医学版). 2006
[8]. 新疆家蚕抗菌肽的优化表达及抗肿瘤机制研究[D]. 夏丽洁. 新疆大学. 2014
[9]. 食管癌微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞参与细胞恶性表型的调控机制研究[D]. 周剑. 新疆医科大学. 2018
[10]. 负载HPV16E6/18E7基因树突状细胞疫苗的构建及其抗食管癌细胞的体外实验[D]. 陈东晓. 汕头大学. 2005
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