首页> 正文

丁香假单胞菌MB03转录调控因子InpR调控网络解析和分子机制研究

2020-12-08阅读(478)

丁香假单胞菌MB03转录调控因子InpR调控网络解析和分子机制研究

论文摘要

丁香假单胞菌是一种常见的植物病原菌,其拥有广泛的宿主,能够感染各种各样的植物。能够使植物叶片出现棕色斑点、芽变褐色、树干和树枝的腐烂、植株冻害以及果实的倒塌,其疫情爆发能够造成严重的经济损失。本研究的主要研究对象为本室自主分离的一株具有冰核活性的一株丁香假单胞菌MB03,探索该菌株中的一个GntR家族转录调控因子InpR对其体内基因的转录调控作用以及调控的分子机制。当中断了 InpR基因后,与野生菌株相比,生长明显变慢,表明InpR蛋白直接或间接调控MB03的生长代谢。从这一表型出发,以转录组数据为依据,筛选其中发生明显上下调的基因,设计相应的DNA探针进行体外EMSA实验。通过EMSA等实验验证了 InpR对基因VT471440（氨基酸通透酶）、VT4724100（酰基-CoA脱氢酶）VT4717390（富马酸水合酶）的直接调控作用。对上述三个基因进行RT-qPCR实验,结果发现在突变株MB487中三个基因的表达量菌出现了明显的下调作用,说明InpR正调控这些基因的表达。为了探究小分子物质对InpR调控的影响,从上述靶基因出发,选取了与其功能相关的小分子物质富马酸和相关的氨基酸,体外EMSA实验验证其影响,结果发现小分子物质赖氨酸和精氨酸,能过抑制InpR与靶序列DNA的结合,从侧面验证了 InpR与靶基因之间的调控关系。为了进一步的了解其结合的分子机制,为其结合的模型提供理论依据,通过网站预测,对InpR蛋白进行定点突变并表达纯化,体外EMSA验证突变后的蛋白与靶序列的结合活性,发现其45位和49位的精氨酸突变后失去了结合活性,说明这两个位点的氨基酸是InpR与靶序列结合的关键氨基酸。此外,通过比较InpR结合的DNA序列,发现其符合motif序列5’-NTGGNNNAGNCCAN-3’,这是一个保守性较高的不完全回文序列,与此前研究报道的GntR家族转录调控因子结合模序有一定的相似性,又不完全相同,是一种新的模序。在丁香假单胞菌MB03基因组中存在大量符合这一模序的DNA序列,选取了一部分序列设计探针,通过EMSA进行验证,发现了符合这一模序的6个位于基因的启动子区域的序列,能够与InpR发生直接的相互作用。这些基因涉及到不同的生理过程,说明InpR可能是一个潜在的全局性转录调控因子。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 1 前言
  •   1.1 丁香假单胞菌
  •     1.1.1 丁香假单胞菌的基本特点
  •     1.1.2 丁香假单胞菌致病毒性因子
  •     1.1.3 丁香假单胞菌的主要危害
  •     1.1.4 丁香假单胞菌的防控
  •   1.2 GntR家族转录调控因子
  •     1.2.1 GntR家族转录调控因子简介
  •     1.2.2 GntR家族转录调控因子C端结构域
  •     1.2.3 GntR家族转录调控因子N端结构域
  •     1.2.4 GntR家族转录调控因子变构和连接子的作用
  •   1.3 GntR家族转录调控因子在假单胞菌中的研究现状
  •   1.4 课题研究的目的及意义
  • 2 材料和方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株和质粒
  •     2.1.2 引物设计
  •     2.1.3 培养基
  •     2.1.4 实验所需试剂
  •     2.1.5 实验所用仪器
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 大肠杆菌和假单胞菌质粒的提取
  •     2.2.2 大肠杆菌和丁香假单胞菌基因组的提取
  •     2.2.3 DNA体外重组
  •     2.2.4 大肠杆菌和假单胞菌的转化及筛选
  •     2.2.5 SDS-PAGE样品制备和电泳
  •     2.2.8 大肠杆菌的诱导表达、亲和纯化
  •     2.2.9 Real time-qPCR
  •     2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶阻滞实验（EMSA）
  •     2.2.11 生物信息学分析
  • 3 实验结果与分析
  •   3.1 InpR敲除后影响丁香假单胞菌MB03生长
  •     3.1.1 InpR基因回补菌株的构建
  •     3.1.2 野生菌MB03、InpR中断株与回补菌株生长曲线测定
  •   3.2 InpR调控靶基因的筛选
  •     3.2.1 InpR潜在靶基因的筛选
  •     3.2.2 EMSA实验验证潜在靶基因
  •   3.3 结合序列的鉴定
  •     3.3.1 结合序列的预测
  •     3.3.2 结合序列的进一步验证
  •   3.4 RT-qPCR验证InpR对4个靶基因的调控关系
  •   3.5 探究效应因子对InpR与DNA结合活性的影响
  •   3.6 InpR与DNA结合结构域的验证
  •     3.6.1 InpR DNA结合结构域的蛋白表达和纯化
  •     3.6.2 EMSA实验验证InpR-N与DNA的结合活性
  •   3.7 InpR与DNA结合的关键氨基酸的确定
  •     3.7.1 InpR结合DNA的氨基酸残基分析与预测
  •     3.7.2 InpR预测与DNA结合氨基酸残基的突变
  •     3.7.3 EMSA实验验证InpR突变蛋白的结合活性
  •   3.8 InpR结合序列保守性分析及潜在靶基因的预测与筛选
  •     3.8.1 结合序列保守性分析
  •     3.8.2 InpR潜在靶基因的预测与筛选
  • 4 总结与讨论
  •   4.1 总结
  •   4.2 讨论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 曹志平

    导师: 李林

    关键词: 丁香假单胞菌,转录调控,小分子物质

    来源: 华中农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

    单位: 华中农业大学

    分类号: S432.4

    DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000796

    总页数: 71

    文件大小: 3196K

    下载量: 87

    相关论文文献

    • [1].丁香假单胞菌发酵液中的冠菌素含量测定方法及其应用[J]. 农药学学报 2020(03)
    • [2].意大利:应用酶联免疫诊断猕猴桃溃疡病[J]. 中国果业信息 2017(02)
    • [3].刘俊团队发现丁香假单胞菌和稻瘟菌侵染植物的新机制[J]. 农药市场信息 2020(16)
    • [4].1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析[J]. 江苏农业科学 2020(20)
    • [5].丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的遗传多样性及进化关系[J]. 微生物学杂志 2013(04)
    • [6].我国科学家研究发现病菌侵染植物的新机制[J]. 农药市场信息 2020(17)
    • [7].树木与细菌“联手”降雨的奥秘[J]. 下一代 2014(12)
    • [8].2009年授权的农药专利集锦(一)[J]. 今日农药 2009(03)
    • [9].树木与细菌“联手”降雨的奥秘[J]. 创新作文(初中版) 2018(09)
    • [10].几种咖啡酸酯类衍生物对桑丁香假单胞菌的抑制活性鉴定[J]. 蚕业科学 2016(01)
    • [11].树木与细菌“联手”降雨的奥秘[J]. 第二课堂(B) 2015(Z1)
    • [12].SPINDLY在壳寡糖诱导拟南芥抗丁香假单胞菌中的功能[J]. 西北植物学报 2020(05)
    • [13].间歇式流加补料对丁香假单胞菌大豆致病变种Z2-6冠菌素产量的影响[J]. 植物保护学报 2019(03)
    • [14].基于实时荧光定量PCR技术检测桑丁香假单胞菌[J]. 蚕业科学 2016(02)
    • [15].动物是不可以被随便利用的[J]. 第二课堂(B) 2015(Z1)
    • [16].拟南芥钙调素结合蛋白参与胁迫响应的研究(英文)[J]. 西北植物学报 2012(06)
    • [17].树木防冻防病膜对冰核细菌抑菌效果研究[J]. 辽宁林业科技 2020(01)
    • [18].咖啡细菌性叶斑病病原的分离与鉴定[J]. 热带作物学报 2013(04)
    • [19].丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000甘油激酶基因的克隆与功能研究[J]. 河南农业科学 2018(06)
    • [20].丁香假单胞菌Z2-6半连续发酵生产冠菌素的研究[J]. 农业生物技术学报 2017(12)
    • [21].科学家揭示番茄免疫系统调控机制[J]. 中国食品学报 2015(03)
    • [22].奉新县猕猴桃溃疡病病原菌鉴定[J]. 江西农业大学学报 2019(02)
    • [23].防治水稻细菌性褐斑病药效试验[J]. 农民致富之友 2011(16)
    • [24].猕猴桃溃疡病病原菌及检测方法研究进展[J]. 陕西农业科学 2013(04)
    • [25].欧盟:启动项目保护果树[J]. 中国果业信息 2014(08)
    • [26].烟草野火病系统控制技术[J]. 植物医生 2015(06)
    • [27].应用Logistic模型和王-兰-丁模型分析桑丁香假单胞菌突变株M90-1的冠菌素产量提升因素[J]. 蚕业科学 2014(05)
    • [28].开启方法之门,掌握制胜法宝——说明文篇[J]. 中华活页文选(初二年级) 2012(11)
    • [29].华中农大Kenichi Tsuda团队研究揭秘植物“抵抗”病原菌过程[J]. 农药市场信息 2020(14)
    • [30].臭氧化油防治猕猴桃溃疡病新技术[J]. 农药市场信息 2015(27)

    标签：;  ;  ;  

    丁香假单胞菌MB03转录调控因子InpR调控网络解析和分子机制研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6