杨煜[1]2003年在《甲状腺刺激性抗体对甲状腺细胞增殖影响及其作用机制》文中指出目的：观察甲状腺刺激性抗体(TSAb)对甲状腺细胞生长、增殖及MAPK信号传导通路的影响，探讨TSAb引起甲状腺细胞增殖的机制，以初步阐明TSAb引起甲状腺肿大致Graves'病(GD)发病的分子机制。 方法：建立人甲状腺细胞原代培养，并以之为研究对象，用细胞计数、MTT比色法和~3H-TdR掺入DNA合成等方法，观察TSAb对甲状腺细胞生长、增殖的影响；用流式细胞术检测TSAb对甲状腺细胞p42／44MAPK和p38MAPK蛋白表达的影响；同时应用信号传导抑制剂即PKA抑制剂、细胞内钙离子鳌合剂(BAPTA-AM)和MAPK抑制剂—PD-98059阻断各信号传导通路，观察TSAb引起甲状腺细胞增殖所通过的信号传导途径。 结果：1、TSAb阳性血清粗提物可促进甲状腺细胞的生长增殖。2mg／ml TSAb作用于甲状腺细胞24、48、72、96h各时间点细胞数分别比对照组增加19.4％，24.0％，28.7％，27.7％；以MTT法观察TSAb对甲状腺细胞增殖的影响也可观察到上述类似结果；TSAb对甲状腺细胞~3H-TdR cpm值随着其浓度的增加而逐渐增高，2mg／ml TSAb时~3H-TdR cpm值最高，为对照组2.47倍(P＜0.05)。2、TSAb阳性血清粗提物可上调甲状腺细胞p42／44MAPK和p38MAPK蛋白表达，2mg／mlTSAb作用20min，p42／44 MAPK和p38 MAPK蛋白表达量最大，与正常对照组相比其表达量分别增高2.08倍和1.70倍(P＜0.05)。加入PKA抑制剂、BAPTA-AM和PD—98059，TSAb对甲状腺细胞p42／44 MAPK蛋白表达的抑制率分别为43.1％、29.3％、59.6％。3、为进一步阐明TSAb在细胞增殖中的作用机制，加入上述叁种抑制剂阻断cAMP／PKA、PIP_2/Ca~(2+)和MAPK通路测定甲状腺细胞增殖指标，可见PKA抑制剂大部分阻断TSAb的促增殖作用，BAPTA-AM可部分阻断其作用，PD098059可完全阻断TSAb的促增殖作用。 结论：1、TSAb可促进甲状腺细胞生长增殖，是Graves'病时甲状腺肿的主要致病因子。 2、TSAb可上调p42/4 4MApK和p38MApK蛋白表达，提示TSAb通过激活细胞内MAPK信号传导通路引起甲状腺细胞增殖; 3、TSAb促甲状腺细胞生长增殖作用可被PKA抑制剂大部分阻断，被BAPTA一AM部分阻断，被PD098059完全阻断。提示TSAb致甲状腺肿作用主要经cAMP/PKA途径，部分经PIPZ/c a2+途径，最后经MAPK途径参与甲状腺细胞生长增殖的调节。这可能是TSAb引起甲状腺细胞增殖的分子机制。
袁泉[2]2017年在《化痰散结法干预Graves病小鼠甲状腺肿大与功能亢进的免疫调控研究》文中研究表明Graves病(Gravesdisease,GD)是一种自身免疫性甲状腺疾病,在西方国家发病率达0.5%～2%,国内发病率为2%～3.0%,并有逐年上升的趋势。GD特征主要为甲状腺肿大和甲状腺功能亢进,与免疫紊乱密切相关。导师认为:甲肿为有形之物,属中医"痰浊",功能亢进属中医"火旺",GD的基本病机为"痰火凝结于颈前"。基于此病机提出"化痰散结、清热消瘿"的治疗思想,并构建了以夏枯草、玄参、土贝母等为主药的GD治疗基本方法,经20余年的临床验证,具有良好的疗效。相关研究先后获得叁次国家自然科学基金资助,本研究来源于导师国家自然科学基金项目"化痰散结法对Graves病小鼠模型甲状腺肿大与激素合成下游事件的影响"(项目批准编号:81373593),从GD甲状腺肿大、甲状腺功能亢进及免疫紊乱叁个方面开展化痰散结法的研究,以期探索叁者之间的关系和化痰散结法的作用特点。目的研究化痰散结法对GD小鼠甲状腺肿大及功能亢进的影响,并从免疫紊乱、增殖与凋亡失衡、甲状腺激素合成下游事件等方面探讨其作用机制。方法1.GD小鼠模型制备及分组:将雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组(Normal)、空载病毒对照组(Ad-Control)和重组腺病毒组(Ad-TSHR289)3组,Ad-TSHR289组采用含有TSHR-A亚单位的重组腺病毒,对BALB/c小鼠进行胫前肌肉注射免疫,分别于实验第1、4、7周进行,共免疫叁次,诱导GD小鼠模型,每次免疫诱导前均对重组腺病毒进行侵染力检测。Ad-Control组注射空载病毒,Normal组注射等体积PBS溶液,免疫方式与Ad-TSHR289组相同。第10周时检测小鼠血清T4及TRAb,当成模率大于70%后进行后续实验。将造模阶段Normal组和Ad-Control组小鼠继续保留,成模后的小鼠随机分为3组:GD模型组(GD);化痰散结中药组(HTSJ);甲巯咪唑组(MMI)。对HTSJ组小鼠采用化痰散结中药干预,MMI组选取甲巯咪唑干预,其余组给予等体积蒸馏水,药物剂量按照人与动物药物剂量换算得出,灌胃给药4周后,留取各组小鼠血清、脾脏、甲状腺组织样本,进行后续实验。2.GD小鼠模型甲状腺分泌功能的测定:用放免法检测各组小鼠血清T4与TRAb,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺功能的影响。3.GD小鼠模型甲状腺组织形态观察:称量各组小鼠体重及甲状腺重量,计算小鼠甲状腺指数(甲状腺重量/体重),采用体式显微镜观测各组小鼠甲状腺形态改变,采用光镜观测各组小鼠经HE染色的甲状腺组织结构改变,采用电子透射电镜观测各组小鼠甲状腺超微结构的改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺形态的影响。4.GD小鼠模型甲状腺激素合成下游事件的分子检测:采用RT-PCR法及Westen Blot法检测各组小鼠甲状腺组织中NIS、TPO与Tg基因及蛋白的表达改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺素合成过程的影响。5.GD小鼠模型甲状腺细胞增殖与凋亡检测:采用免疫组化法检测各组小鼠甲状腺细胞增殖核抗原(PCNA)、凋亡特异性蛋白Fas/FasL、Bcl-2/Bax的改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺细胞增殖与凋亡的影响。6.GD小鼠模型脾脏淋巴细胞Treg/Th17检测:分析采用四色荧光标记流式细胞技术检测各组小鼠CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞和CD4+IL-17+ Th17细胞在脾脏淋巴细胞中的比例,采用RT-PCR法检测各组小鼠脾脏淋巴细胞中Foxp3mRNA与IL-17mRNA表达的改变,观察化痰散结法对GD小鼠模型免疫紊乱的影响。结果1.成功制备GD小鼠模型:Ad-TSHR289组小鼠血清T4为230.16±41.01ng/ml,较Normal 组升高 152.90%(P=0.000);血清 TRAb 为 12.34±3.51u/l,较 Normal 组升高1423.46%(P=0.000)。所有Ad-TSHR289组小鼠的血清T4及TRAb均超过Normal组的正常上限,小鼠总成模率为100%。2.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺分泌功能的影响:HTSJ组小鼠血清T4为181.46±47.69ng/ml,较G0组下降了18.73%(P=0.021);TRAb为10.55±2.37u/l,较G0组下降了 35.47%(P=0.000)。3.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺形态学的作用:HTSJ组小鼠甲状腺指数为(3.189±1.220)×10-4,较GD组下降了 41.69%(P=0.000),甲状腺充血得到改善。甲状腺滤泡腔内的乳头状凸起减少,甲状腺滤泡上皮细胞增生及肥大得到改善,高柱状细胞形态逐渐向扁平状恢复,滤泡腔内的胶质较GD组增加。甲状腺滤泡上皮细胞内的线粒体数目减少,内质网池的扩张减轻,线粒体肿胀缓解,线粒体嵴较GD组清晰,细胞内的内吞胶质滴数目较GD组减少。4.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺激素合成下游事件的影响:HTSJ组小鼠甲状腺细胞中的NISmRNA及蛋白表达分别下降78.80%(P=0.003)和45.97%(P=0.000);TPOmRNA 及蛋白表达分别下降 72.85%(P=0.000)和 66.24%(P=0.000);TgmRNA及蛋白表达分别下降81.06%(P=0.000)和62.79%(PP=0.000)。5.化痰散结法对GD小鼠模型甲状腺细胞增殖与凋亡的影响:HTSJ组小鼠甲状腺组织的PCNA阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组减少,Fas阳性、FasL阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组增加,Bax阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组增加,Bcl-2阳性的甲状腺滤泡上皮细胞较GD组无明显改变。6.化痰散结法对GD小鼠模型免疫功能的影响:HTSJ组小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例较GD组上升73.62%(P=0.037);脾脏淋巴细胞中Foxp3mRNA的表达较GD组上升 186.67%(P=0.010),IL-17mRNA的表达下降了 71.27%(P=0.003)。结论1.化痰散结法能够有效改善GD小鼠甲状腺功能亢进,减轻甲状腺肿大。2.化痰散结法的作用机制可能是通过上调GD小鼠CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例,升高Foxp3mRNA的表达,降低IL-17mRNA的表达,调节GD小鼠的免疫紊乱,减少TRAb的产生,从而:①降低甲状腺素合成过程中NIS、TPO、Tg的表达,达到减少甲状腺素合成的目的;②抑制甲状腺细胞增殖,加速甲状腺细胞凋亡,达到减轻甲肿的目的。通过对GD小鼠甲状腺肿大、甲状腺功能亢进以及免疫紊乱叁方面的综合调控,最终起到治疗GD的目的。
李健榕[3]2004年在《甲状腺刺激性抗体作用的胞内信号传导机制》文中认为目的:探讨甲状腺刺激性抗体(TSAb)对人甲状腺细胞功能影响的信号传导机制,初步揭示TSAb致Graves'病(GD)的分子机制。方法:1、以酶联免疫吸附法(ELISA)观察TSAb对原代培养人甲状腺细胞PKA和PKC活性影响。2、应用PKA、PKC激活和抑制剂及放射免疫分析法,观察PKA、PKC信号传导途径在TSAb刺激T3、T4分泌中的作用。3、应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测甲状腺组织和细胞中TTF-1和PAX-8基因表达情况,并应用PKA、PKC激活和抑制剂观察PKA、PKC信号传导途径在TSAb对两基因表达影响中的作用。结果:1、TSAb呈时间剂量依赖性激活甲状腺细胞中的PKA和PKC,且PKA的活性明显大于PKC活性,PKA的活性达峰时间为30min,而PKC为60min。2、TSAb刺激甲状腺细胞T3、T4分泌的效应与PKA激活剂相似,且此效应可被PKA抑制剂抑制,PKC激活剂(TPA)和抑制剂则无上述效应。虽然TPA单独作用对甲状腺细胞T3、T4分泌无影响,但其可部分抑制TSAb和PKA激活剂刺激的T3、T4分泌,此作用可被PKC抑制剂逆转。3、GD甲状腺组织PAX-8基因表达量较正常甲状腺组织明显增多,而TTF-1基因表达量无明显增加。4、TSAb呈时间剂量依赖性刺激甲状腺细胞PAX-8基因的表达,此效应与PKA激活剂相似,且可被PKA抑制剂抑制,但不被PKC抑制剂抑制。TPA单独作用对PAX-8基因表达无影响,但与TSAb共同作用,却可抑制TSAb刺激的PAX-8基因的表达,其抑制作用可被PKC抑制剂逆转。TSAb对TTF-1基因表达无明显影响。结论:1、TSAb可激活人甲状腺细胞中的PKA和PKC,且PKA的活性明显大于PKC活性,但其刺激甲状腺细胞T3、T4分泌主要是通过cAMP/PKA信号传导途径,而与PKC激活无明显关系,但两信号途径之间存在“串话”,PKC信号传导<WP=4>途径可影响cAMP/PKA信号传导途径而抑制TSAb刺激的T3、T4分泌。2、GD患者甲状腺组织中PAX-8基因表达水平明显高于正常甲状腺组织。TSAb也可使人甲状腺细胞中的PAX-8基因表达增加,其作用主要通过cAMP/PKA信号传导途径。TSAb通过相似的胞内信号传导机制上调PAX-8基因表达和刺激T3、T4分泌,故提示TSAb通过cAMP/PKA信号途径上调PAX-8基因表达是其刺激甲状腺细胞功能亢进的机制之一。
韩勇[4]2009年在《抗甲丸抗血管生成效应观察及对甲状腺肿大鼠甲状腺细胞凋亡和增殖的影响》文中提出研究背景甲状腺肿,即良性的甲状腺体积增大,是临床常见病,在人口中的发病率达到10%以上,临床上可分为毒性甲状腺肿、结节性甲状腺肿、单纯性甲状腺肿等类型。多种环境因素,如碘缺乏、碘过量、吸烟、感染、某些蔬菜(菜花、甘蓝等)等都会导致甲状腺肿的发生。此外,多个研究证实遗传因素在甲状腺肿的发病过程中发挥着重要作用。通过对甲状腺肿的家系和孪生子研究,多个与甲状腺肿有关的基因,如甲状腺球蛋白、钠碘转运体、甲状腺过氧化物酶、TSH受体等的异常相继被发现。甲状腺肿的发生还与人体自身因素,如免疫、感染、性别等有关。甲状腺肿的发病机制非常复杂,血管生成、细胞凋亡和细胞增殖的异常共同参与了甲状腺肿的形成过程。血管生成在甲状腺肿的发生发展中起着重要作用。血管生成是指由原有血管出芽生长形成新生血管的过程。血管生成与肿瘤、肥胖、类风湿、银屑病、动脉粥样硬化、心肌梗塞后和糖尿病等关系密切。多种活性物质可调节血管生成,其中VEGF、FGF和IGF-1起着关键的作用。研究发现肿大的甲状腺组织中,微血管密度明显增加,内皮细胞增殖明显增强。VEGF和FGF在甲状腺内可以由滤泡细胞合成,能通过旁分泌作用刺激其受体,在甲状腺肿时VEGF和FGF表达明显增强,可刺激甲状腺内血管内皮细胞增殖,促进血管形成。IGF-1不但是非常重要的细胞生长因子,而且可以上调甲状腺滤泡细胞VEGF的表达,促进血管生成,以便为增生的组织提供充足的营养和氧气。进一步的研究发现TSH-TSHR信号通路激活后可以上调IGF-1和VEGF的表达促进血管生成,而TSH-TSHR通路则在甲状腺肿形成中发挥着关键作用。从细胞生物学的角度,甲状腺肿是甲状腺细胞凋亡和增殖失衡,凋亡相对不足的结果。凋亡,即程序性细胞死亡,其过程受到细胞的精确调节。凋亡信号主要有内外两条信号传导通路。外源性信号通路主要由细胞表面的死亡受体(Fas、TNFa、TRAIL)与其相应的配体结合后,传导信号至细胞内,导致凋亡的发生。内源性通路由线粒体介导,线粒体外膜穿孔导致细胞色素C释放,从而启动凋亡过程。大量的临床和实验研究表明甲状腺肿存在凋亡信号和调节的异常。已证实在Fas存在于甲状腺细胞膜上,Fas的激活可以诱导甲状腺细胞的凋亡,在甲状腺肿时甲状腺细胞膜上的Fas表达减少。在大鼠甲状腺肿模型上的研究表明Fas的数量与凋亡成正相关,在甲状腺肿得到恢复时表达明显增强。Bcl-2是一种对细胞凋亡有明显抑制作用的原癌基因,能够抑制许多因素引起的细胞凋亡。Bcl-2在正常甲状腺细胞表达,在毒性甲状腺肿、药物诱导的甲状腺肿模型上表达显着增加,伴随着甲状腺肿的消退,其表达量也减少。甲状腺肿的发生同时也是甲状腺细胞增殖过度的结果。TSH-TSHR信号通路是刺激甲状腺细胞增殖的关键。当甲状腺激素的合成出现障碍,甲状腺激素水平的下降通过负反馈调节促进垂体释放TSH,升高的TSH促进甲状腺细胞增殖造成甲状腺肿大,已为众多实验证实。对于单纯性甲状腺肿和结节性甲状腺肿而言,患者体内的甲状腺激素和TSH水平并没有明显变化,一般认为是甲状腺细胞对TSH的敏感性增强所致。Graves病是导致毒性甲状腺肿的主要因素,其机制是通过自身刺激性抗体与TSH受体结合,模拟TSH的效应,促进甲状腺细胞增殖形成甲状腺肿。近年来的研究还揭示出在TSH-TSHR信号传导通路之外,存在着可以促进甲状腺细胞增殖的多种信号分子,如IGF-1、HGF等。多个研究表明IGF-1在甲状腺肿的发生中起重要作用。一直以来,甲状腺肿的治疗主要有叁种方法:甲状腺激素、手术和碘放射性治疗。临床上这叁种方法各有其并发症和副作用,例如甲状腺肿大的复发、骨量丢失、甲状腺功能减退及对心血管的不良影响等。因此,有必要探索新的副作用更少的治疗方法。中医药在中国已有两千多年的历史,并且正逐步走向世界,因其好的疗效、极少的副作用日益受到欢迎。抗甲丸是山东省立医院内分泌科赵家军教授治疗甲状腺肿的验方,已获国家专利(专利号CN1271593),具有益气活血、软坚散结之功效,临床用以治疗单纯性甲状腺肿、结节性甲状腺肿和毒性甲状腺肿多年,可使肿大的甲状腺显着缩小,未发现明显毒副作用。然而其治疗甲状腺肿的具体机制仍有待深入探讨。本研究拟从血管生成、细胞凋亡和细胞增殖的角度来探讨抗甲丸治疗甲状腺肿的机制。研究目的1应用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型,观察抗甲丸的抗血管生成效应。2应用组织学和蛋白印迹等方法,探讨抗甲丸对实验性甲状腺肿大鼠甲状腺细胞凋亡的影响。3应用免疫组化和蛋白印迹等方法,探讨抗甲丸对实验性甲状腺肿大鼠甲状腺细胞增殖的影响。研究方法1鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型种鸡蛋37℃,60%湿度,孵化72小时。然后将鸡蛋取出,小心将鸡蛋壳打开,将种蛋的内容物放入10×10cm Falcon细胞培养皿中,置于细胞培养箱中,37℃,60%湿度,4%co2浓度培养2天。将直径5mm的圆形Whatman定性滤纸,尽量选取血管分布相似的区域,放到鸡胚绒毛尿囊膜上。将药物加到滤纸上,每天加药一次,5天后,将鸡胚放于体视显微镜下进行观察拍照并计数滤纸周边10mm范围内的血管分支点数目。2实验性大鼠甲状腺肿模型制备和实验分组雄性Wistar大鼠(体重180-220g)编号后,随机分为4组:正常对照组,模型对照组,低剂量抗甲丸治疗组和高剂量抗甲丸治疗组。后叁组在饮水中加入甲巯咪唑(0.04%)诱导甲状腺肿大直至实验结束。饮用甲巯咪唑一周后,后两组开始灌服抗甲丸,剂量分别为250mg/kg、1000mg/kg,每天一次。同时模型对照组给予等量的水灌服。在服用抗甲丸4周、8周、12周时经颈静脉窦采血测定甲状腺功能和TSH。服用抗甲丸12周后,大鼠麻醉处死,完整切取甲状腺组织。一部分放入4%多聚甲醛中固定,用于制作石蜡切片;一部分用3%戊二醛固定,用于电镜观察;最后一部分放入液氮中保存,用于蛋白印迹分析。3组织学方法包括HE染色、电镜、TUNEL、免疫组织化学等。同时用Image-Pro Plus 6.0软件对微观形态和免疫组化的结果进行定量分析。4蛋白印迹法研究结果1通过鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型的研究,与空白对照组相比,抗甲丸低、高两个剂量组的血管形态和血管分支点无显着性差异(p＞0.05),未发现抗甲丸有抑制血管生成的作用。2甲巯咪唑诱导形成实验性大鼠甲状腺肿,在此模型中,甲状腺功能明显改变,TT3、TT4显着降低,而TSH显着的升高。未发现抗甲丸对大鼠甲状腺功能和TSH有显着影响。3模型对照组与正常对照组相比,甲状腺指数(甲状腺重量mg/体重100g)增长7倍。与模型对照组比较,低剂量和高剂量抗甲丸治疗组的甲状腺指数分别减小10%(p=0.067)和21%(p＜0.05)。低高剂量抗甲丸治疗组的差异不具有统计学意义(p=0.052)。4 HE染色表明模型对照组的甲状腺细胞数目增多,细胞及细胞核肥大,90%以上的的滤泡结构和胶质消失。经抗甲丸治疗后,甲状腺细胞数目减少,滤泡结构和胶质有所恢复。电镜表明抗甲丸治疗组细胞核破裂、染色质边集和胞浆空泡化等凋亡现象明显增加。5 TUNEL的结果表明低、高剂量抗甲丸治疗组的凋亡甲状腺细胞数量显着多于正常对照组和模型对照组。定量分析表明低、高剂量抗甲丸治疗组TUNEL阳性细胞数较模型对照组比有显着性差异(3.2±1.3,6.5±2.7 vs.0.58±0.78,p＜0.01),高剂量抗甲丸治疗组的凋亡阳性细胞数是低剂量抗甲丸治疗组的1倍多(p＜0.05)。6活性caspase-3免疫组织化学结果显示,在正常对照组和模型对照组,甲状腺组织中极少有活性caspase-3的表达。与模型对照组比较,低剂量和高剂量抗甲丸治疗组活性caspase-3的表达明显增强(p＜0.05),同时高剂量抗甲丸治疗组的表达显着多于低剂量抗甲丸治疗组(p＜0.05)。蛋白印迹的结果表明,另外3组较正常对照组,caspase-3的蛋白表达分别增加2.7、3.6和5.3倍,表明抗甲丸的治疗可以显着增加caspase-3的蛋白表达,呈剂量依赖性。7蛋白印迹分析结果表明Fas在抗甲丸治疗组的蛋白表达明显增强,与模型对照组相比,低剂量抗甲丸治疗组增加了45%,高剂量抗甲丸治疗组则增加了103%(p＜0.05)。8 PCNA的免疫组化染色结果显示,与正常对照组相比,模型对照组PCNA的蛋白表达明显增强。而与模型对照组相比,低剂量和高剂量抗甲丸治疗组的表达显着减弱,高剂量抗甲丸治疗组的降低更为明显(10.83±3.87,6.49±2.61 vs.16.56±4.25,p＜0.05)。蛋白印迹的结果与免疫组化的结果一致,PCNA的蛋白表达在模型对照组较正常对照组明显增强,而低剂量和高剂量抗甲丸治疗组的表达较模型对照组分别降低45%和58%(p＜0.05)。9 cyclin D1的蛋白印迹结果表明,与正常对照组相比,模型对照组的cyclinD1的蛋白表达明显增强。而与模型对照组比较,低剂量和高剂量抗甲丸治疗组cyclin D1的蛋白表达分别减弱25%和39%(p＜0.05),高剂量抗甲丸治疗组的减弱更为显着。Cyclin D1的蛋白表达的变化与PCNA的变化相一致。研究结论1抗甲丸没有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的效应。2在甲巯咪唑诱导的大鼠甲状腺肿模型中,抗甲丸可以减小甲状腺指数。3在甲巯咪唑诱导的大鼠甲状腺肿模型中,抗甲丸可以改善甲状腺肿组织的微观形态。4在甲巯咪唑诱导的大鼠甲状腺肿模型中,抗甲丸可以诱导甲状腺细胞凋亡,并呈剂量依赖性。caspase-3和Fas是抗甲丸诱导甲状腺细胞凋亡的重要机制。5在甲巯咪唑诱导的大鼠甲状腺肿模型中,抗甲丸在蛋白水平抑制PCNA和cyclin D1的表达,从而抑制甲状腺细胞的增殖,并呈剂量依赖性。
任萌[5]2007年在《血清免疫球蛋白G与胰岛素样生长因子-1在Graves病甲状腺肿大中的作用及相关信号通路研究》文中认为研究背景：Graves病(简称GD)是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，弥漫性甲状腺肿是其特征性表现之一。患者甲状腺肿越明显，病情越难控制，药物治疗的疗程越长。因此探讨甲状腺肿大的形成机制，研发有效的治疗方法是十分必要的。GD的发病机制与患者血清中存在针对甲状腺细胞膜上促甲状腺激素(TSH)受体(TSHR)的抗体(IgG)，即TRAb有关。TRAb与TSHR结合后，模拟TSH的作用，促进甲状腺细胞增生，导致甲状腺肿大的形成及甲状腺功能亢进。Bojarska曾对GD患者血清TRAb水平和甲状腺大小的相关性进行研究，发现TRAb水平和甲状腺大小正相关。此外，在甲状腺肿大的发生发展过程中，生长因子的作用日益受到重视，其中以胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的作用较为突出。我们前期研究结果显示，GD患者血清和甲状腺组织中的IGF-1水平与甲状腺大小呈正相关，提示IGF-1是一种重要的致肿大因子，参与甲状腺肿大的发生和发展过程。既然TRAb与IGF-1都与甲状腺肿大的发生有关，且TRAb(抗TSHR-IgG)又是GD发生发展的始动因素，故我们推测GD患者甲状腺局部IGF-1水平的变化可能与TRAb的作用有关。从细胞生物学的角度即细胞生长的内在调节来看，甲状腺肿大的发生是由于甲状腺细胞增生和凋亡之间的平衡被打破所致。研究发现在甲状腺组织内存在一种重要的凋亡抑制蛋白—Fas相关死亡域样白介素-1β转换酶抑制蛋白(FLIP)，它可以阻断Fas介导的凋亡信号传导，发挥抑制细胞凋亡的作用，导致细胞增生。有研究发现，在GD患者肿大的甲状腺组织中，FLIP表达增加，导致甲状腺细胞凋亡减少，促进甲状腺肿大的形成；另一方面，细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在增殖性甲状腺疾病中的作用也受到很大关注。Cyclin D1是调控细胞增殖的关键蛋白，其基因的过度表达能加速细胞从细胞周期的静止期向分裂期即G1期向S期的转变，促进细胞DNA的复制进程，加速细胞增殖。但是在甲状腺细胞内，IGF-1是否通过影响FLIP、cylinD1的表达及细胞周期的变化从而参与甲状腺肿大发生发展的过程尚不明确。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是与细胞信号转导有关的第二信使，受到细胞外的刺激即迅速产生。研究发现IGF-1促进多种细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用主要通过PI3K途径起作用。PI3K是IGF-1发挥作用的一种关键的调节分子。核因子-κB(NF-κB)是近年发现的转录因子家族中的新成员，是细胞内一种重要的核转录因子，参与多种基因的表达和调控，并在多种刺激介导的细胞信号的转录调控中起核心作用。有研究发现在某些细胞中IGF-1能影响NF-κB的活性，但NF-κB是否参与IGF-1促进甲状腺细胞增殖的过程尚待研究。基于上述研究现状，为了更深入的认识甲状腺自身抗体与IGF-1在GD甲状腺肿大中的作用机制，以便为发现治疗甲状腺肿大的分子靶点提供实验依据，本研究确定研究目的与方法如下：目的：1、通过提取GD患者血清IgG，观察对FRTL-5甲状腺细胞IGF-1基因、蛋白表达及细胞周期的影响；2、通过外源性IGF-1刺激甲状腺细胞，观察IGF-1对FLIP、cyclin D1基因和蛋白表达、细胞周期进展的影响，探讨IGF-1对甲状腺细胞增殖和凋亡相关指标的作用；3、观察IGF-1对NF-κB-DNA结合活性的影响；通过加入NF-κB阻断剂，观察IGF-1影响FLIP和cyclin D1表达的信号传导通路。研究方法：1、甲状腺细胞(Fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5)培养：Coon’s改良的Ham’s F12培养液中加入六种激素-促甲状腺激素10 mU／ml、胰岛素10μg／ml、转铁蛋白5μg／ml、氢化考的松5 ng／ml、生长抑素10 ng／ml、甘氨酸-组氨酸-亮氨酸10 ng／ml及5％胎牛血清，即配成甲状腺细胞培养液，称为6H(hormome)。为使细胞同步化，待甲状腺细胞在培养皿中长至80％～85％时，培养基去除促甲状腺激素和胰岛素，改为其余四种激素加0.2％胎牛血清(称为饥饿培养基，即4H)培养，48小时后吸去培养基，PBS洗两遍，以4H培养基加入不同的处理作用24小时。2、甲状腺体积的测定：分别测量患者甲状腺左、右叶及峡部，包括长径(a)、宽径(b)及厚径(c)，按椭圆公式V(ml)=π／6×a×b×c计算，各部分相加为总体积。3、选择新发GD患者34例、正常对照30例，ELISA法分别测定患者及正常对照血清TRAb滴度。采用PEG4000分别从新发GD患者和正常对照组血清中粗提IgG，其中GD患者又以甲状腺体积40 cm~3为界，分为两组，分别提取血清IgG，各组IgG分别加入培养基中刺激饥饿后的细胞24小时(IgG终浓度100μg／ml)，观察：①IgG对甲状腺细胞形态的影响。②IgG对甲状腺细胞IGF-1mRNA和蛋白表达的影响；4、为探讨IGF-1对FLIP、cyclin D1的作用及涉及的信号通路，将FRTL-5细胞饥饿后分为5组：正常对照组、IGF-1刺激组、IGF-1与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)阻断剂LY294002共培养组、IGF-1与NF-κB阻断剂BAY11-7082共培养组以及IGF-1与两种阻断剂共同处理组。①采用RT-PCR、实时定量PCR检测FLIPmRNA水平变化。②采用Western blot检测FLIP、cyclin D1及NF-κB抑制性蛋白IκBα的蛋白水平。③采用凝胶迁移率测定(EMSA)检测NF-κB-DNA结合活性。5、为探讨IgG及IGF-1对甲状腺细胞细胞周期各阶段的影响，在饥饿后的甲状腺细胞培养基中加入IgG或IGF-1作用24小时，应用流式细胞仪记数细胞周期各阶段的百分数，观察细胞周期的变化。结果：1、TRAb水平与甲状腺肿大的关系：新发GD患者34例，其中30例患者血清TRAb阳性，阳性率为88％(30／34)；正常对照30例，TRAb均为阴性。甲状腺体积较大的患者，血清TRAb水平越高，相关分析显示两者之间呈正相关关系，相关系数为0.7。2、IgG对甲状腺细胞IGF-1水平的影响：与正常对照组相比，GD患者血清IgG能明显上调甲状腺细胞IGF-1的mRNA和蛋白水平；从甲状腺体积超过40 cm~3的患者血清中提取的IgG，与甲状腺体积小于40 cm~3患者的IgG比较，刺激甲状腺细胞IGF-1mRNA和蛋白水平的进一步升高(p＜0.05)。3、IGF-1对FLIP、cyclin D1的影响：IGF-1刺激甲状腺细胞后，FLIP mRNA和蛋白水平明显增加，且随着IGF-1刺激浓度的增高，FLIP表达明显上调。说明FLIP的表达与IGF-1的浓度变化呈剂量依赖性；同样，IGF-1能上调cyclin D1的蛋白水平。加入PI3K阻断剂LY294002后，FLIP mRNA和蛋白水平以及cyclin D1的蛋白水平明显下降。4、IGF-1对NF-κB的影响：加入IGF-1后，与对照组相比，NF-κB的抑制性蛋白IκBα水平明显下降，NF-κB-DNA结合活性明显增加：加入PI3K阻断剂LY294002后，IκBα水平明显升高，NF-κB-DNA结合活性明显下降。5、NF-κB对FLIP、cyclin D1的影响：细胞经IGF-1与BAY11-7082(NF-κB阻断剂)预先作用后，再加入IGF-1刺激，与单独IGF-1刺激组相比，FLIP、cyclinD1蛋白水平明显下降。6、流式细胞记数显示：甲状腺细胞饥饿后，约80％的细胞静止于G0期，经IgG或IGF-1刺激24小时后，S期细胞数目增加，表明细胞进入增殖状态；IGF-1与PI3K阻断剂LY294002或NF-κB阻断剂BAY11-7082共同作用后，与单独IGF-1刺激组相比，S期细胞数目减少，G0期细胞数目增加，表明细胞增殖受抑制。7、细胞形态的变化：饥饿后观察细胞，发现细胞体积缩小，大部分细胞出现空泡，细胞培养液上清中出现漂浮的细胞碎片；加入GD患者IgG或IGF-1作用24小时后观察细胞形态，发现空泡减少，细胞体积增大，状态良好，大部分细胞重新进入增殖状态。结论：1、GD患者血清IgG上调甲状腺细胞IGF-1 mRNA和蛋白水平的表达，且此作用与甲状腺体积大小密切相关；GD患者血清IgG还能刺激甲状腺细胞细胞周期的进展。本研究结果表明，GD患者血清IgG刺激甲状腺细胞增生的作用可能与其上调IGF-1水平有关。2、IGF-1可增加核因子NF-κB的DNA结合活性，降低其抑制性蛋白IκBα的水平，这提示在甲状腺细胞内IGF-1可通过核因子NF-κB影响其调节的靶基因的转录和翻译。3、IGF-1通过影响PI3K和核因子NF-κB，上调抗凋亡蛋白FLIP和细胞周期蛋白cyclin D1的表达水平；同时该信号通路还参与细胞周期的调节；这可能是IGF-1促进甲状腺细胞增殖，抑制其凋亡的机制之一。
王丽莉[6]2010年在《PPARγ激动剂15d-PGJ_2对人甲状腺细胞存活和凋亡的影响》文中提出目的:本研究应用甲状腺刺激抗体(TSAb)刺激体外培养的甲状腺细胞,分析过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在TSAb作用下人甲状腺细胞中的表达情况,并初步探讨PPARγ激动剂15-脱氧-△12, 14-前列腺素J2(15d-PGJ2)对TSAb作用下人甲状腺细胞存活和凋亡的影响。方法:应用原代培养人甲状腺细胞为研究对象,TSAb作用细胞24h后,采用实时定量PCR法和Western- blot法分别检测TSAb组(2mg/mlTSAb阳性血清粗提IgG培养)、TSAb阴性组(2mg/ml正常人血清粗提IgG培养)及对照组(无血清的1640培养基培养)甲状腺细胞中PPARγ的表达情况;不同浓度15d-PGJ2(0、5、10、20、40μmol·L-1)分别干预0、12、24、48h后,应用MTT法检测甲状腺细胞的存活率;干预24h后,利用Hoechst-PI染色荧光显微镜观测细胞凋亡形态、Annexin-V-FITC /PI染色流式细胞技术测定细胞凋亡率。同时应用PPARγ拮抗剂GW9662阻断PPARγ途径,观察15d-PGJ2对TSAb作用下甲状腺细胞凋亡的变化。结果:1.PPARγmRNA及其蛋白在TSAb组、TSAb阴性组及对照组甲状腺细胞中均有表达,而在TSAb作用下甲状腺细胞中的表达显着低于TSAb阴性组和对照组(P<0.05)。2.15d-PGJ2呈浓度和时间依赖性抑制TSAb作用下甲状腺细胞的存活,抑制高峰为20μmol·L-115d-PGJ2作用24h;5-40μmol/L 15d-PGJ2对TSAb作用下甲状腺细胞有促进凋亡作用(p<0.05),并呈剂量依赖关系;10μmol/LPPARγ拮抗剂GW9662能拮抗20μmol/L15d-PGJ2对TSAb作用下甲状腺细胞的凋亡作用(p<0.05)。结论:1.PPARγ在TSAb作用下甲状腺细胞中的表达是显着降低的,作为GD主要致病因子的TSAb,可能通过抑制PPARγ而使细胞增殖增多、凋亡受抑制。2.PPARγ激动剂15d-PGJ2可呈时间与剂量依赖性抑制TSAb作用下的甲状腺细胞存活。3.PPARγ激动剂15d-PGJ2可诱导TSAb作用下甲状腺细胞的凋亡,并呈一定的剂量依赖性,此效应可能是其抑制细胞存活的机制之一。4.PPARγ激动剂15d-PGJ2对TSAb作用下甲状腺细胞的凋亡作用能部分被其拮抗剂GW9662阻断。提示其诱导甲状腺细胞凋亡可能主要通过PPARγ途径起作用,具体机制尚待进一步研究。5.PPARγ激动剂可望成为治疗GD的新途径。
王凤鸣[7]2011年在《ICOS-ICOSL信号在甲状腺机能亢进免疫病理过程中的作用及机制》文中研究说明Grave’s病(GD)又称毒性弥漫性甲状腺肿,是一种器官特异性自身免疫性疾病,是由于细胞表面促甲状腺激素(TSH)的受体作为自身抗原所产生的相应抗体(TRAb)与TSH受体结合,甲状腺细胞活化而引起的甲状腺机能亢进。主要表现为:弥漫性甲状腺肿伴甲亢症状、浸润性突眼、胫前黏液性水肿以及产生特异性的甲状腺刺激性抗体(TRAb)。GD的免疫功能异常表现为:甲状腺滤泡细胞(TFC)通过其表面异常表达的免疫活性分子与自身反应性T淋巴细胞相互作用,诱导抗原特异性T淋巴细胞向组织局部聚集、活化、增生、分化为功能性T细胞,分泌多种细胞因子,介导免疫损伤;同时促进B细胞分化,产生多种针对甲状腺组织的特异性自身抗体,最终导致腺体结构和功能发生变化。但其自身抗体产生的确切机制至今尚未阐明。近年来,自身反应性T细胞的发现以及协同刺激分子在GD患者自身抗体产生中的作用越来越受到人们的重视。大量的研究发现,外周血淋巴细胞亚群的变化及其表面协同刺激分子的异常表达与GD自身抗体的产生及疾病的发生密切相关。已有的研究表明:(1)很多自身免疫性疾病中均存在着CD4~+CD28-T细胞这一特殊的细胞群体,由于这群自身反应性T细胞的异常活化而导致了疾病的发生和发展;(2)在自体T细胞和PWM共同作用下,GD患者外周血B淋巴细胞可以分泌多于对照组4倍的IgG,而在缺乏自体T细胞时,IgG的分泌未见显着增加;(3)在GD小鼠模型中,TRAb仅在野生型的小鼠外周血中被检测到,而在B细胞缺陷的小鼠模型中,不能检测到自身抗体的产生。由此提示:GD患者自身抗体的产生与T、B细胞之间的相互作用密切相关,而其表面异常表达的协同刺激分子很可能发挥了非常重要的作用,但是其确切的免疫机制尚不清楚。ICOS是1999年,Hutloff等学者首先在活化的T细胞上发现的,其结构和功能与CD28十分相似,是CD28家族的第叁个成员,但其只能诱导表达于活化的T细胞表面或记忆性T细胞表面,故命名为ICOS(Inducible Costimulator,可诱导的共刺激分子),因其缺乏MYPPPY基序,由此推断ICOS应该有其特异性的配体。同年,Yoshinaga和他的同事首先报道了小鼠的B7RP-1分子,并证实B7RP-1就是ICOS的特异性配体。人ICOS的配体ICOSL(又称为hB7RP-1,B7-H2,hLICOS)主要高表达于活化的B细胞,在巨噬细胞和树突状细胞表面也有表达。先前的研究发现TNF-α可以诱导小鼠成纤维细胞或一些非淋巴组织表达ICOSL;IL-1β和TNF-α可显著上调内皮细胞表面ICOSL的表达;ICOSL在细胞和组织上的表达受到多种细胞因子的调控。ICOS-ICOSL信号在机体的免疫反应调节中发挥重要的生物学效应:(1)ICOS分子上调性表达于活化的T细胞表面,与其配体ICOSL分子的结合能够促进T细胞的活化和增殖,从而协同CD28-B7信号在机体免疫应答中发挥重要的调节作用。而与CD28-B7不同的是,ICOS-ICOSL信号不能上调活化T细胞表达IL-2,但可以诱导IL-10的高表达,从而促进Th2的极化。由此可见,ICOS-ICOSL信号通路不依赖CD28-B7信号,两者可能是机体相互独立的信号途径。(2)ICOS-ICOSL信号参与体液免疫应答。ICOS-ICOSLL信号虽然不影响B细胞的发育,但却是机体B细胞分化成熟的重要信号,该信号的缺乏将导致机体T细胞依赖性的B淋巴细胞反应严重受损。在体液免疫应答过程中,ICOSL分子的表达参与了T淋巴细胞和B淋巴细胞的“相互对话”(Cross-talk);ICOS-ICOSL信号通过促进活化B细胞的增殖和抗体的分泌,从而参与了机体体液免疫应答的重要调节。(3)由于ICOSL能在一些非淋巴细胞上诱导表达,故ICOS-ICOSL信号在局部的免疫应答和炎症反应中亦具有重要功能。鉴此,ICOS/ICOSL信号很可能参与了GD的免疫致病过程。本项目拟在检测GD患者外周血及甲状腺组织中ICOS/ICOSL分子的异常表达及临床意义的基础上,进一步探讨ICOS-ICOSL信号在甲状腺机能亢进免疫病理过程中的作用及机制。第一部分ICOS/ICOSL分子在Graves病患者外周血淋巴细胞亚群上的异常表达及其临床意义【目的】检测GD患者外周血中CD4~+CD28~-T细胞的数量和ICOS/ICOSL分子在淋巴细胞亚群上的异常表达,分析其与患者检测指标、临床疗效及复发性之间的相关性;检测GD患者外周血血清中不同细胞因子的分泌。【方法】选择105例GD患者外周血单个核细胞(PBMCs)作为实验对象,同时选取67例健康人外周血PBMCs作为正常对照。通过流式细胞术检测GD患者外周血中淋巴细胞亚群的异常变化,通过流式细胞术和real-time PCR的方法,从分子和基因两个不同水平检测ICOS/ICOSL分子在健康人和GD初发患者以及同一GD患者治疗前后外周血PBMCs淋巴细胞亚群表面的表达特性;通过统计学方法分析自身反应性T细胞(CD4~+CD28~-T细胞)的增加、ICOS/ICOSL分子在淋巴细胞上的异常表达与患者临床检测指标、疗效和复发性之间的相关性;并用real-time PCR和酶联免疫反应技术(ELISA)检测患者外周血中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17等细胞因子的分泌。【结果】①GD患者外周血中CD4~+T细胞显着减少(P<0.05),CD4/CD8显着降低(P<0.05),CD19~+B细胞数量显着增加(P<0.001),T细胞表面CD28分子的表达显着下降(P<0.01),进一步双标后发现,CD4~+CD28~+、CD8~+CD28~+百分率均显着下降(P<0.05, P<0.01);②与健康人外周血相比,GD初发患者外周血中CD4~+T细胞表面ICOS呈上调性表达(P<0.001),在CD8~+T细胞表面未见显着异常;而CD19~+B细胞上ICOSL分子的表达显着增加(P<0.0001);③real-time PCR结果显示,GD患者外周血中ICOS和ICOSL mRNA水平均显着高于健康人;④与健康人相比,GD患者外周血中sIL-2减少,而sIL-4、sIL-6、sIL-10、sIFN-γ、sTNF-α、sIL-17显着增加。⑤同一患者治疗缓解后,与治疗前相比,自身反应性T细胞显着减少,CD4~+T细胞表面ICOS的表达和CD19~+B细胞表面ICOSL的表达均显着降低;⑥自身反应性T细胞的数量和CD4~+T细胞表面ICOS分子的表达均与患者外周血血清中FT3正相关,而与FT4和TSH无显着相关性;⑦与低TRAb组相比,高TRAb组患者外周血中自身反应性T细胞的数量和CD19~+B细胞表面ICOSL的表达均显着增加。【结论】GD患者外周血中存在高比例的自身反应性T细胞(CD4~+CD28~-T细胞),ICOS/ICOSL分子异常表达于GD患者外周血PBMCs的不同亚群表面,并与疾病临床特征相关,提示ICOS-ICOSL协同刺激信号参与了GD患者的免疫病理机制。第二部分ICOS/ICOSL分子在GD患者甲状腺组织中的表达【目的】检测ICOS/ICOSL分子在GD患者甲状腺组织中的表达,分析相关细胞因子对甲状腺滤泡细胞表面ICOSL分子表达的调节。【方法】选取GD患者手术切除的甲状腺组织标本作为研究对象,同时以非毒性甲状腺肿(NTG)和桥本氏甲状腺炎(HT)患者的甲状腺组织为对照。应用流式细胞术、real-time PCR、免疫组化染色方法(IHC)和激光共聚焦显微镜技术(confocal)检测ICOS/ICOSL分子在GD和NTG甲状腺组织细胞、浸润性T、B淋巴细胞表面的表达。运用甲状腺细胞原代培养技术和流式细胞术,检测各种细胞因子刺激后,甲状腺滤泡细胞表面ICOSL分子的表达变化。【结果】①与HT和NTG的甲状腺组织相比,ICOS/ICOSL mRNA在GD甲状腺组织中异常高表达;②流式细胞术检测结果显示:GD患者甲状腺组织中浸润的淋巴细胞表面表达了ICOS/ICOSL分子;③免疫组织化学染色结果显示:GD患者甲状腺组织中浸润的T淋巴细胞表面ICOS呈阳性表达,而浸润的B细胞以及TFC表面ICOSL呈阳性表达。而HT和NTG组织中仅见浸润B细胞表面表达ICOSL。④TFC在体外经细胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-α)刺激培养3d,其表面协同刺激分子ICOSL呈上调性表达。【结论】ICOS/ICOSL分子异常表达在GD患者局部组织中,介导的协同刺激信号促进Th2细胞的极化,辅助B细胞活化并产生大量的自身抗体,大量促炎因子的分泌促进了TFC表面ICOSL的表达,进一步诱发、维持和加重甲状腺的自身免疫。第叁部分ICOS-ICOSL信号对原代培养的甲状腺上皮细胞生物学行为的影响【目的】探讨ICOS-ICOSL协同刺激信号对原代培养TFC生物学特性的影响。【方法】运用甲状腺细胞原代培养技术、MTT法和放免法,利用ICOS/L929基因转染细胞和阻断型ICOSL抗体,体外研究ICOS-ICOSL信号对原代培养的TFC的增殖、合成甲状腺素FT3、FT4和分泌甲状腺球蛋白(Tg)能力的影响。【结果】ICOS基因转染细胞(ICOS/L929)与空载体基因转染细胞(mock-L929)相比,能明显促进TFC的体外生长,促进合成甲状腺素FT3和FT4和分泌甲状腺球蛋白Tg,P值均<0.01。加入阻断型ICOSL抗体后,TFC分泌的甲状腺激素FT3、FT4以及甲状腺球蛋白Tg显着减少,P值均<0.05;【结论】T细胞表面的ICOS分子与TFC表面表达的ICOSL分子相互作用介导的协同刺激信号,具有促进滤泡细胞的生长和功能的作用。综上所述,本课题通过流式细胞术、PCR等技术,检测GD患者外周血中CD4+CD28~-T淋巴细胞(自身反应性T细胞)的增加以及ICOS/ICOSL分子在外周血淋巴细胞亚群和局部甲状腺组织中的表达特性,分析其异常表达与患者临床疗效和复发之间的相关性;并进一步采用体外实验验证ICOS-ICOSL信号对GD患者TFC生物学行为的影响,从而阐明在TFC、自身反应性T细胞和B细胞形成的微环境中,ICOS/ICOSL协同刺激信号发挥的激发、维持和放大免疫效应的作用。这对进一步了解ICOS-ICOSL信号的免疫调节功能,深入阐明GD的免疫致病机理,以及寻找具有潜在临床应用价值的免疫干预手段具有重要意义。
章文平[8]2007年在《瘿气灵对Graves病临床疗效及细胞凋亡的影响》文中研究说明第一篇Graves病(毒性弥漫性甲状腺肿)的文献复习中医认为Graves病的发生乃七情内伤所致，同时与饮食、地理环境、体质性别相关。病机是以阴虚为本，以火郁、痰凝、血瘀为标，表现为本虚标实、虚实夹杂的证候。Graves病的治疗应始终坚持标本兼顾的原则，主要从益气养阴、清热泻火、化痰祛瘀、软坚散结等方面着手以补虚泻实、调整阴阳。现代医学认为Graves病的病因及发病机理有免疫异常、遗传因素、神经精神因素、饮食药物因素、感染，诊断主要根据临床表现和实验室检查两个方面。治疗包括抗甲状腺药物治疗、放射性~(131)I治疗、手术治疗、介入栓塞治疗。Graves病甲状腺细胞凋亡是通过Fas／FasL基因介导的，Graves病时血清中sFas浓度增高及Bcl-2过度表达，抑制了Fas／FasL基因介导的甲状腺细胞凋亡，使甲状腺细胞过度增生，甲状腺激素合成分泌增多，产生一系列症状。现代中医认为，细胞增殖属阳，细胞凋亡属阴。一旦增殖与凋亡平衡紊乱，则会出现偏盛、偏衰的病证，如机体细胞异常增殖(阳盛)而凋亡减退(阴微)是肿瘤形成及自身免疫性疾病产生的重要病理生理基础；细胞增殖减退(阳微)而凋亡过盛(阴盛)与一系列机能减退性疾病密切相关。诱导细胞凋亡的有清热解毒、活血化瘀、益气养阴、补血、补肾健脾、软坚散结类中药，它们均能产生诱导细胞凋亡的作用。第二篇瘿气灵治疗Graves病的研究目的观察瘿气灵对治疗Graves病的临床疗效，并通过实验室检查相关指标的变化，以及对患者细胞凋亡因子的影响，探讨瘿气灵对治疗Graves病的作用机理，为临床使用提供理论依据。方法1．纳入病例标准(1)年龄18～70岁的成人患者。(2)符合西医Graves病(毒性弥漫性甲状腺肿)诊断标准。(3)对药物的主要药理特性和可能发生的反应基本了解。(4) 3个月内未用过抗甲状腺素药物。2．排除病例标准(包括不适应症或剔除标准)(1)不符合上述纳入标准者，排除其它原因所致的甲亢(如结节性甲状腺肿伴甲亢、甲状腺肿瘤伴甲亢等)。(2)其他疾病所致的甲状腺肿大或高代谢症候群症状，如单纯性甲状腺肿大、神经官能症、自主性高功能性甲状腺结节等；其他内分泌及免疫疾病，如甲状腺炎、类风湿、肿瘤、哮喘、糖尿病等。(3)妊娠或哺乳期妇女；有甲亢危象者：精神病患者。(4)合并心血管、脑血管、肝肾和造血系统等严重原发性疾病患者。(5)过敏体质及对多种药物过敏者。(6)未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者。3．病例分组将符合纳入病例标准的治疗对象80例，随机分组：瘿气灵治疗组(治疗组)，计40例；他巴唑治疗组(对照组)，计40例。两组患者在性别、年龄、病程分布、主要临床症状、体征和理化检查等方面比较，经统计学处理无显着性差异，具有可比性。4．治疗方法治疗组：予瘿气灵，每次5片，每日3次，连续给药3个月。对照组：予他巴唑，每次10mg，每日3次。足量2月，症状控制后渐减量。5．疗效观察记录相关症状：心悸、烦躁、消瘦、多汗、震颤、多食、大便频、恶热、少寐多梦、神疲、健忘、乏力、口干渴。相关体征：体重、甲状腺肿、突眼、静息脉率、甲状腺区震颤、血管杂音，皮疹。治疗前后各记录一次，并做统计分析。甲状腺功能测定：TT_3、TT_4、FT_3、FT_4、TSH。免疫学测定：TGAb(甲状腺球蛋白抗体)、TPO-Ab(甲状腺过氧化物酶抗体)。细胞凋亡的测定：血清sFas和Bcl-2值。治疗前后各测定一次，并做统计分析。每月检查一次血、尿、便常规，肝、肾功能，作为安全性指标，以观察药物的毒副作用。结果服用瘿气灵3月后，治疗组临床疗效中临床控制21例，显效13例，有效6例，无效0例，总有效率为100％，对照组临床疗效中临床控制14例，显效13例，有效7例，无效6例，总有效率为85％，治疗组明显优于对照组，有显着性差异(p＜0.05)。治疗组中医证候疗效中临床痊愈13例，显效11例，有效16例，无效0例，总有效率为100％，对照组中医证候疗效中临床痊愈7例，显效7例，有效25例，无效1例，总有效率为97.5％，治疗组明显优于对照组，有显着性差异(p＜0.05)。治疗组和对照组治疗前后症状积分均有不同程度的改善(p＜0.01)，治疗后组间比较有显着性差异(p＜0.05)，两组治疗前后积分差值，经比较，p＜0.01，差异有显着性，治疗组优于对照组。研究显示，经治疗后，治疗组和对照组的心率下降与治疗前比较有显着性差异(p＜0.01)，两组治疗前后心率差值，经比较，p＜0.01，差异有显着性，治疗组优于对照组。治疗组和对照组在使体重增加方面均有一定的疗效，治疗组前后比较有显着性差异(p＜0.05)，而对照组前后比较无显着性差异。两组治疗前后体重差值，经比较，p＞0.05，提示经治疗后治疗组的体重增加与对照组相比差异无显着性。治疗组应用瘿气灵后血清FT_3、FT_4与治疗前比较明显降低，血清TT_3、TT_4与治疗前比较亦明显降低，TSH与治疗前比较有较大程度的恢复，差异有显着性(p＜0.01)，对照组治疗后的血清各项甲状腺激素与治疗前比较亦明显降低，差异有显着性(p＜0.01)。两组治疗前后TT_3、TT_4、FT_3、FT_4、TSH差值，经统计学处理，均为p＞0.05，说明经治疗后治疗组的TT_3、TT_4、FT_3、FT_4、TSH的变化与对照组相比，差异无显着性。治疗组和对照组治疗后TGAb(甲状腺球蛋白抗体)、TPO-Ab(甲状腺过氧化物酶抗体)有不同程度的下降，差异有显着性(p＜0.01)，两组治疗前后TGAb、TPO-Ab差值，p＜0.01，差异有显着性。治疗组能使血清sFas、Bcl-2浓度下降，自身前后对照有显着性差异(p＜0.01)，对照组亦使血清sFas、Bcl-2浓度下降，自身前后对照有显着性差异(p＜0.01)，两组治疗前后sFas、Bcl-2差值，经统计学处理，p＜0.01，差异有显着性。治疗组和对照组治疗过程中均出现了不同程度的副作用，白细胞减少治疗组0例，对照组2例，药物性皮疹治疗组1例，对照组4例，肝功能损害治疗组1例，对照组4例，治疗组出现较少的副作用。治疗组出现一定的副作用，推测与瘿气灵含有他巴唑有关，但与对照组比较明显减少，说明瘿气灵治疗Graves病安全性较高，可长期使用，亦应注意其副作用的发生。结论Graves病病机之根本在于阴虚火旺，亦即阴微(凋亡减退)阳盛(细胞异常增殖)，体现在临床上为颈肿目突及一系列阴虚阳亢的表现。瘿气灵具有养阴清热及活血消肿的作用，能恢复不足之阴液(促进凋亡)，平抑亢盛之阳气(抑制细胞异常增殖)，同时瘿气灵组成药物中不少能诱导细胞凋亡，瘿气灵能使Graves病患者血清sFas、Bcl-2浓度下降，从而诱导甲状腺细胞凋亡，使肿大的甲状腺变小，甲状腺激素的分泌亦随之减少，Graves病阴虚阳亢的表现消失，颈肿目突向愈，病情逐渐好转，瘿气灵治疗Graves病正与此有关。本研究结果表明，瘿气灵对治疗Graves病(毒性弥漫性甲状腺肿)的临床疗效确切，能有效地控制Graves病临床症状，对于Graves病患者的免疫学指标及受抑的细胞凋亡有显着改善作用，但对于Graves病患者的甲状腺激素水平的影响与西药相比无明显优势。在服药过程中，对血常规、肝、肾功能影响较小，是一种较为安全的用药途径，发挥了中西医结合的优势，值得临床推广应用。
王岩[9]1990年在《Graves病自身抗体的特性与作用》文中认为Graves病是一种自身免疫性甲状腺机能亢进病,其特征为甲状腺功能亢进和腺体肿大。患者血清中甲状腺激素(T_3、T_4)升高,并有甲状腺自身免疫性抗体存在。该抗体对于甲亢的病因及发病机理的研究都具有重要意义,是目前国内外普遍重视的问题。本文简介甲状腺自身免疫性抗体的特性及其作用。
张琳[10]2013年在《腺苷A2a受体在甲状腺细胞的表达及其在Graves病患者血清lgG诱导VEGF表达中作用的研究》文中认为研究背景：Graves病(Graves Disease, GD)是一种常见的危害人类健康的自身免疫性内分泌疾病。GD患者的特征性表现为甲状腺肿伴明显的毒性症状,肿大的甲状腺产生过量的甲状腺激素,作用于全身组织和器官,引起甲状腺毒症,同时甲状腺内血流速度的加快并有丰富的血管形成。大部分患者甲状腺肿越明显,甲状腺内血管越丰富,病情越难控制,药物治疗疗程越长,探讨甲状腺肿及血管化形成的机制对GD的治疗十分重要。传统观点认为,GD患者的血清中针对甲状腺细胞TSH受体的特异性自身抗体,即TSH受体抗体(TSH receptor antibodies, TRAb),与TSH受体结合后激活腺苷酸环化酶信号系统,导致甲状腺细胞增生和甲状腺激素合成、分泌增加。因此早期研究中,TRAb被认为是GD的主要致病因素,也是引起甲状腺细胞增生从而引起甲状腺肿的主要致病因子。除长期持续的TRAb激活引起的甲状腺细胞的增生外,生长因子表达的增加也被认为是甲状腺肿发生的重要原因,其中以血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用较为突出。生长因子以内分泌、旁分泌和自分泌等方式,广泛而精细的地调节甲状腺细胞及其周边细胞的生长、分化和功能,参与甲状腺疾病的发生发展过程。但甲状腺自身抗体如何影响生长因子表达进而在甲状腺肿形成中发挥作用的机制仍不清楚。腺苷是ATP及cAMP的代谢产物,其本身也能够与细胞膜上的腺苷受体结合,通过细胞内的第二信使进一步发挥作用。1992年Ledent等通过将腺苷A2a受体(Adenosine A2a Receptor, A2aR)与甲状腺球蛋白(Thyroglobulin, TG)启动子相连接而建立了甲状腺肿大合并功能亢进的小鼠模型,病理切片显示该小鼠的甲状腺增生明显并有大量的血管形成。因此我们假设,A2aR可能在GD甲状腺肿发生的过程中起到一定作用。此前腺苷A2a受体作为VEGF转录表达的上游调节受体已在其他组织细胞被广泛研究,目前甲状腺上尚未有A2aR与VEGF关系的相关报道。腺苷A2a受体的激活促进血管形成机制的研究大部分集中在肿瘤组织血管新生及缺氧环境诱发血管生成上。缺氧和应激引起腺苷生成增加,A2aR被激活后促进细胞内低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors-1alpha, HIF-1alpha)进入细胞核,与VEGF启动子上HIF-1alpha结合位点HIF反应原件(HIF-responsive elements, HRE)相结合,直接促进VEGF的转录。近期报道显示,过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1alpha (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Co-activator Protein1alpha, PGC-1alpha)及Ser133磷酸化的cAMP反应原件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, p-CREB)均能够在不依赖于HIF-1alpha的情况下独立促进VEGF的转录。既往研究表明,p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha的表达均与细胞内cAMP的升高有关,而A2aR作为Gs蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCR),其激活可引起细胞内cAMP的水平明显增高。因此我们认为,A2aR可能通过cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha引起VEGF表达增加。本项目证实腺苷A2a受体存在于甲状腺细胞膜,且有功能活性；A2aR参与Graves病患者自身抗体调节甲状腺细胞VEGF表达,其可能机制是：GD IgG作用于甲状腺细胞,引起cAMP的产生增加,一方面直接通过cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha引起VEGF表达增加；另一方面,cAMP降解使得细胞外腺苷水平升高,从而激活A2aR,进一步引起细胞内cAMP的增多。目的：1、确定A2aR在大鼠甲状腺细胞(Fisher rat thyroid cell line-5, FRTL-5)、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺及人甲状腺中的mRNA和蛋白表达。2、通过A2aR激动剂或粗提甲亢患者血清IgG (GD IgG)刺激甲状腺细胞,观察VEGF mRNA和蛋白表达的变化,初步探讨GD IgG及A2aR与VEGF表达的关系。3、通过A2aR激动剂或粗提甲亢患者血清IgG刺激甲状腺细胞,检测CREB、p-CREB、PGC-1alpha, HIF-1alpha的蛋白水平,探讨GDIgG及A2aR引起VEGF分泌增加的可能机制。4、通过注射特异性表达人TSH受体的腺病毒建立GD小鼠模型,检测p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha、VEGF的蛋白水平,进一步探讨GDIgG引起VEGF分泌增加的可能机制。5、利用A2aR特异性阻断剂及A2aR特异性小干扰RNA (Small Interfering RNA, siRNA)处理细胞,检测‘VEGF、p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha的表达,探讨A2aR在GDIgG所引起的VEGF表达增加中所起的作用。6、分别使用GD IgG、A2aR特异性激动剂、A2aR特异性阻滞剂处理后获得的甲状腺细胞上清,刺激人脐静脉内皮原代细胞(Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC),检测其增殖情况,探讨GDIgG及A2aR处理后甲状腺细胞对内皮细胞增殖的影响。研究方法：1、细胞培养：1) FRTL-5细胞根据相应参考文献及ATCC细胞培养标准使用Coon's改良的Ham's F12培养液中加入6种激素进行培养。2)人甲状腺原代细胞人甲状腺组织剪碎,Ⅰ型胶原酶与胰酶混合液中37℃消化40-60min,过滤后洗涤沉淀并种板,使用含新生牛血清及TSH的DMEM/F12培养基培养。3)人脐静脉内皮细胞以0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA注入脐静脉,细胞分散后洗涤并种板,以含有胎牛血清及成纤维细胞生长因子的M199培养基培养。4)大鼠神经元原代细胞新生大鼠脑组织剪碎,0.25%胰蛋白酶消化后过滤洗涤并种板,以含有胎牛血清、葡萄糖、胰岛素和P-氨基苯酸的DMEM培养液培养。2、动物模型：通过肌肉注射表达人TSH受体的腺病毒建立GD小鼠模型。3、临床病例收集和粗制IgG的提取：收集初发GD患者,取空腹静脉血,采用电化学发光法检测血清TRAb浓度,采用甲状腺B超测量甲状腺体积,并用PEG沉淀法提取血清IgG。4、采用RT-PCR检测A2aR mRNA的表达和VEGF各剪接体mRNA水平变化。5、采用Western Blotting检测A2aR、p-CREB、CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha, VEGF及beta-actin蛋白水平变化。6、采用免疫荧光及免疫组化方法检测A2aR、p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha、VEGF在甲状腺组织及细胞中的表达,H&E染色了解组织结构。7、A2aR基因沉默：采用电转法以A2aR特异性siRNA转染FRTL-5细胞以沉默A2aR表达。8、采用酶联免疫分析检测甲状腺细胞内外VEGF蛋白水平。9、采用直接免疫分析方法检测细胞内外cAMP的含量。10、采用MTT及EdU方法检测内皮细胞增殖情况。结果：1、A2aR甲状腺细胞中的表达：在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺中均扩增出与阳性对照相同的mRNA片段；Western Blotting证实FRTL-5细胞及人甲状腺原代细胞均有与阳性对照相同的蛋白表达；免疫荧光及免疫组化染色证实A2aR蛋白在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺、人甲状腺细胞细胞膜上均有表达。A2aR的特异性激动剂可引起FRTL-5细胞内cAMP剂量依赖性的升高(P<0.05)。2、正常培养FRTL-5细胞中可以扩增出4个VEGF亚型：VEGF188, VEGF164, VEGF144和VEGF120,其中,VEGF120和VEGF164是主要成分；人甲状腺原代细胞中则可以扩增出以下4个VEGF亚型：VEGF189, VEGF165, VEGF145和VEGF121,其中,VEGF121和VEGF165是主要成分。与对照组相比,A2aR特异性激动剂CGS21680和粗提GD患者血清IgG均可剂量依赖性增加I FRTL-5细胞和人甲状腺原代细胞VEGF mRNA各剪接体的表达(P<0.05)。FRTL-5细胞内外的VEGF蛋白也随着CGS21680的作用剂量依赖性地增加(P<0.05)。3、磷酸化CREB、PGC-1alpha及HIF-1alpha均是能够与VEGF启动子结合并促进其转录的转录因子。GD IgG及CGS21680均能增加FRTL-5细胞中p-CREB、 PGC-1alpha及HIF-1alpha的表达。与对照组相比,腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase, AC)的特异性激活剂Forskolin可增加FRTL-5细胞中PGC-1alpha、HIF-1alpha及VEGF的表达。而PKA的特异性抑制剂H89可阻断GD IgG及CGS21680对PGC-1alpha和p-CREB表达的促进作用。4、免疫组化证实,在通过注射表达TSH受体腺病毒建立的GD小鼠模型中,甲状腺VEGF、p-CREB、PGC-1alpha表达均较对照组增加,HIF-1alpha变化不明显。5、A2aR特异性阻滞剂可阻断GD IgG对VEGF mRNA及p-CREB和PGC-1alpha表达的促进作用。在FRTL-5细胞中沉默A2aR后,GD IgG对VEGF、p-CREB、 PGC-1alpha和HIF-1alpha表达的促进作用均减弱。6、取处理后的FRTL-5细胞上清培养内皮细胞,GD IgG及CGS21680处理后的细胞上清可促进内皮细胞的增殖；提前加入ZM241385预处理的FRTL-5细胞上清促进内皮细胞增殖的能力较仅有GD IgG处理的细胞上清减弱。结论：1、A2aR在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺及人甲状腺中均有表达,且该受体蛋白表达于细胞膜。激活A2aR增加细胞内cAMP的含量。2、GD IgG刺激甲状腺细胞可经A2aR激活cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha通路,增加VEGF表达。3、GD IgG通过增加甲状腺细胞的VEGF分泌促进血管内皮细胞的增殖。
参考文献：
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