姜荣芝[1]2011年在《四种鸡球虫多价DNA疫苗免疫程序及其稳定性研究》文中研究表明鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一,危害比较严重主要有柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫4个种,临床上往往为这4个种的混合感染,因此研制抵抗这4种鸡球虫混合感染的多价疫苗显得十分迫切,本实验室已经构建了抵抗4种球虫的混合多价DNA疫苗和多价多表位DNA疫苗,初步显示了良好的免疫保护效果,为进一步提高多价DNA疫苗的免疫保护效果,本研究对混合多价DNA疫苗的配比进行了优化,对多价多表位DNA疫苗的免疫程序和稳定性进行了研究,如下：本研究第一部分首先在对四种鸡艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗p VAX1.0-TA4-IFN-γ、pVAX1.0-NA4-IL-2、pVAX1.0-Em8-IL-2和pVAX1.0-3-1E-IFN-γ混合免疫程序基础上,对其免疫剂量的最佳配比再进行筛选。将柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IFN-γ,毒害艾美耳球虫(E. necatrix)免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2、巨型艾美耳球虫(E. maxima)免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-Em8-IL-2和堆型艾美耳球虫(E. acervulina)免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-3-1E-IFN-γ按5μg:5μg:5μg:5μg、25μg:25μg:10μg、15μg:35μg:35μg15μg、20μg:50μg:50μg:20μg的剂量混合后免疫雏鸡,试验对各配比剂量设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和四种混合感染各5个试验组及相应的5个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共26组。结果发现免疫剂量混合组15μg:35μg:35μg:15μg组在减少E. tenella、E. necatrix. E. acervulina和四个虫种种混合的免疫保护效果最好,ACI分别为188.50,180.50,180.91和174.59。免疫剂量混合组10μg:25μg:25μg:10μg组对E. maxima感染组的免疫保护效果较好,ACI为181.69。本研究第二部分是将本实验室构建的免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2进行免疫程序筛选,在此基础上再进行稳定性实验。主要包括以下几个方面：1四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫剂量的筛选将免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2分别以2gg、10μg、25μg、50μg、100μg、200μg免疫雏鸡,各剂量分别设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共29组。结果发现,柔嫩艾美耳球虫组免疫保护效果最好的免疫剂量为25μg,ACI为184.5。毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫免疫保护效果最好的免疫剂量均为10μg,ACI分别为184.58、181.27、181.48。2四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫途径的筛选将免疫调节型多价多表位DNA疫苗p VAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2分别以肌肉注射、静脉注射、皮下注射、口服、滴鼻滴眼五个途径免疫雏鸡,各途径分别设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共25组。结果发现,各免疫攻虫组中腿部肌肉注射组ACI均最高。其中腿部肌肉注射攻柔嫩艾美耳球虫组ACI为183.24；攻毒害艾美耳球虫的ACI为184.76；攻巨型艾美耳球虫ACI为181.96；攻堆型艾美耳球虫ACI为174.79。腿部肌肉注射组免疫效果优于其他免疫途经组。3四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗首免日龄和免疫次数的筛选设计了一周龄首免不加强免疫、一周龄首免二周龄加强免疫、二周龄首免不加强免疫和二周龄首免叁周龄加强免疫四个实验组,分别免疫DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2。各程序设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共21组。结果发现,加强免疫组比非免疫组免疫保护效果好,所有加强免疫组的ACI都大于160；二周龄首免组比一周龄首免组免疫保护效果好,二周龄首免叁周龄加强免疫组效果最好。4四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫稳定性实验将免疫调节型多价多表位DNA疫苗p VAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2分别在不同的温度(-20℃、4℃和室温)下分别保存1个月、3个月、6个月,分别免疫雏鸡,各温度组分别设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与2个非免疫非攻虫对照组,共42组。结果发现,所有免疫组的ACI都大于160,说明各保存条件下多价多表位DNA疫苗都具有免疫保护效果,且在叁个不同温度和不同保存时间内能保持相对稳定性。
张贝贝[2]2017年在《细胞因子佐剂对犬透明带3 DNA疫苗免疫小鼠抗生育效果研究》文中认为由于缺乏有效的控制手段,近几十年来全世界范围内流浪动物的数量在快速的增加,并带来了一系列的生态和环境问题,因此,如何有效且人道的控制它们的种群数量迫在眉睫。哺乳动物受精过程中,卵子表面的透明带3(ZP3)蛋白作为精子初级受体,参与精子与卵子的结合并诱发顶体反应。ZP3特异性抗体能够与天然的ZP3结合从而阻断精卵结合导致不育长期以来,人们尝试利用不同类型的不育疫苗、发送途径及免疫佐剂增强ZP3疫苗的免疫反应,以开发出高效的避孕疫苗。DNA疫苗是一种安全、廉价、易于生产及保存的疫苗类型,在病毒性疾病的预防和控制方面得到了广泛的应用。研究表明,DNA疫苗虽然能够激起全面的免疫应答,但其存在的问题是较弱的免疫原性,往往会导致控制及预防效果不理想。本实验室前期的研究结果表明,添加佐剂和发送途径的方式能够有效的激发机体产生全面,有效且持久的免疫反应,因此,为了控制流浪犬的种群数量,以犬ZP3为靶抗原,制备DNA疫苗,并筛选能够改善其免疫原性,增强抗生育效果的佐剂,从而达到控制城市流浪犬数量的目的。增强树突状细胞(dendritic cells,DCs)对DNA疫苗的递呈效率,是提高DNA疫苗免疫原性的关键。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)能够促进包括DCs在内的抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs)对DNA疫苗的加工递呈,继而影响疫苗免疫反应的强度及类型。因此,本研究构建了鼠GM-CSF重组真核表达载体,通过尾静脉注射方式转染小鼠并用RT-PCR方法检测,确认了GM-CSF重组质粒在动物细胞中的有效表达。为验证GM-CSF对包括DCs在内的APCs递呈抗原活性的影响,将GM-CSF提前4d或同时与CZP3 DNA疫苗肌肉注射小鼠,检测共刺激因子CD80、CD83、CD86的表达情况。结果表明,GM-CSF能够促进肌肉注射部位及脾脏组织中共刺激因子的表达,GM-CSF与CZP3 DNA疫苗同时注射时共刺激因子表达水平最高。因此,GM-CSF能够促进APCs的成熟,增强DNA疫苗的免疫原性,GM-CSF和CZP3 DNA疫苗同时注射的共免疫策略可以用于后续不育疫苗的研究。此外,由2型辅助性T细胞(type 2 T helper cell,Th2)分泌的白细胞介素-5(interleukin-5,IL-5)在诱导体液免疫方面表现突出。为了探究GM-CSF和IL-5作为免疫不孕佐剂改善犬透明带3 DNA疫苗免疫原性,增强免疫反应及并抗生育可行性。将重组真核质粒pc DNA3-IL-5和pc DNA3-GM-CSF作为pc DNA3-CZP3佐剂,采用电脉冲单独或者是联合的方式免疫雌性BALB/C小鼠。,其中pc DNA3-GM-CSF和pc DNA3-C ZP3+pc DNA3-GM-CSF+pc DNA3-IL-5免疫组效果最为明显(P<0.01)。不同免疫组血清中IL-4和IFN-γ含量的检测结果表明,细胞因子作为免疫佐剂在不同程度上都增强了被免疫小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应的强度,pc DNA3-GM-CSF+pc DNA3-CZP3免疫组,pc DNA3-GM-CSF+pc DNA3-IL-5+pc DN A3-CZP3免疫组的IL-4和IFN-γ的含量都和极显著高于(P<0.01)对照组。脾脏T细胞增殖实验结果表明,pc DN-A3-IL-5、pc DNA3-GM-CSF、和pc DNA3-CZP3+pc DNA3-GM-CSF免疫组的脾脏T细胞增殖显着(P<0.05)和极显着的(P<0.01)高于对照组。产仔率数目和抗体滴度之间的斯皮尔曼相关性分析结果表明,pc DNA3-GM-CSF+pc DNA3-CZP3免疫组抗体水平小鼠的生育率之间的负相关性最好,pc DNA3-GM-CSF+pc DNA3-IL-5+pc DNA3-CZP3免疫组抗体水平小鼠的生育率之间的负相关性次之。与pc DN A3和pc DNA3-CZP3免疫组相比,窝崽数分别下降了16%、27%、44%和68%以及13%、33%和62%。为了检测血清中CZP3抗体与卵细胞结合的能力,以及这种结合对受精产生的实际影响,并探讨它与抗生育之间的联系。采用间接免疫荧光和体外受精的方法进行了验证。间接免疫荧光实验结果表明,小鼠卵细胞表面的荧光强度和致密度与血清中抗体水平呈现明显的正相关,并且抗体滴度和卵细胞结合效果较好的免疫组,pc DN-A3-IL-5+pc DNA3-CZP3pc DNA3-GM-CSF+pc DNA3-CZP3和pc DNA3-GM-CSF+pc DNA-3-IL-5+pc D NA3-ZP3受精率都发生了显着和极显着的降低,与pc DNA3和pc DNA3-CZ P3免疫组相,比分别下降了18%、23%、49%和66%以及17%、33%和59%。这与小鼠生育率结果也是一致的。虽然,这些结果对于解释抗体通过发挥阻断效应降低生育率的理论具有片面性,但在它们在一定程度上证明了了增强体液免疫反应对于抗生育的必要性。结论:GM-CSF可以促进抗原递呈细胞的成熟,作为佐剂增强了CZP3 DNA疫苗的体液免疫反和细胞免疫反应,显着的降低了免疫小鼠的窝崽数。当GM-CSF联合IL-5作为CZP3 DNA疫苗佐剂可进一步提高抗体水平并降低免疫小鼠的窝崽数。因次可以确定GM-CSF和IL-5联合使用作为今后犬类实验的最佳策略。
宋小凯[3]2008年在《柔嫩艾美耳球虫免疫调节型多价DNA疫苗的构建及免疫效果观察》文中研究指明对柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的免疫剂量进行筛选。设计了200μg、100μg、50μg、25μg四个剂量组以及非免疫攻虫和非免疫非攻虫两个对照组。按照相应的免疫剂量,实验组14日龄腿部肌肉注射DNA疫苗pcDNA-TA4-IL-2,21日龄加强免疫,对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×10~4个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,25μg和50μg组的ACI分别为196.45和182.67,免疫保护效果明显;100μg组的ACI为172.16,免疫保护效果一般;200μg组的ACI为157,无免疫保护效果。对柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的免疫途径进行筛选。设计了皮下注射、口服、静脉注射、肌肉注射、滴鼻滴眼五个实验组以及非免疫攻虫和非免疫非攻虫两个对照组。14日龄,实验组每只鸡按相对应的途径免疫接种25μg DNA疫苗,21日龄加强免疫,对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×10~4个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,所有实验组的ACI都大于160。静脉注射组、皮下注射组和滴鼻、滴眼组的ACI分别为173.38、171.44、168.17,免疫保护效果一般。口服组的ACI为180.17,免疫保护效果明显。腿部肌肉注射组ACI最高,达到193.97,免疫保护效果最好。对DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的首免日龄和免疫次数进行筛选。设计了一周龄首免不加强免疫、一周龄首免二周龄加强免疫、二周龄首免不加强免疫、二周龄首免叁周龄加强免疫四个实验组以及非免疫攻虫和非免疫非攻虫两个对照组。按照相应的免疫日龄与次数,实验组每只鸡经腿部肌肉注射25μg DNA疫苗,对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×10~4个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,所有实验组的ACI都大于160,其中一周龄首免组比二周龄首免效果好;加强免疫组比非加强组效果差别不大;一周龄首免,二周龄加强免疫组效果最好。对DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的稳定性进行了研究。DNA疫苗在不同的温度(即-20℃、4℃和室温)下保存分别保存了1个月、3个月、6个月。分别用这些在不同条件保存过的DNA疫苗腿部肌肉注射免疫7日龄鸡,14日龄加强免疫。对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×10~4个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,所有实验组的ACI都大于160,说明在本实验中所有DNA疫苗都有免疫保护效果。随着保存期的延长,疫苗的免疫保护效果稍有下降。随着保存温度的不同,疫苗的保护效果稍有变化。说明DNA疫苗在6个月内受温度和保存期影响小。对DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2的交叉免疫保护行进行了研究。7日龄雏鸡经腿部肌肉注射DNA疫苗DNA25μg/羽,14日龄加强免疫.对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余分别经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫孢子化卵囊5×10~4个/羽。7天后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果发现,柔嫩艾美耳球虫DNA疫苗pcDNA3.1-TA4-IL-2对毒害艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫感染有部分交叉免疫保护作用,对巨型艾美耳球虫感染没有交叉免疫保护作用。利用DNAstar软件对柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段抗原基因SO7和第二代裂殖子阶段抗原基因MZ5-7进行表位分析,选定T细胞表位比较集中的片断。结果显示,ml为MZ5-7基因的第115位到第435位的321个核苷酸,编码107个氨基酸;m2为MZS-7基因的第547位到第897位的351个核苷酸,编码117个氨基酸;s1为SO7基因的第7位到第291位的285个核苷酸,编码95个氨基酸;s2为SO7基因的第370位到第609位的240个核苷酸,编码80个氨基酸。根据所构建的重组质粒对酶切位点以及对阅读框的不同要求,利用软件primer premier5.0设计若干对特异性引物,分别以pMD18-T-SO7和pMD18-T-MZ5-7为模板,PCR扩增得到m1、m2、s1和s2,分别连入pMD18-T载体。鉴定结果显示,各个片断成功克隆到pMD18-T载体中。把s1、s2、m1和m2,以不同的组合克隆到pVAX1载体中,构建了多价表位DNA疫苗:pVAX1-m1-m2-s1-s2、pVAX1-m1-s1、pVAX1-m1-s2、pVAX1-m2-s1、pVAX1-m2-s2;表位DNA疫苗:pVAX1-m1、pVAX1-m2、pVAX1-s1和pVAX1-s2。分别连接chIFN-γ和chIL-2作为基因佐剂构建了免疫调节型多价表位DNA疫苗:pVAX1-m1-m2-s1-s2-IFN□、pVAX1-m1-m2-s1-s2-IL2、pVAX1-m1-s1-IFN□、pVAX1-m1-s1-IL2、pVAX1-m1-s2-IFN□、pVAX1-m1-s2-IL2、pVAX1-m2-s1-IFN□、pVAX1-m2-s1-IL2、pVAX1-m2-s2-IFN□和pVAX1-m2-s2-IL2。酶切鉴定正确后,分别用重组质粒免疫7日龄鸡,1周后取注射部位、非注射部位肌肉组织,用RT-PCR,Western-blot检测保护性抗原的表达情况。结果表明,目的基因片段均能在注射部位肌肉里成功表达。对已构建好的19种重组质粒进行动物免疫保护性实验.设计了10个免疫调节型多价表位DNA疫苗组:pVAX1-m1-m2-s1-s2-IFN□、pVAX1-m1-m2-s1-s2-IL2、pVAX1-m1-s1-IFN□、pVAX1-m1-s1-IL2、pVAX1-m1-s2-IFN□、pVAX1-m1-s2-IL2、pVAX1-m2-s1-IFN□、pVAX1-m2-s1-IL2、pVAX1-m2-s2-IFN□、pVAX1-m2-s2-IL2;5个多价表位DNA疫苗组:pVAX1-m1-m2-s1-s2、pVAX1-m1-s1、pvAX1-m1-s2、pVAX1-m2-s1、pVAX1-m2-s2;4个表位DNA疫苗组:pVAX1-m1、pVAX1-m2、pVAX1-s1、pVAX1-s2;3个对照组:pVAX1空载体、非免疫非攻虫和非免疫攻虫对照组。用这19种重组质粒经腿部肌肉分别于14、21日龄两次免疫雏鸡(100μg/只),空载体对照组注射pVAX1,另两个对照组注射TE。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余鸡均经口接种新鲜的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×10~4个/羽。一周后剖杀所有实验鸡,检测其免疫保护效果。结果表明,所构建的免疫调节型DNA疫苗对感染球虫鸡具有良好的保护效果。多价表位DNA疫苗诱导的免疫保护效果比单一阶段的DNA疫苗诱导免疫保护效果好,并且含有的表位越多,其免疫保护效果也越好。串联有细胞因子的免疫调节型多表位DNA疫苗的免疫保护效果比没有串连细胞因子的多表位DNA疫苗的免疫保护效果好,连接IFN□的DNA疫苗的免疫保护效果比连接IL-2的DNA疫苗的免疫保护效果好。其中以pVAX1-m1-m2-s1-s2-IFN□的免疫保护效果最好。
张强哲[4]2003年在《H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究》文中提出禽流感是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病，严重威胁世界各地的养禽业，常常造成巨大的经济损失，尤其是H5、H7亚型引起的高致病力禽流感是养禽业的一种毁灭性疾病。血凝素(Hemagglutinin，HA)是禽流感病毒的重要的保护性抗原，是构建DNA疫苗的首选基因。本实验对禽流感HA DNA疫苗做了研究，主要包括HA基因真核表达质粒的构建表达、HA DNA疫苗的BALB/C小鼠免疫和攻毒保护实验、HA DNA疫苗的SPF鸡免疫和攻毒保护实验等叁方面的内容。 1．禽流感病毒HA基因真核表达质粒的构建与表达。HA基因是禽流感病毒重要的保护性抗原基因。为了研究HA基因疫苗，用PCR扩增H5亚型禽流感病毒HA基因，将其克隆到质粒pcDNA4/HisMax和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5。采用Tfx~(TM)-20、Superfect转染试剂和电转染法转染Hela细胞，转染后的Hela细胞经Western Blotting和血凝试验检测HA蛋白及其活性。结果表明，Superfect转染和电转染均能正确表达HA蛋白并具有生物学活性，Western Blotting检测到HA和HA裂解的HA1和HA2，与禽流感病毒的HA、HA1、HA2蛋白的分子量一致。从血凝试验结果看，Superfect和电转染表达的HA均具有血凝活性，而经Superfect转染的pC4H5的表达量是pCMVH5的8倍，表明pC4H5是一高效的真核表达质粒。 2．HADNA疫苗的小鼠免疫和攻毒保护实验。将构建好的真核表达质粒pC4H5和pCMVH5采用电击和肌肉注射免疫小鼠，电击条件为电压200V/cm，脉冲数8个(+4，-4)，脉冲时间40ms,质粒用量为30μg/只。第3周以相同的条件加强免疫一次，第5周用戊巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠，以10~(5.8)ELD_(50)的H5亚型的禽流感病毒经滴鼻进行攻毒。在实验期间进行了小鼠抗HA的IgG抗体、淋巴增值实验。CTL实验、CD4~+和CD8~+分型、IFN-γ及IL-4细胞因子等免疫指标的检测。结果为，电击组小鼠在第2周产生抗体，肌肉注射组在第4、5周产生抗体，电击组优于肌肉注射组，淋巴增值实验和CTL实验表明，第4周机体的细胞免疫被激活，攻毒后细胞免疫进一步活化。CD_4~+/CD_8~+比率及血清中细胞因子IFN-γ、IL-2随着免疫次数的增加，呈现逐步升高趋势，2种质粒免疫鼠之间差异不显着(p＞0.05)，但实验组与对照组相比差异显着(p＜0.05)，说明构建的DNA疫苗能激活机体的免疫系统。 攻毒后，对照组小鼠在攻毒后第9、10d死亡，并且自始至终均能分离到病毒。而电击组和肌肉注射组小鼠均能获得保护，但电击组在攻毒后第5、7、16d肺脏中均分离不到病毒。肌肉注射组在第5d均能分离到病毒，第7d部分小鼠能分离到病毒，第16d分离不到病毒。结果表明，电击免疫明显优于肌肉注射，说明电击免疫是一种比较理想的免疫方法。H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究 3.HA DNA疫苗的sPF鸡免疫和攻毒保护实验。我们采用30林岁只和50林留只两个剂量，经肌肉注射和电击法免疫SPF鸡，每周检测SPF鸡的HA抗体，二免后第二周用1价ZELDS。的HS亚型禽流感病毒攻毒。结果为，电击法免疫sPF鸡在第2周产生抗体，再次免疫后抗体水平明显升高，50卜留只的肌肉注射组在第4周产生微量抗体。 攻毒保护结果为，30林岁只和50“g/只两个剂量的电击免疫组对鸡的保护率分别为83.3%和100%，而肌肉注射组不能保护攻毒剂量的HS亚型禽流感病毒的攻击。说明电击免疫是一种比较理想的免疫方法。
邹广珍[5]2016年在《一株ALV-J全基因序列分析及其RNAi重组腺病毒与DNA疫苗的试验研究》文中研究说明禽白血病(avian leukosis, AL)是一种能引起禽类免疫抑制的肿瘤性疾病,由禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV)引起,其中J亚型禽白血病病毒(subgroup J ALV, ALV-J)是目前养鸡业最为常见、危害最为严重的亚群。鸡群感染ALV后,可能会出现生产性能降低、免疫水平下降、出血、肿瘤和生长迟缓等病症。目前并没有很好的预防和治疗ALV感染的疫苗和药物,主要依赖种群的净化。为了辅助净化工作,课题组构建了一个DNA疫苗和一个RNAi的重组腺病毒,本课题将通过动物试验来验证它们的实际效果。另外从临床发病鸡分离鉴定了一株ALV-J并进行了全基因序列分析。本课题从广东某鸡场临床发病的病鸡体内采集病料,应用DF-1细胞培养分离病毒,通过对培养物的IFA、ELISA和PCR检测,确定获得一株ALV-J,命名为GDMMo通过特异性引物扩增获得并完成了对该分离株的全基因组序列测定,经与14个来自两广地区的分离株及国内其他地方的参考株进行比较分析,发现该分离株与广西分离株GX14ZS14、GX14HG04及广东参考株GDQY1201等之序列的相似性很高,尤其与GX14ZS14株的核苷酸相似性高达96.8%,且系统进化树上与GX14ZS14亲缘关系最近,同属一分支。为验证课题组制备的RNAi重组腺病毒pAd-gp85-shRNA2对鸡体内ALV-J感染的干扰效果,选择蛋清p27抗原阳性且血浆病毒分离呈阳性的种鸡群作为实验对象,其中实验组(28只产蛋母鸡)接种重组腺病毒100μL (1.6×109PFU)／只、对照组(28只产蛋母鸡)注谢PBS 100μL。分别检测试验前后母鸡的体重、其后代雏鸡胎粪的p27抗原阳性率；同时在试验后采集母鸡的蛋清进行p27抗原检测和抗凝血进行病毒分离培养；接种后每周采集实验组和对照组各5只母鸡的抗凝血和分泌物,对ALV-J和重组腺病毒分别进行定量检测。结果发现,实验组和对照组母鸡的体重无显着差异；实验组母鸡蛋清p27抗原阳转阴和血毒阳转阴的个体均为25%,后代雏鸡胎粪p27抗原阳转阴的个体有19%；在接种后2w,母鸡体内的ALV-J拷贝数最少、重组腺病毒对ALV-J的干扰效率也最高,可达68%；接种后4w,母鸡体内仍可检测到重组腺病毒,与接种后4w时实验组ALV-J拷贝数比对照组少的结果相一致,说明重组腺病毒在接种后4w仍能对母鸡体内的ALV-J发挥干扰作用。为验证课题组构建的DNA疫苗PVAX1-Ub1-gp85-p27-p10诱导接种母鸡产生抗体及其后代雏鸡产生母源抗体的效果,选择蛋清p27抗原检测阴性且ALV-J抗体也是阴性的产蛋母鸡作为实验对象。实验组(25只产蛋母鸡)接种DNA疫苗、对照组(25只产蛋母鸡)注射PBS,2w后以同样剂量重复注射一次。试验前后分别称量母鸡的体重、检测免疫母鸡血清中的抗体及其后代雏鸡血清中ALV-J的母源抗体。结果发现,实验组与对照组母鸡的体重无显着差异,有28%的免疫母鸡(7只)和8%(2只)母鸡之后代小鸡的抗体出现阴转阳。本课题研究的结果表明,从临床发病鸡成功分离到一株ALV-J并完成了其全基因序列的测定与分析；通过动物试验证明,课题组研发的重组腺病毒介导的RNAi能有效地干扰ALV-J在鸡体内的复制；研发的DNA疫苗可刺激产蛋母鸡产生抗体并诱导其后代雏鸡母源抗体的生成。
李再新[6]2003年在《细胞白介素2影响小鼠卵透明带3（mZP 3）DNA疫苗免疫效果的研究》文中提出卵透明带3(ZP3)是一种丝状卵透明带糖蛋白，是精子的受体。以ZP3为抗原可激发机体产生免疫反应，阻止精卵结合，控制物种的生育能力。然而，当前的ZP3疫苗仍面临着两个主要的问题：一是利用ZP3蛋白疫苗免疫雌性动物时，有些雌性动物除了生育能力降低外，常伴随卵巢炎发生。根据现有的研究表明：可能是在ZP3糖蛋白上至少有两个T细胞介导的抗原决定簇，诱发卵巢炎；二是在研究和实际应用中很难获得足够专一的ZP3糖蛋白作为可行的免疫原，且该蛋白疫苗较难制作。然而人们又迫切需求一种安全、高效、无遗传制约、生产工艺简单和便于使用的不育疫苗。 在本研究中，我设计了将mZP3基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中表达原核蛋白；通过真核细胞的瞬时表达系统验证pcDNA3-mZP3+pcDNA3-mIL2质粒中mZP3基因的表达水平；以pcDNA3-mZP3为疫苗，pcDNA3-mIL2为佐剂免疫小鼠，半定量PCR技术检测免疫小鼠卵巢内反映ThO细胞转化成Th1或Th2细胞程度的IL-4和INF-γ的基因表达水平，探讨小鼠体内细胞免疫应答规律；以原核表达的mZP3蛋白作为标准ELISA检测的抗原，评价B细胞激活产生特异性抗体的水平。用组织病理学技术评价小鼠卵巢损伤状况和小鼠潜在的不育性及卵巢炎的病理程度，所有数据用t-检验和齐性分析。 将mZP3基因的原核表达表达的结果，经SDS-PAGE电泳分析，在76kD位置上可见到与预计的鼠透明带3(mZP3)蛋白质数值一致的特异条带，并获得mZP3蛋白，为mZP3抗体的检测提供抗原。pcDNA3-mZP3和pcDNA3-mIL2的mZP3和mIL2基因在COS-7细胞中的高效表达，为pcDNA3-mZP3作为候选免疫原提供了有力的证据。免疫实验的结果表明：在 细胞自介亲 2影响小鼠卵透明带3（mZP 3 IDNA疫苗免疫效果的研究 80pcDNA3－mZP3免疫时能有效的产生免疫反应，降低小鼠的生殖能力，但伴随了严重的卵巢炎发生。用质粒pcDM3－mILZ辅助pCDNA3－InZP3疫苗兔疫的小鼠维持了pCDNA3－InZP3免疫产生的抗体高水平，卵泡发育的异常，和降低小鼠的生殖能力；该免疫技术尤其导致了卵巢中的 IL斗基因和 IFN－Y基因较高水平表达，卵巢损伤轻微，克服了严重的卵巢炎，并且该实验结果也反映了mILZ基因的表达可能调和了T细胞介导而引起的严重的卵巢炎。同时实验结果也表明高抗体水平与卵巢自身免疫性疾病之间的关系不成正相关性而值得深入探究。
徐立新[7]2009年在《鸡4种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗交叉免疫保护性研究》文中研究指明鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳球虫(Eimeria)引起的一种严重危害养禽业发展的寄生原虫病。传统的药物防制方法存在耐药性、药物残留等问题。而DNA疫苗具有保存时间长,不涉及致病核酸序列,能诱导机体产生全面的免疫应答等优点。因而鸡球虫DNA疫苗的研究受到众多研究者的关注,并获得了很多对球虫具有保护性的抗原基因。本实验室已从柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)、毒害艾美耳球虫(E. necatrix)和堆型艾美耳球虫(E. acervulina)孢子化卵囊分别克隆得到免疫保护性抗原基因TA4、NA4和3-1E,并利用DNA重组技术成功构建了免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IFN-γ、pVAX1.0-NA4-IL-2和pVAX1.0-3-1E-IFN-γ,且试验表明这叁种DNA疫苗对本种球虫感染均具有较好的免疫保护作用。同时也已从巨型艾美耳球虫(E. maxima)孢子化卵囊中克隆得到免疫保护性抗原基因EmTFP250的全长8个片段,并用DNA重组技术将各片段的pcDNA4.0连接成免疫调节型DNA疫苗,并证明各片段对巨型艾美耳球虫都具有一定的免疫保护作用。本实验利用其中Em8片段构建了免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-Em8-IL-2.将E. tenella免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IFN-γ经腿部肌肉分别于14、21日龄两次免疫雏鸡,28日龄经口接种新鲜的E. tenella、E. maxima、E. necatrix和E,acervulina孢子化卵囊5×104个/羽、10×104个/羽、5×104个/羽和10×104个/羽。7日后宰杀全部实验动物,分别作增重、存活率、肠道病变计分、肠道卵囊计数指标测定,以抗球虫指数(ACI)综合判定其综合免疫交叉保护性。结果表明,E. tenella DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IFN-γ对E. maxima和E. acervulina感染有部分交叉免疫保护作用,对感染E. necatrix没有交叉免疫保护作用。用上述同样的方法将E. maxima免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-Em8-IL-2对E.tenella、E. necatrix和E. acervulina感染的交叉免疫保护行进行了研究。结果表明,E.maxima DNA疫苗pVAX1.0-Em8-IL-2对E. tenella感染有部分交叉免疫保护作用,对感染E. necatrix和E. acervulina没有交叉免疫保护作用。用上述同样的方法将E. necatrix免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2对E.tenella、E. maxima和E. acervulina感染的交叉免疫保护行进行了研究。结果表明,E.necatrix DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2对E. tenella、E. maxima和E. acervulina感染有部分交叉免疫保护作用。用上述同样的方法将E. acervulina免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-3-1E-IFN-γ对E. tenella、E. maxima和E. necatrix感染的交叉免疫保护行进行了研究。结果表明,堆E. acervulina DNA疫苗pVAX1.0-3-1E-IFN-γ对E. tenella、E. maxima和具有部分交叉免疫保护作用,而对E. necatrix没有交叉免疫保护作用。用上述同样的方法将E. tenella免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IFN-γ、E. maxima免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-Em8-IL-2、E. necatrix免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2. acervulina免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-3-1E-IFN-y以1:1：1:1混合后对E. tenella、E. maxima、E. necatrix和E. acervulina感染的免疫保护行进行了研究。结果表明,4种艾美耳球虫混合DNA疫苗对E. tenella、E. maxima和E.necatrix具有部分免疫保护作用。
谭兵[8]2009年在《四川山地乌骨鸡GM-CSF和MDV的VP22的克隆表达及对IBV DNA疫苗佐剂效应研究》文中研究表明粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)是一个具有多项潜能的造血生长因子,不仅能刺激造血祖细胞增殖分化和成熟,而且还能活化树突状细胞及其他单核细胞,在免疫反应中具有重要作用,许多研究证实GM-CSF与DNA疫苗联合免疫,能有效增强DNA疫苗所诱导的免疫应答。马立克病毒(Marek's disease virus,MDV)的VP22蛋白具有独特的蛋白转导特性,能通过非经典途径从原始表达细胞转导到邻近的非表达细胞中,而且VP22还能使与之融合的外源蛋白在细胞间转导,已被证实具有免疫增强作用。本试验成功克隆了四川山地乌骨鸡GM-CSF基因和MDV的VP22基因,研究了它们对IBV核酸疫苗的佐剂效应,具有重要的学术价值和应用前景,主要研究包括:1.根据GenBank上注册的GM-CSF基因(登录号:AJ621740)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从ConA刺激的四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增出鸡GM-CSF基因,克隆入pGEM-T载体,进行序列测定与分析。结果表明,克隆的四川山地乌骨鸡GM-CSF基因全长为435bp,编码144个氨基酸残基。序列分析发现四川山地乌骨鸡GM-CSF(chGM-CSF)基因与其他品种鸡GM-CSF基因核苷酸同源性为99%左右,氨基酸同源率为98%左右,与哺乳动物GM-CSF基因的氨基酸同源性低于30%。蛋白二级预测发现山地乌骨鸡主要含4个α-螺旋,α-螺旋总含量高达55.2%,多处无规卷曲(coil),含量高达36.5%,含有2个β-折迭(strand),含量仅为8.3%,与哺乳动物的GM-CSF二级结构相似,也具有4个α-螺旋,2个β-折迭。四川山地乌骨鸡GM-CSF克隆及序列分析未见相关报道。2.通过PCR方法扩增出不含信号肽的四川山地乌骨鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a(+),经酶切和测序鉴定正确后,转化入BL21大肠杆菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳结果显示融合重组chGM-CSF蛋白主要以包涵体的形式表达,大小约为34 kD左右。通过镍离子金属螯合柱(Ni-NTA)进行重组蛋白纯化,采用纯化后重组蛋白免疫新西兰兔制备兔抗鸡GM-CSF蛋白的多克隆抗体。ELISA结果显示,制备的抗体效价达到了1:3200,Western Blot表明,制备的多克隆抗体能特异性与鸡GM-CSF重组蛋白结合,具有良好的反应原性。本研究获得的chGM-CSF重组蛋白及其多克隆抗体,为研究鸡GM-CSF蛋白生物学功能等提供关键的材料,国内外未见四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的原核表达及抗体制备的相关报道。3.通过酶切、连接等方法,将四川山地乌骨鸡GM-CSF基因亚克隆到真核表达载体pVAX1上以构建质粒pVAX1-chGM-CSF,利用菌落PCR和酶切对重组质粒进行鉴定,采用脂质体法转染哺乳动物COS-7细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和RT-PCR检测质粒在体外的表达情况,收集质粒转染70 h后上清中表达蛋白,通过骨髓细胞增殖试验检测表达的chGM-CSF蛋白的生物学活性。RT-PCR结果显示转染了pVAX1-chGM-CSF质粒的COS-7细胞中能特异性扩增出GM-CSF基因片断,间接免疫荧光分析表明转染了pVAX1-chGM-CSF质粒的COS-7细胞显示出苹果绿荧光,而转染了空质粒pVAX1的细胞则没有显示出任何特异荧光。骨髓细胞增殖试验表明chGM-CSF蛋白能明显促进鸡骨髓细胞的增殖,这些结果为研究chGM-CSF对DNA疫苗佐剂效应提供了关键材料和奠定了理论基础,目前国内未见在COS-7细胞中表达四川山地乌骨鸡GM-CSF及表达蛋白活性分析的相关报道。4.本研究根据发表的马立克病毒VP22的序列(登录号:L10283),设计了一对特异性引物,采用PCR方法从MDV弱毒株的基因组中扩增VP22基因。再根据IBV结构基因S1、M、N序列(登录号:DQ288927),设计引物通过PCR方法扩增出IBV结构基因S1、M、N,分别克隆入真核表达载体pVAX1,酶切鉴定正确后,再通过双酶切,电泳胶回收后与同样酶切处理的VP22片断相连,构建融合表达质粒pVAX-VP22/S1、pVAX-VP22/M、pVAX-VP22/N,酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,转染40 h后,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组蛋白在COS-7细胞中的表达。RT-PCR检测结果显示转染了融合表达质粒的COS-7细胞中分别扩增出S1、M、N基因片断,间接免疫荧光分析表明转染了融合表达质粒的COS-7细胞显示苹果绿荧光,而转染了空质粒pVAX1的细胞则没有显示出任何特异荧光。目前国内外未见马立克病毒VP22基因与IBV结构蛋白基因融合表达载体的构建及在COS-7细胞中表达的研究报道。5.为研究chGM-CSF及VP22基因对IBV DNA疫苗的佐剂效应和比较chIL-2、chIL-8、chGM-CSF对DNA疫苗的佐剂效应差异,将大量提取的真核表达质粒,纯化后分别与脂质体溶液混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄雏鸡,21日龄加强免疫一次。在免疫前和免疫后0、7、14、21、28 d采血检测ELISA抗体效价和外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量,并在二免后第10d,采用MTT、法检测脾淋巴细胞增殖水平。二免两周后用IBV强毒进行攻毒,观察两周,记录发病及死亡情况,评价疫苗免疫保护力。抗体水平检测结果显示, VP22融合疫苗组pVAX-VP22/S1、pVAX-VP22/M、pVAX-VP22/N产生的抗体水平一直高于对照组pVAX-S1、pVAX-N、pVAX-M,从免疫后第14 d开始,差异显着(P＜0.05),chGM-CSF分子佐剂组pVAX-chGM-CSF+pVAX-S1、pVAX-chGM-CSF+pVAX-N、pVAX-chGM-CSF+pVAX-M抗体水平从免疫后第7 d开始明显高于对照组pVAX-S1、pVAX-N、pVAX-M,且差异显着(P＜0.05),chGM-CSF+pVAX-S1疫苗组产生的抗体水平高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1疫苗组,从免疫后第7 d开始差异显着(P＜0.05);脾淋巴细胞增殖实验显示,VP22融合疫苗组和chGM-CSF分子佐剂组都能有效刺激脾淋巴细胞的增殖,增殖指数高于对照组,且差异显着(P＜0.05),chGM-CSF+pVAX-S1疫苗组淋巴细胞增殖指数高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1组,且差异显着(P＜0.05),其中pVAX-chGM-CSF+pVAX-S1组增殖指数最高,平均值达2.83;外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示,VP22融合疫苗组淋巴细胞亚群数量免疫后高于对照组,在免疫后21 d开始,差异显着(P＜0.05),chGM-CSF分子佐剂组在免疫后明显高于对照组,从免疫后第7 d开始差异显着(P＜0.05),chGM-CSF+pVAX-S1疫苗组免疫后明显高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1组,从免疫后第7d开始差异显着(P＜0.05);攻毒结果表明,chGM-CSF分子佐剂组保护率介于80～90%,高于VP22融合表达的疫苗组的75～80%和对照组65～75%,其中pVAX-chGM-CSF+pVAX-S1为所有组最高,达到了90%,也高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1的85%和80%。这些结果表明,chGM-CSF、VP22作为分子免疫佐剂能提高IBV DNA疫苗体液和细胞免疫水平,提高疫苗的攻毒保护率,chGM-CSF对IBVDNA疫苗免疫增强效应要略优于chIL-2、chIL-18。本研究开展的四川山地乌骨鸡GM-CSF和MDV的VP22基因的克隆、表达以及对IBV核酸疫苗佐剂效应的研究,为进一步研制新型、高效、安全禽类DNA疫苗的分子佐剂提供理论依据。
马晓林[9]2013年在《细胞因子影响鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究》文中研究说明哺乳动物受精过程中,卵子表面的透明带3(ZP3)蛋白作为精子初级受体,参与精子与卵子的结合并诱发顶体反应。ZP3特异性抗体能够与天然的ZP3结合从而阻断精卵结合导致不育。利用ZP3作为抗原制备的疫苗来诱导免疫不育是人类理想的避孕手段,也是控制动物生育的人道之选。长期以来,人们尝试利用不同类型的不育疫苗、发送途径及免疫佐剂增强ZP3疫苗的免疫反应,以开发出高效的避孕疫苗。DNA疫苗是一种安全、廉价、易于生产及保存的疫苗类型,在病毒性疾病的预防和控制方面得到了广泛的应用。本实验室前期的研究结果表明,肌肉注射和滴鼻免疫鼠ZP3 (mZP3) DNA疫苗均能导致小鼠不育,但DNA疫苗激发的体液免疫反应较弱,需要通过添加免疫佐剂来增强免疫不育的效果。增强树突状细胞(dendritic cells, DCs)对DNA疫苗的递呈效率,是提高DNA疫苗免疫原性的关键。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)能够促进包括DCs在内的抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APCs)对DNA疫苗的加工递呈,继而影响疫苗免疫反应的强度及类型。因此,本研究构建了鼠GM-CSF重组真核表达载体,通过尾静脉注射方式转染小鼠并用RT-PCR方法检测,确认了GM-CSF重组质粒在动物细胞中的有效表达。为验证GM-CSF对包括DCs在内的APCs递呈抗原活性的影响,将GM-CSF提前4d或同时与mZP3 DNA疫苗肌肉注射小鼠,检测共刺激因子CD80、CD83、CD86的表达情况。结果表明,GM-CSF能够促进肌肉注射部位及脾脏组织中共刺激因子的表达,GM-CSF与mZP3 DNA疫苗同时注射时共刺激因子表达水平最高。因此,GM-CSF能够促进APCs的成熟,增强DNA疫苗的免疫原性,GM-CSF和mZP3 DNA疫苗同时注射的共免疫策略可以用于后续不育疫苗的研究。此外,由2型辅助性T细胞(type 2 T helper cell, Th2)分泌的白细胞介素-5(interleukin-5,IL-5)在诱导体液免疫方面表现突出。本研究将GM-CSF质粒单独或与IL-5重组质粒联合免疫,来探讨这两种细胞因子对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响。在免疫接种GM-CSF 4d后,共免疫接种IL-5和mZP3 DNA疫苗,通过合笼实验来确定mZP3 DNA疫苗的抗生育效果；通过检测小鼠体液免疫和细胞免疫水平评价细胞因子作为佐剂的功效；以测定的树突状细胞的成熟状况确定GM-CSF质粒在免疫起始阶段所发挥的作用。研究表明,GM-CSF和IL-5共免疫能够显着提高由mZP3 DNA疫苗引起的体液免疫反应,表现为血清中IgG抗体及脾脏中CD4+T细胞表达IL-4的水平升高,且疫苗诱导的免疫反应没有对卵巢结构造成损伤。成熟DCs细胞表面标记MHC-II及CD-86分子表达水平上调表明,GM-CSF在DNA疫苗免疫的起始阶段发挥重要的辅助作用。这说明GM-CSF和IL-5联合免疫能够增强mZP3 DNA疫苗体液免疫反应,这种免疫方式够较为安全而有效的增强DNA疫苗的免疫原性。除了IL-5以外,白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)也能够增强DNA疫苗的体液免疫反应,且GM-CSF和IL-4两种重组细胞因子蛋白能够促进DCs在体外的存活及增殖。为研究GM-CSF质粒和IL-4质粒对mZP3 DNA疫苗免疫效果不育的影响,本研究将IL-4单独或与GM-CSF共免疫小鼠。结果表明,接种GM-CSF 4d后再同时免疫IL-4和mZP3DNA疫苗能够明显的降低小鼠的生育率。与mZP3单独免疫相比,初次免疫后第42d共免疫组小鼠血清中IgG抗体水平显着增高。说明GM-CSF和IL-4共免疫能够增强mZP3 DNA疫苗激发的体液免疫及不育。ZP3疫苗通过吸入或口服等粘膜途径给药是理想的免疫方式,为了提高粘膜系统对mZP3 DNA疫苗刺激的有效的应答,本研究采用壳聚糖作为发送载体,通过滴鼻免疫GM-CSF的方式,研究其对mZP3 DNA疫苗粘膜免疫不育效果的影响。结果表明,GM-CSF质粒先于mZP3 DNA疫苗4d滴鼻免疫,能够有效的增强血清中ZP3特异性IgG和生殖道洗液中分泌性IgA(sIgA)的水平。GM-CSF质粒通过促进树突状细胞的成熟,增强了由mZP3 DNA疫苗诱导的Th2型免疫反应。更重要的是,GM-CSF与mZP3 DNA滴鼻共免疫在不影响正常卵泡发育的情况下,降低了小鼠的生育率及平均窝仔数。说明GM-CSF作为粘膜佐剂能够促进mZP3 DNA疫苗免疫不育的效果。GM-CSF和IL-5具有相同的细胞表面受体,在发挥免疫调节作用中具有协同效应。肌肉注射途径已经证明GM-CSF和IL-5共免疫能够增强mZP3DNA疫苗的抗生育效果。本研究通过滴鼻共免疫GM-CSF和IL-5,探讨其对mZP3 DNA疫苗粘膜免疫不育效果的影响。结果表明,GM-CSF滴鼻免疫4d后,再同时免疫mZP3和IL-5能够有效增强血清中IgG的水平,但生殖道洗液中sIgA的水平无明显变化,只是IL-5+mZP3免疫组sIgA的水平最高。合笼实验表明,虽然GM-CSF和IL-5共免疫能够降低小鼠的生育率,但平均窝仔数并没有显着地减少,说明GM-CSF和IL-5滴鼻共免疫对mZP3 DNA疫苗的抗生育效果的影响并不明显,这与肌肉免疫的结果不一致。由于IL-5单独或与GM-CSF共免疫都能够增强mZP3 DNA疫苗滴鼻免疫的抗体水平,其抗生育的效果需要进一步研究。结论：本研究通过肌肉注射和滴鼻免疫途径分别研究了GM-CSF,IL-4和IL-5对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响。其中,注射GM-CSF 4d后再注射IL-5+mZP3的免疫方式是开发系统免疫不育疫苗较为安全有效的免疫策略；而滴鼻GM-CSF 4d后再免疫mZP3的免疫方式是开发粘膜免疫不育疫苗较为安全有效的免疫策略。
王飞[10]2016年在《大规模PCR制备线性流感DNA疫苗及其免疫效果的研究》文中研究指明流感是由A型禽流感病毒引发的烈性禽类传染病,至今这类传染病已经传播到世界各地。疫苗免疫是目前禽流感防控的最有效的一种手段,由于流感病毒的包膜糖蛋血凝素和神经氨酸酶HA很容易因为转变或者漂变而发生改变,从而使得病毒能够逃脱机体的天然免疫和当前疫苗诱发的保护,所以需要我们随时更新新疫苗来应对流感可能的爆发。要想成功的阻止高传染性的禽流感病毒的大范围蔓延,我们需要在短时间内生产出大量的疫苗来接种。然而传统的疫苗因为生产工艺的原因很难做到这一点。所以想要依靠传统的疫苗来应对高致病性禽流感可能潜在的爆发是不可能的。有研究表明,用表达禽流感HA基因的线性合适结构(LEC)DNA免疫小鼠,能有效的保护小鼠免于致死剂量流感病毒的攻击。由于不仅具有良好的保护效果,并且设计,制备方法简单,未来线性DNA疫苗极有可能替代传统疫苗。目前生产线性DNA疫苗最高效可靠的方法是PCR,然而常规PCR的规模及成本成为限制通过PCR大规模制备线性DNA疫苗的主要因素。耐热DNA聚合酶昂贵的价格是抬高PCR成本的主要因素。为了解决这个难题我们试图通过毕赤酵母的分泌表达来降低DNA聚合酶的成本。我们根据毕赤酵母的密码子偏爱性优化合成了高保真DNA聚合酶KOD基因,并将它和DNA双链结合蛋白Sso融合在一起,然后克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A上,转化至毕赤酵母来进行表达。本研究中我们成功的实现了高保真的耐热DNA聚合酶RKOD在毕赤酵母中的分泌表达,表达量高达250mg/l,纯化之后酶活达到了 19,384U/mg。我们简化了耐热DNA聚合酶的纯化步骤,缩短了工艺流程,极大的降低了 DNA聚合酶的生产成本。在此基础上我们探索出了用简易的水浴设备进行大体系PCR的方法,并成功的实现了 10-1OOml体系的PCR,并用该方法大量制备了禽流感HIN1的线性DNA疫苗。并通过小鼠模型检验了其免疫效果。实验结果表明通过本研究中通过大规模PCR的方法制备的线性流感疫苗能够有效地保护小鼠免于流感病毒的攻击。其中经过硫代修饰的PTO-LEC-HA疫苗对小鼠产生了 100%的保护效果。综上所述,我们成功的建立起了一个通过大规模PCR制备线性DNA疫苗的方法。本研究为快速、大规模制备廉价的DNA疫苗以迅速应对新发传染病提供了一种新的策略。
参考文献：
[1]. 四种鸡球虫多价DNA疫苗免疫程序及其稳定性研究[D]. 姜荣芝. 南京农业大学. 2011
[2]. 细胞因子佐剂对犬透明带3 DNA疫苗免疫小鼠抗生育效果研究[D]. 张贝贝. 新疆大学. 2017
[3]. 柔嫩艾美耳球虫免疫调节型多价DNA疫苗的构建及免疫效果观察[D]. 宋小凯. 南京农业大学. 2008
[4]. H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究[D]. 张强哲. 西北农林科技大学. 2003
[5]. 一株ALV-J全基因序列分析及其RNAi重组腺病毒与DNA疫苗的试验研究[D]. 邹广珍. 广西大学. 2016
[6]. 细胞白介素2影响小鼠卵透明带3（mZP 3）DNA疫苗免疫效果的研究[D]. 李再新. 新疆大学. 2003
[7]. 鸡4种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗交叉免疫保护性研究[D]. 徐立新. 南京农业大学. 2009
[8]. 四川山地乌骨鸡GM-CSF和MDV的VP22的克隆表达及对IBV DNA疫苗佐剂效应研究[D]. 谭兵. 四川农业大学. 2009
[9]. 细胞因子影响鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究[D]. 马晓林. 新疆大学. 2013
[10]. 大规模PCR制备线性流感DNA疫苗及其免疫效果的研究[D]. 王飞. 湖北大学. 2016
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