刘小蓉[1]2004年在《小鼠胚胎器官发育的形态学和免疫组织化学研究》文中认为昆明小鼠属于哺乳动物，其胚胎的发育过程与人胚胎发育过程有许多相同之处，且妊娠时间短，产量高，给胚胎发育的研究提供较好的生物模式材料，鼠整胚组织切片标本的制作与观察是研究胚胎发育生物学的一个必不可少的重要手段。目前发育生物学研究侧重于生后小鼠发育、胚胎干细胞、细胞基因表达及细胞因子发育调节作用的研究，大部分资料是通过体外分离、培养、观察、研究获得。而针对母体内胚胎发育全过程的相关研究报道不多。现仍有许多疑难问题未能解决，如分化问题、形态发生问题、生长问题、生殖问题、进化问题等一直困惑着生物学家。本研究采用昆明小鼠胚胎为实验材料，采用苏木精—伊红染色、Masson染色、PAS染色、免疫组化染色等方法，研究不同发育时期小鼠胚胎生殖腺、皮肤、肝脏内干细胞的起源、迁移和增殖及形态的变化，探讨生殖腺、皮肤、肝脏发育的机制，为胚胎发育的分子水平调控机制的深入研究提供组织学依据。 一、鼠整胚组织切片标本的制作与观察 选取日龄10～20天小鼠胚胎，采用Bouin固定液固定，梯度乙醇脱水，甲苯透明，石蜡包埋，6um连续切片。结果发现：1)Bouin固定液渗透迅速，固定均匀，组织收缩少，对细胞和组织的微细结构保存效果好；2)脱水从低浓度30％酒精开始，可以防止胚胎组织的过度收缩；3)使用甲苯能够控制透明速度，防止胚胎组织变脆，比二甲苯更适合于胚胎组织切片标本的制作；4)17日龄左右，组织切片标本的制作采用从胚胎中线以矢状面剖开，更有利于胚内各器官的细微结构的保存。 以上结果表明，改良的组织切片标本制作方法有利于小鼠胚胎组织切片经过不同的染色方法完美地显示细胞和组织的形态及某些化学成分的变化，更重要的是它可保证胚内各个器官位置的相对固定，为胚胎干细胞的迁移以及胚胎发育连续观察的研究提供宝贵资料。 二、鼠胚生殖腺发育的形态学及免疫组化研究 采用免疫组织化学的方法标记Oct-4在生殖腺内干细胞中的表达，研究胚胎发育过程中生殖腺的发生、发育机制，同时探讨生殖干细胞新的表面标记蛋白。结果发现：1)生殖腺的发育起始于10日龄小鼠胚胎尿生殖嵴内侧，11日龄出现生殖腺嵴，12日龄形成未分化生殖腺，13日龄胚胎标本切片上可以区分雌雄性;14日龄雄性生殖腺出现翠丸的结构特征，雌性生殖腺于16日龄才开始演变为卵巢;20日龄攀丸内生精小管分化形成两层细胞—底层的支持细胞和表层的生殖干细胞，此时，卵巢皮质出现许多原始的卵泡。2)胚胎发育不同时期，Oct一4在生殖腺内干细胞中的表达呈现动态变化，Oct一4首先在原生殖细胞中呈强阳性染色，阳性细胞数目稀少;随着生精小管的发育，Oct一4阳性细胞逐渐增多，表达逐渐减弱，13一16日龄左右，鼠胚攀丸内主要存在两种Oct一4阳性干细胞，一种为强阳性的原生殖细胞，另一种为弱阳性的精原细胞;17日龄后Oct一4在生殖腺中的表达逐渐减弱。 上述结果表明:1)胚胎发生早期(10日龄左右)表面上皮基底部含有原生殖细胞，原生殖细胞的迁移、增殖和分化与生精小管的发育密切相关。2) Oct一4在生殖腺内干细胞中的表达呈现动态性变化，Oct一4可以作为特异性的表面标记蛋白，强阳性表达在原生殖细胞之中，弱阳性表达在精原细胞之中。最后，伴随着生精小管结构成熟，生殖干细胞进一步分化，Oct一4表达减弱，直至消失。 叁、鼠胚皮肤发育的形态学及免疫组化研究 本研究采用HE和Masson染色的方法研究小鼠胚胎皮肤的动态发育过程，同时应用免疫组织化学技术标记nestin在不同发育时期鼠胚皮肤中的表达，研究皮肤内干细胞的定位和形态变化，探讨皮肤发生发育的细胞生物学机制。HE染色结果发现:10日龄鼠胚皮肤由一层扁平细胞构成，与深层间充质细胞之间无明显的分界线。n一12日龄皮肤由双层细胞构成。13日龄的表皮分化为叁层并出现表皮峭，开始合成胶原，真皮出现疏松结缔组织。14日龄毛囊原基形成，真皮层增厚，表皮和真皮发生密切的接触。巧一16日龄鼠胚皮肤可明显区分表皮、真皮及皮下组织，皮肤的组织结构逐渐成熟。17日龄鼠胚皮肤具有成体皮肤组织结构特征。18日龄以后皮肤的组织结构基本保持不变。免疫组织化学结果显示:nestin在不同发育时期的鼠胚皮肤中均呈强阳性表达，nestin首先是在表皮前体细胞内表达，然后在基底细胞内表达，最后迁移并停留在毛囊前体细胞和部分基底部干细胞中表达。此外，13日龄左右nestin在皮肤肌母细胞中也呈现强阳性表达。 综上所述:1)小鼠胚胎发育第13一14日龄是皮肤发育最旺盛的时期， 一3-表皮、真皮、毛囊前体细胞的生长都达到空前活跃;2) estin的表达与表皮和真皮的发生和发育以及皮肤干细胞的迁移密切相关，nestin首先在表皮前体细胞内表达，然后在基底细胞内表达，最后迁移并停留在毛囊前体细胞中表达。此外本文在研究nestin在不同发育时期鼠胚皮肤中表达的同时发现nestin在肌母细胞中呈现强阳性表达，提示nestin可能是一种标志性蛋白，不但在未分化皮肤干细胞中表达，在肌肉母细胞中也有表达。
郑文宏[2]2013年在《小鼠和人鼻咽发育形态学与免疫组织化学研究》文中指出第一部分小鼠和人胚胎鼻咽发育形态学比较研究背景鼻咽是呼吸道的一部分,位于蝶骨体和枕骨基底部的下方,呈不规则的立方形。人鼻咽有六壁：前壁、后壁、顶壁、底壁及两侧壁。鼻咽壁的组织结构分为4层：粘膜层、粘膜下层、肌层及外膜。粘膜由上皮及固有膜构成；上皮有清晰的基膜,将上皮与固有膜分开。鼻咽部常见的疾病很多,如慢性咽炎；良性肿瘤如咽部乳头状瘤、腺瘤等：恶性肿瘤如鼻咽癌。迄今为止,对正常鼻咽粘膜的形态认识尚有许多分歧。例如对鼻咽复层鳞状上皮的来源,目前主要有2种观点；1、复层鳞状上皮在出生的时候已经存在,属于正常的上皮。2、复层鳞状上皮是在出生后由假复层纤毛柱状上皮化生形成。造成认识分歧的主要原因是难以获取珍贵的人体材料。小鼠是生命科学研究首选的动物模型。研究显示,鼠类99%的基因与人类相同,其胚胎的发育过程与人胚胎发育过程有许多相同之处。而且小鼠妊娠时间短,产量高,可以方便的给胚胎发育研究工作提供生物材料。目前,对人胚胎鼻咽部发育的研究较少,而对小鼠胚胎鼻咽部发育的研究尚未有报道。本文从发育及形态学角度研究人、小鼠胚胎鼻咽解剖学与组织学差异,为鼻咽疾病的研究提供组织学依据。材料与方法收集水囊引产的妊娠E9-28W(周)人正常胎儿鼻咽组织共23例；人胚胎来自合法流产,米索针剂(前列腺素类)引产的正常胎儿。根据孕妇提供末次月经时间结合测量胎儿的顶跟径长度及手足形态,核实胎龄,性别不拘。另取C57BL/6J小鼠妊娠E9.5-19.5D(天)正常胎儿,每个妊娠天取材3例,共33例。小鼠每日下午4-6时交配,第二天早上8时,通过检查阴栓或精子涂片判断小鼠是否受精。受精成功后,判断为种鼠妊娠第一天,即日龄为0.5天。取材实验标本时,在离体4小时内,将整个鼻咽部连同软腭一同切下。胚胎组织用Bouin氏固定液固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,4-6μtm连续切片,H.E染色。从前壁向口咽方向,每隔50微米取一张切片,每张切片的每个壁上各取10个视野(不足10个视野的取全壁),光学显微镜下记录鼻咽的结构,上皮的形态、厚度,细胞层数及粘膜下腺体的形态、出现时间等情况。结果人胚胎鼻咽部在E9W时已经形成。鼻咽部呈不规则的立方形,顶后壁呈约120°的弧形；鼻咽部富含皱襞、隐窝及淋巴组织。小鼠胚胎鼻咽部在E15D形成,它是一个接近直线的弧形管腔,未见淋巴组织及隐窝等结构。人与小鼠胚胎鼻咽部粘膜分化过程相似。鼻咽粘膜的分化具有规律性,但是不同部位粘膜细胞分化不同步。近侧鼻咽部粘膜发育较早,远侧鼻咽部粘膜发育较晚。后壁、侧壁粘膜发育较早,顶壁粘膜发育最晚。但与小鼠胚胎相比,人胚胎的鼻咽部发育成熟相对较早。人胚胎在发育到胚胎期的1/4时(E9W),就已经形成完整、独立的鼻咽部。而小鼠胚胎则需要到胚胎发育期的3/4时(E15D),才形成鼻咽部。小鼠胚胎的鼻咽部假复层纤毛柱状上皮在出生前才完全分化,而人鼻咽胚胎粘膜在胚胎发育中期(E21W)时就已经基本分化完全。同时,鼻咽部的一些组织发育也同样如此,例如粘膜下腺体。人胚胎在E11W时,在粘膜下层已经开始分化形成腺体。胚胎发育至E17W,部分腺体已经形成腺泡样结构,可以清晰的分辨出腺体的类型。E21W以后,大部分腺体已经形成成熟腺体结构。而小鼠胚胎在E17.5D时方开始形成腺体。出生前,腺体尚未发育成熟。E13-28W,人胚胎鼻咽粘膜存在3种类型上皮：大部分是假复层纤毛柱状上皮,少量是过渡型上皮和未角化的复层鳞状上皮。过渡型上皮细胞群主要位于后壁、侧壁及顶后壁交界处。复层鳞状上皮位于前壁。鼻咽部主要有两种不同类型过渡上皮。两类上皮在浅层或者深层有不同程度的鳞状细胞化生现象。过渡上皮所在部位向鼻腔方向,为假复层纤毛柱状上皮；向口咽方向为复层鳞状上皮。过渡上皮细胞形态多样,存在细胞向基底膜面深入生长现象。小鼠胚胎鼻咽粘膜在E19.5D时全部为假复层纤毛柱状上皮。人胚胎从E13W开始,在鼻咽部侧壁及顶侧壁交界处就已经出现杯状细胞存在。小鼠的整个胚胎期,鼻咽部粘膜都未发现有杯状细胞存在。结论1、人胚胎鼻咽部E21W(中期)已基本发育完善,小鼠胚胎鼻咽粘膜在出生前才分化完成。与人胚胎鼻咽部发育相比,小鼠胚胎鼻咽部发育成熟相对较晚。2、人与小鼠胚胎鼻咽解剖学和组织学差异明显,可能导致他们对某些疾病易感性及对疾病的抵抗能力不同。3、过渡上皮的细胞形态多样,存在细胞向基底膜面深入生长及鳞状化生现象,提示过渡上皮细胞的分化受内外胚层分化因素共同调控,性状不稳定。此外,过渡上皮存在的部位可能是内外胚层来源的组织的分界线。第二部分人胚胎鼻咽发育nestin表达的免疫组化学研究背景目前研究发现,许多组织中都存在多潜能的干细胞。尽管对干细胞的确切定义仍存在很多争议,但目前普遍认为干细胞是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的无性系细胞群体。多能干细胞群体可以稳定增殖并保持分化潜能。通过非对称分裂的方式,干细胞产生一个与亲代完全相同的细胞、另一个可以编程为其他细胞类型的细胞。鼻咽粘膜上皮细胞终身不断自我更新,是依靠干细胞持续增殖、分化以取代终末分化细胞来完成。同时,鼻咽是人体与外界相通的要道,具有重要的防御、呼吸、吞咽、发声共鸣等功能。由于与环境之间直接接触,鼻咽部很容易受到致病因子的侵袭。因此,鼻咽粘膜组织经常处于微小的损伤过程中。在鼻咽部受到损伤后,干细胞分裂加速,起到促进创伤修复的作用。研究者们普遍认为在鼻咽部的不同部位存在着一群具有干细胞特征的细胞亚群。通过研究发现,鼻咽部确在一群具有增殖、分化潜能的细胞,但由于鼻咽部解剖学结构和功能复杂,细胞种类繁多,干细胞研究进展缓慢。对如何识别鼻咽部的多潜能的干细胞一直是人们努力探索和研究的难题。目前尚缺乏有效的手段来鉴定鼻咽上皮干细胞,这成为临床应用干细胞治疗鼻咽部疾病的障碍。目前,发现和鉴定干细胞的方法主要是通过鉴定细胞是否存在干细胞的特异性标记物。大部分的干细胞的发现都归功于标记物的使用。但是,目前尚未有关于正常鼻咽部干细胞特有的标记物的相关报道。Nestin是神经干细胞的标记物。同时,在胚胎发育早期,多种组织也强烈表达nestin。我们课题组在前期研究中发现,nestin在鼻咽癌组织中高表达。近年来研究发现,组织癌变的过程,常常表达胚胎发育过程中出现的蛋白,这些蛋白在成熟的组织中表达极少。利用这些蛋白作为肿瘤分子标志物,己被应用到肿瘤的早期诊断以及疗效、预后评价。Nestin可否作为鼻咽部干细胞标记物之一?带着这一问题我们靶定nestin作为研究目标,研究人胚胎鼻咽发育过程中nestin表达情况,对鼻咽部发育过程中的干细胞进行鉴定。初步了解nestin与鼻咽发育的关系,明确nestin是否可以作为鉴定鼻咽干细胞的标记物及鉴定方法,为胚胎鼻咽发育的分子水平调控机制的深入研究提供组织学依据。材料与方法取材E9-28W人胚胎的鼻咽部材料(见第一部分)。用免疫组织化学法检测人鼻咽部nestin表达情况。免疫组织化学法采用SP法,一抗使用鼠抗人单克隆抗体,抗体稀释度为1：800。取nestin阳性组织切片,E11W人胚脑组织,作为阳性对照。结果E9-28W人胚胎鼻咽粘膜未发现nestin阳性细胞存在。Nestin阳性细胞存在于粘膜下部分未分化完全的腺体细胞、毛细血管内皮细胞及几乎全部肌肉组织的细胞质中。胚胎发育不同时期,nestin在鼻咽部中的表达呈现动态变化。El1W时,可检测到nestin首先在粘膜下肌肉组织及毛细血管内皮细胞中呈阳性染色,阳性细胞数目稀少；随着肌肉组织的发育及毛细血管增多,nestin阳性细胞逐渐增多。E13W开始,在粘膜下腺体中检测到部分腺体细胞呈强阳性染色。E11-28W,几乎所有肌母细胞nestin染色始终处于强阳性状态,无明显减弱。粘膜下腺体在E17W时nestin阳性细胞最多。伴随着腺体逐渐成熟,腺体干细胞进一步分化,nestin表达逐渐减弱。E21W以后,只有少量nestin阳性的腺体细胞。结论1、人胚胎发育的E17W是鼻咽发育最旺盛的时期。此时,上皮生长迅速,过渡上皮开始分化为两类形态不一的过渡上皮(见第一部分),而腺体中nestin阳性细胞数量达到高峰。上皮细胞及腺体前体细胞的生长发育都达到空前活跃。2、Nestin是人胚胎鼻咽部干细胞的标记物之一。它在人胚胎期鼻咽部的多种组织中表达,与鼻咽的发生和发育密切相关。但未能证明nestin与粘膜上皮的发育相关。可能与取材的时间有关,不能排除在鼻咽发育的更早的时间有nestin的表达。第叁部分Nestin转基因小鼠咽喉部增生性变化的研究背景Nestin属于Ⅵ型中间纤维丝蛋白,约220-250kDa。它在胚胎发育早期过程中,在神经外胚层组织强烈表达,随着组织发育分化,nestin表达逐渐减少,故以它作为神经干细胞的标记物。在胚胎发育早期,多种组织也强烈表达nestin。在成体组织中,nestin只在部分具有分化潜能的细胞中表达,如在皮肤、心血管再生过程中表达增高。Nestin在多种肿瘤组织中表达增加,蛋白表达量与肿瘤的恶性程度成正相关。体外研究表明,nestin能增强细胞的增殖和存活能力。Nestin和糖皮质激素受体结合后使磷脂酰肌醇3激酶活性增强,通过下游的一系列酶促反应促进神经祖细胞进行有丝分裂,使细胞增殖。在永生化的神经祖细胞系ST15A细胞中,过表达nestin可以对H202造成的细胞损伤起保护作用。Nestin通过Cdk5/p35信号通路,增强细胞生存能力,抑制凋亡发生。但也有体外研究发现,nestin与增殖无直接相关。在nestin被siRNA抑制表达之后,培养的成神经瘤细胞与星形细胞瘤细胞生长减弱,但细胞ki67的表达并不减少。同时,nestin在体内的确切功能并没有明确。通过对nestin基因敲除小鼠的研究表明：在nestin+/-基因型的杂合子小鼠中,虽然nestin的表达量大幅减少,但并不引起明显的小鼠发育异常。说明nestin的表达量减少,可能并不影响小鼠的发育和生存。但纯合子小鼠,即nestin-/-基因型的小鼠,在胚胎发育过程中出现神经管发育缺陷并致死。Nestin缺失引起神经管细胞大量凋亡,导致凋亡的作用和nestin的细胞骨架功能无关。这说明nestin的存在对维持神经干细胞的生存和自我更新是必须的,而缺乏nestin对神经干细胞的增殖无影响。正常小鼠中,nestin在神经系统外的组织也广泛表达。但nestin基因敲除小鼠其它器官并未发现明显异常。可见在nestin的体内功能十分复杂。目前,尚未有关于nestin过表达的转基因动物的研究报道。为研究nestin在体内的功能,我们建立了nestin转基因小鼠。本文探讨nestin过表达对小鼠咽喉部发育的影响。材料与方法C57BL/6J小鼠来源的F5代的E14.5-19.5D的nestin转基因小鼠胚胎及F3代约12个月大小的nestin转基因小鼠,性别不拘。取部分小鼠新鲜组织,提取小鼠DNA后,PCR鉴定小鼠基因型。取材E14.5D、E15.5D、E16.5D、E17.5D、 E18.5D、E19.5D、12M的小鼠咽喉部组织,将小鼠分为实验组与对照组,实验组为nestin阳性小鼠,对照组为野生型小鼠。每个年龄的小鼠各3只／组。将小鼠咽喉部连同周围的组织一同切下后,用Bouin氏固定液固定(组织脱水、染色等步骤见第一部分)。H.E染色后显微镜下观察比较两组样本的咽喉部形态学发育差异。同时,免疫组织化学法检测咽喉部nestin表达。免疫组织化学法采用SP法,组织使用鼠抗人nestin单克隆一抗抗体检测,4℃孵化过夜,抗体稀释度为1：800。结果分析：采用SPSS13.0软件,实验组与对照组中咽喉部产生肿物的小鼠数量的比较采用卡方检验。若P<0.05,认为二者差别有统计学意义。结果Nestin在转基因小鼠胚胎咽喉部、气管咽粘膜大部分细胞、及其他器官中表达阳性。转基因小鼠咽喉部发育与正常小鼠相比,无明显不同。但约28%转基因小鼠咽喉部粘膜形成赘生物。实验组与对照组所得结果比较,其差别具有统计学意义(P=0.008)。结论小鼠体内过表达nestin后,引起小鼠咽喉部肿物的发生。Nestin过表达可能导致小鼠咽喉部粘膜细胞的增殖与凋亡失调。
任春宇[3]2012年在《极北鲵消化道组织学及其内分泌细胞的研究》文中提出组织学观察结果显示，极北鲵消化道胚后发育具有一定的时空顺序：消化道各器官是按照胃、肠、食管的顺序逐渐分化并不断完善的，消化道壁各层是按照粘膜上皮、环肌层、纵肌层、外膜、固有层、粘膜下层和粘膜肌层的发育顺序依次出现的。而极北鲵成体消化道均由粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜等4层结构组成。Grimelius法显示，嗜银细胞最早出现在41期胃粘膜上皮之间；肠中嗜银细胞首先出现在42期；而食管中嗜银细胞出现最晚，在43期被检测到。而嗜银细胞在其成体消化道各部分均有分布，其中以直肠部分布密度为最高，胃幽门和回肠次之，胃体处最低。并且其形态是多种多样的：有圆形、椭圆形、锥体形和梭形等。根据嗜银细胞的形态，认为其具有内分泌、外分泌和旁分泌的功能。免疫组织化学方法显示，5-HT细胞分布于消化道全长，分布密度以食管部为最高，胃幽门部次之，十二指肠为最低。SS细胞除了贲门、空肠和直肠以外，其余各部位均有分布，且SS细胞在胃幽门部分布密度为最高，回肠部最低。Gas细胞仅在十二指肠和空肠中检测到。Glu细胞仅在贲门和胃体中观察到。SP细胞只在胃体部检测到，而PP细胞未检测到。极北鲵消化道内分泌细胞细胞的形态是多种多样的：圆形、椭圆形、锥体形和梭形。总体看来，内分泌细胞的分布密度和形态与其消化道的生理功能是相适应的。
林吉茂[4]2008年在《山羊皮肤发育形态学和免疫组织化学研究》文中提出为了解山羊皮肤组织发生发育规律及β1整合素、表皮生长因子及受体在发育过程中的表达及其功能意义,以探讨皮肤组织发生过程中表皮干细胞和细胞因子的分布规律。本研究以6~18周龄的山羊胎儿皮肤为试验材料,采用组织学常规石蜡制片技术,苏木精-伊红染色和Masson叁色染色方法详细研究了山羊皮肤组织发生发育过程中的形态结构和变化规律,并结合透射电镜观察了不同发育时期的山羊胎儿皮肤的超微结构变化特点;在了解皮肤组织发生发育特点和规律的基础上,进一步运用免疫组织化学SP法对山羊皮肤发育过程中β1整合素、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)及其受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的分布及变化规律进行了系统的研究。结果如下:1. 6~7周龄的山羊胎儿皮肤表面平整,出现一层单层扁平上皮的表皮结构;8周龄时变为单层柱状上皮;9周龄时表皮增生为表层与生发层两层,表皮与间充质之间以基膜相连;10周龄时表皮分为表层、中间层和生发层叁层,真皮层开始出现,与表皮分界明显,其中含有少量胶原纤维和弹性纤维,在局部还可见到基底层细胞围成的团状实心细胞群向间充质内突出形成的毛芽;11周龄,表皮继续增厚,深层细胞内出现少量张力原纤维,并发现朗格罕斯细胞,表皮内还可见到原始毛囊及其附近形成的实心细胞索即汗腺;12~13周龄,表皮细胞出现角化层、透明层及颗粒层的分化,可见明显的汗腺,真皮乳头层形成,真皮内胶原纤维的合成明显增多;14~15周龄,表皮深层细胞内张力原纤维增多、变粗,并发现典型的桥粒结构,毛球上皮细胞索开始分化为外根鞘、内根鞘的原基和毛发的前体,在毛囊的两侧可见皮脂腺和竖毛肌,真皮内胶原纤维继续增多,深部可见较多汗腺分泌部的断面;16~17周龄,表皮层开始变薄,毛开始形成,并随着发育逐渐长出体表,真皮层内胶原纤维和弹性纤维增多,真皮层厚度加大;18周龄以后,皮肤及其衍生物结构继续发育,渐趋完善。2.在胎儿发育第6周就出现EGF与EGFR的较弱表达,以后随着胎龄的增加,EGF与EGFR的表达呈不断增高的趋势。从分布部位来看,在胎儿发育的11周前,EGF阳性反应主要定位于表皮基底层细胞、毛囊上皮细胞和成纤维细胞等的胞浆内,EGFR则主要位于相应部位细胞的胞膜上;11~16周,随着胎儿的生长发育EGF和EGFR的表达量增高,分布也更广泛,从表皮的基底层、棘细胞层、真皮的毛囊细胞和成纤维细胞扩展到血管的内皮细胞、汗腺上皮细胞和竖毛肌,EGF主要定位于这些细胞的胞质,EGFR则主要分布于这些细胞的膜上;17周至出生,随着表皮的明显变薄,EGF主要分布于基底层细胞和毛囊上皮细胞,阳性反应继续增强。3.胎儿发育的第8周,表皮呈现较弱的β1整合素(β1-integrin)阳性反应;9~10周,β1-integrin阳性产物主要出现于表皮深层细胞的胞质内;11~13周,β1-integrin的分布范围逐渐涉及到表皮的各层结构;14~16周,随着胚胎发育进程,β1-integrin的分布范围扩大至毛囊隆突区、外根鞘和汗腺上皮细胞,表皮细胞的阳性反应逐渐减弱;17周后随着表皮的变薄,β1-integrin在表皮的分布只限于基底层的局部,其它部位的阳性细胞数量逐渐减少,而毛囊隆突区和外根鞘部的表达继续增强。
李茜[5]2007年在《异育银鲫肠道组织形态学分析及肠道发育的营养调控》文中研究指明本试验首先对异育银鲫的肠道组织形态及肠道G细胞的分布状况进行观察，并根据观察结果将其肠道进行划分；而后，进一步研究不同发育阶段异育银鲫肠道组织形态的变化特征；最后，探讨棉粕蛋白酶解物和豆粕蛋白酶解物对异育银鲫肠道生长发育的影响，旨在为今后鲤科鱼类的消化生理研究提供科学依据。本试验分为以下叁个部分：1．异育银鲫肠道组织形态结构观察及功能分析研究本试验采用石蜡组织切片法和免疫组织化学法，对异育银鲫肠道组织的形态结构及胃泌素分泌细胞(G细胞)在肠道组织中的分布情况进行了研究，以探讨其肠道各部的功能。结果表明：异育银鲫的肠道横截面积、肌层厚度、粘膜皱襞个数、皱襞高度以及皱襞宽度的形态结构前后变化明显；沿肠道由前向后，肠道横截面积逐渐减小，粘膜皱襞个数逐渐降低，变化具有规律性；除肛门附近的肠道组织外，异育银鲫肠道各处均有G细胞分布，其分布密度由前至后逐渐降低，且G细胞分布密度的变化规律与上述5个形态指标的变化规律相一致。由此，可将异育银鲫肠道划分为前肠、中肠、后肠及直肠；其中各段长度分别为肠道全长的13.44％±2.19％、39.42％±0.70％、38.64％±1.94％和8.50％±1.02％。2．不同发育阶段异育银鲫肠道组织形态变化特征异育银鲫肠道的粘膜皱襞个数、粘膜皱襞宽度、肌层厚度和肠道横截面积这4个形态学指标，沿肠道由前至后的变化趋势，在3个发育阶段中均分别保持一致；其中，粘膜皱襞个数在3个发育阶段始终表现为先减少后增多的趋势；粘膜皱襞宽度在3个发育阶段均以前肠的值为最大，中肠与后肠之间差异始终不显着(P＞0.05)；肌层厚度和肠道横截面积在3个发育阶段，沿肠道由前至后，均始终表现为下降趋势。但粘膜皱襞高度由前至后的变化趋势，在3个发育阶段却发生较大变化；其中，幼鱼前期和成鱼期，肠道粘膜皱襞高度由前至后均呈现逐渐降低的趋势，而幼鱼后期则表现为先升高后降低的势。3．植物蛋白酶解物对异育银鲫肠道发育的影响采用石蜡切片法和免疫组织化学法，对异育银鲫的肠道组织形态和G细胞分布密度进行观察，以研究棉粕、豆粕蛋白酶解物对肠道发育的影响及其作用机理。选用异育银鲫1龄鱼种360尾，平均初重为35.05g，随机分为3组，每组设3个重复。其中Ⅰ为对照组，饲喂基础日粮，Ⅱ、Ⅲ为试验组，其饵料在基础日粮基础上，分别用3％棉粕蛋白酶解物和3％豆粕蛋白酶解物替代相应比例的棉粕和豆粕，并保证其粗蛋白水平不变。正式试验120d。结果表明：与对照组相比，Ⅱ、Ⅲ组试验鱼肠道横截面积显着增大(P＜0.01)，肠长虽有增长趋势，但差异不显着(P＞0.05)；而肠道组织形态均发生显着变化，粘膜皱襞个数、皱襞高度、粘膜皱襞高度／肌层厚度，单位长度肠道粘膜面积均增大，其中皱襞个数差异显着(P＜0.05)，其余叁个形态学指标分别与对照组差异极显着(P＜0.01)；与对照组相比，两个试验组异育银鲫肠道G细胞分布密度均有所提高，其中棉粕蛋白酶解物组差异显着(P＜0.05)，豆粕酶解物组差异不显着(P＞0.05)。
孙晓艳[6]2008年在《表皮细胞去分化形成表皮干细胞的基础研究》文中提出目的:从建立表皮细胞去分化模型入手,比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞在功能和生物学特性等方面的异同点,为实现无延迟、无瘢痕完美修复及皮肤组织的再生提供新的实验参考。方法:采用免疫组织化学的方法探寻胎儿皮肤中的表皮干细胞(epidermal stemcells,ESCs),研究不同发育时期ESCs在胎儿皮肤中分布与迁移。采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离培养人ESCs,观察其形态及增值分化的特点,并进行细胞免疫组织化学鉴定。同时,提取小鼠胚胎发育中期组织液,模拟表皮干细胞壁龛微环境,采用免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR技术研究表皮干细胞在此环境中的表型变化,探讨表皮干细胞周围生长微环境在表皮干细胞“命运”决定过程中的作用。此外,本研究在前期的工作基础上,建立表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型,采用免疫组织化学、MTT法、免疫荧光染色、流式细胞技术、扫描及透射电镜检测技术、RT-PCR、Western-blot及TRAP法再次验证表皮细胞通过去分化途径形成机体内源性去分化来源的表皮干细胞,参与皮肤组织的创伤修复与再生。同时,从细胞表型、超微结构及生物学功能等方面比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞二者之间的异同点。结果:表皮干细胞在从基底层经棘层和颗粒层到角质层的分化迁移过程中,经历了有序的成熟模式,这一过程与角蛋白的程序性表达密切相关;毛囊的发生、发育不仅与ESCs的增殖分化有关,同时受到毛乳头的诱导作用。改良的Ⅳ型胶原选择黏附法能够高效的分离表皮中的干细胞。这些细胞具有干细胞的形态特点表达α_6整合素,β_1整合素,CK19,CK14,p63,Nestin及PCNA为阳性,而CK10染色为阴性;激光共聚焦检测显示α_6整合素和CD71在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异,可以作为区分标志之一,为ESCs及其亚群的分离与鉴定提供实验参考。此外,流式细胞检测显示胚胎组织提取液作用后α_6~+CD71~-表达细胞由细胞总数的22.49%减少至10.92%,而α_6~+CD71~+、α_6~-CD71~+表达细胞则分别由诱导前的62.29%及0.19%增加至诱导后的68.34%及4.51%。RT-PCR结果表明胚胎组织提取液作用后,表皮干细胞中β_1整合素、CKl9、CK10表达增强,而CK14表达减弱。本文在前期工作的基础上,建立了表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型,免疫组织化学染色结果显示去基底层的超薄皮片CK19和β_1整合素染色为阴性;而移植第3、5、7d后,存活皮片内CK19和β_1整合素染色阳性的细胞重新出现,并且呈多层分布;流式细胞仪检测结果表明移植前后α_6~+CD71~-和α_6~+CD71~+细胞比例有明显差异。人细胞系HEKa体外培养6～7代时,开始出现老化迹象。细胞免疫组织化学检测结果显示此时细胞表达CK10为强阳性,而β_1整合素、CK19表达为阴性,CK14则呈现弱阳性染色。在浓度为100ng/ml的bFGF诱导培养36～48h后,老化的HEKa细胞之间开始出现新生的表皮干细胞样克隆。这些细胞体积较小,为圆梭形,形态均一、折光性强、胞质近中央处有圆形核,核浆比大,因此称之为去分化来源的表皮干细胞(dHEK细胞)。dHEK细胞不但具有克隆形成能力,而且具有强大的分裂增殖能力。随着培养的延长,dHEK细胞克隆的面积逐渐增大,相互连接成片,并且和周围的HEKa细胞之间相互嵌合形成表皮嵴样结构。免疫组织化学检测发现bFGF诱导培养后,实验组细胞中β_1整合素、CK19和CK14的表达增强;CK10作为终末分化细胞的标志,在bFGF诱导组中的表达明显降低。流式细胞检测分析显示bFGF作用后,实验组CK14表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为87.14%和67.26%)。CK19表达阳性的细胞也由原来的15.74%增加至被检测细胞总数的74.77%。而bFGF诱导作用后,被检测细胞中表达CK10阳性的细胞数量较对照组明显下降(分别为4.56%和98.56%)。此外,RT-PCR和Western-blot检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的现象。在bFGF作用后,表皮细胞重新程序化,并获得其前体干细胞的某些潜在能力,表达表皮干细胞的一些未分化蛋白。另外,表皮干细胞和去分化来源的dHEK细胞之间有两个显着的相同点:(1)二者都表达表皮干细胞的表面标志,如β_1整合素、α_6整合素和CK19等;(2)二者都存在着α_6整合素和CD71表达的区域性分布差异。此外,表皮干细胞和dHEK细胞之间的差异点有:(1)CD71-PE和α6 integrin-FITC直标双色荧光流式检测分析显示表皮干细胞和去分化来源的dHEK细胞之间存在着细胞亚群的分布差异;(2)hTERT在表皮干细胞和去分化而来的干细胞中存在着亚细胞定位差异。结论:ESCs并非真正静止的未分化细胞,而是一种已经进入分化状态但是仍具有多向分化潜能的干细胞,其增殖分化行为不但受到自身程序化基因表达的影响,同时又受到其所处的微环境的调控。bFGF能够诱导表皮细胞在体外发生去分化,去分化而来的表皮干细胞与ESCs相比具有更加强大的分裂增殖能力,可以作为种子细胞应用于皮肤创伤修复与再生的相关研究之中。
孙晓艳[7]2004年在《肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究》文中研究表明本文采用免疫组织化学、细胞培养、分子克隆、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶联免疫吸附实验、放射免疫等方法和技术，就近些年来干细胞领域研究的热点问题——干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞进行了研究，着重探讨了肝干细胞在肝脏中的分布及迁徙，并从基因和化学因子两个方面探讨肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的机制。 全文共分四个部分。 第一部分，胎肝中肝干细胞的免疫组织化学研究。采用免疫组织化学方法显示不同时期人胚胎肝脏的干细胞，分析肝干细胞的形态与分布特点及发育过程中干细胞在肝脏中的迁移，探讨肝脏的发生发育及肝内干细胞的来源。 本课题采用免疫组织化学的方法借助肝干细胞的表面表达蛋白CD34、C-11、CK19、OV6标记胎儿肝脏中的干细胞，观察不同发育时期肝干细胞在胎肝中的分布与迁移。结果发现胎肝内汇管区周边界板处含有丰富的卵圆样干细胞，这些细胞具有相似的形态和分布，分别表达CD34、C-11、CK19和OV6。阳性细胞紧密排列成管，呈鞘样包绕着原始汇管区，部分包绕着初级汇管区，随着次级汇管区的成熟，卵圆样干细胞逐渐局限于赫令氏管周围。此外，胚胎发育的不同阶段均可见单核样细胞分散在肝索、肝血窦之内；这些细胞分别表达CD34、OV6，多见于汇管区的间充质组织之内，肝血管内少见。 以上研究表明，1)汇管区周边界板处含有丰富的干细胞，胚胎发育早期此处可能是肝脏发育的起点，这些干细胞逐渐分化为胆管上皮样细胞，然后分化为肝细胞和胆管上皮细胞。2)CD34、C-11、CK19和OV6分别阳性的卵圆样干细胞具有相似的形态和分布，都表达肝干细胞的特征性表面蛋白可能是同一来源的干细胞。3)肝内存在着造血干细胞来源的干细胞，这些细胞尽管形态和分布相似，OV6、CD34表达阳性的单核样干细胞是否属于同一细胞类型，它们和造血干细胞的关系，还需要进一步的深入研究。 第二部分，神经中间丝蛋白Nestin在胎肝干细胞中的表达。为了进一步探讨肝干细胞向着胰岛素分泌细胞方向分化的可塑性，采用免疫组织化学的方法研究标记不同发育时期人胚胎肝干细胞中Nestin的表达，研究肝干细胞向着胰岛素分泌细胞方向分化的可能性的同时探索肝干细胞新的表面标志蛋白。 不同发育时期胎儿肝脏，取材、固定制成石蜡切片，ABC法标记神经前体细胞的特异性表面标记Nestin在胎肝干细胞中的表达。结果发现汇管区周边界板处卵圆样干细胞表达Nestin阳性，Nestin阳性细胞单层紧密排列成管，呈鞘样包绕着早期汇管区，部分包绕着初级汇管区，随着次级汇管区的成熟，Nestin阳性卵圆样干细胞逐渐局限于赫令氏管周围;此外胚胎发育不同时期均可见Nestin阳性的单核样干细胞分布在肝实质内。 以上研究表明，肝内的卵圆样干细胞和单核样干细胞都可以表达Nestin，具有向着胰岛p一细胞方向定向分化的前提。Nestin可能是一种特征性的蛋白在未分化的内胚层来源的干细胞中表达。 第叁部分，pEGFP一PDx一1表达载体的构建。构建真核表达质粒，从基因诱导方面着手研究胰腺内分泌细胞发育的关键基因PDX一1在肝干细胞定向分化中的调控机制，为胰岛及p一细胞发育的基因调控机制的研究提供理论参考。 参考分子克隆技术，采用PCR的方法从SK900/BLSCRIPT质粒中扩增PDX一1，同时将一个单个限制性酶切位点连接反应转变为以Hindm和BamHI为末端的双限制性酶切位点连接反应，将PDX一1。DNA插入PEGFP一cl的多克隆位点中，构建一个重组表达质粒PEGFP一cl一PDx一1，并对重组子进行Smal单个酶切鉴定。 将PDX一1插入pEGFP一Cl的c一末端，在pEGFP一cl启动子的作用下与pEGFP一Cl一同表达形成融合蛋白，同时以GFP作为报告基因，减小外源基因表达产物对细胞的毒性，提高PDX一1在真核细胞中的表达，而且不影响其目的蛋白的结构和功能，对研究PDX一1调控肝干细胞的定向分化机制具有重要的意义。 第四部分，卵圆细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞。在充分研究肝脏内干细胞的分布和定位的前提下分离大鼠肝脏卵圆细胞，在化学诱导剂作用之下使卵圆细胞定向分化为胰岛素分泌细胞，检测诱导后肝干细胞的表型变化，研究肝干细胞的诱导分化机制，为干细胞的定向分化和干 一4-细胞诱导分化的替代疗法的临床实践提供实验参考。 首先以3’一me一DAB喂食大鼠四周，刺激肝卵圆细胞的迅速增生，改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞，观察其形态、描述其增值特点并进行免疫组织化学鉴定。随后更换含有Nicotimide和高浓度葡萄糖的RPMI 1 640培养液继续培养，同时以不含诱导剂的RPMI 1 640培养液培养的卵圆细胞作为阴性对照;sDs一聚丙烯酞胺凝胶电泳、ELIsA、班A鉴定细胞表达产物。结果发现改良的梯度离心的方法能够有效的分离大鼠肝卵圆细胞，卵圆细胞胞体为卵圆形，代谢缓慢，具有干细胞的特点，可以形成集落，并且0V6、CD34、Nestin染色呈阳性。SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳显示诱导组的细胞样品在相应位置上出现胰岛素表达条带，阴性对照组没有该条带出现;ELISA?
李力燕[8]2007年在《人胚胎脊髓发育过程中NTs家族及其受体的表达及变化》文中指出目的探讨神经营养素家族及其受体与人胚胎脊髓发育的关系。方法应用免疫组织化学、原位杂交、蛋白质印迹和逆转录酶多聚酶链反应等方法系统研究神经营养素家族及其受体在人胚胎3w～8m脊髓内的表达及变化。结果1．NGF蛋白在3w末和4w的神经管上皮中已有表达，在5～7w，随胚胎发育在套层、基板、翼板的神经细胞前体表达，阳性反应随胚龄增加。8～9w，套层大量的阳性细胞，翼板较基板更为密集。逐渐出现分化中的各种形态的成神经细胞。3m后，阳性细胞密度下降，但灰质内可见形态逐渐趋于成熟的神经细胞，数量逐渐增加。6m后脊髓形态趋于成体化，灰质内阳性神经细胞的形态更趋典型。6w时边缘层可见阳性纤维，3m时白质内可见少量阳性胶质细胞，6m时增多。通常胶质细胞的分化晚于神经细胞，白质内阳性纤维的出现早于胶质细胞；Western blotting蛋白定量分析显示：6～8w，蛋白含量随胚龄逐渐增加，8、9w时达到高峰(P＜0.05)，3m后下降(P＜0.05)，6m后又有所增加，并保持相对平稳。蛋白含量测定的结果与免疫组化定位表达的变化相吻合；原位杂交显示NGFmRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性，晚于蛋白表达出现的时间。之后随脊髓的发育，阳性表达增加，至8w、9w时，可见分化中各种形态的成神经细胞，3m时，细胞密度下降。至4m时，可见阳性的多极神经元。6～8m，阳性神经细胞形态更趋成熟。白质内纤维和胶质细胞的阳性反应晚于神经细胞，表达模式与NGF蛋白的相似；RT-PCR的结果显示，NGFmRNA的表达在6～8w是逐渐上调的，8w时达到峰值(P＜0.05)，从第9w后表达下调，在第4m时下调到最低值(P＜0.05)，以后又逐渐上调。NGFmRNA含量测定的结果与原位杂交定位表达的变化相吻合；2．TrkA蛋白在3w末4w的神经管上皮、内界膜表达阳性，5～7w随神经管的发育相继在套层、基板、翼板的部分细胞胞浆表达，8～9w，套层阳性细胞密集，翼板较基板更多，细胞核膜和核仁明显，逐渐出现分化中的各种形态的阳性成神经细胞。10w～3m，多突起的大神经元逐渐增多，白质内胶质细胞阳性。4～5m，背角、腹角内较多阳性神经元，白质内可见阳性胶质细胞和纤维。6m后趋于成熟；Western blotting显示：TrkA蛋白在6w已有一定的含量，但比较低，6w到3m之间含量缓慢增加，4m时明显增加(P＜0.05)，5m，含量有所下降，7m略有升高。与免疫组化定位表达的变化基本吻合：原位杂交显示TrkAmRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性，晚于蛋白表达出现的时间。之后相继在套层、基板、翼板表达，阳性反应逐渐增加，阳性神经细胞从以幼稚的无极成神经细胞为主转为以多种形态为主，9w可见少数多极成神经细胞，3～4m逐渐增多，并渐趋成熟。表达模式与TrkA蛋白的相似：RT-PCR的结果显示：9w起可检测到TrkAmRNA的表达，3m时达到最高(P＜0.05)，从4m时开始下调，但幅度不大；3．BDNF蛋白在3w末4w的神经管内界膜、外界膜表达，阳性反应较强，随脊髓的发育，BDNF表达的部位与NGF的相似，但早期在神经上皮细胞突起的表达较为明显，晚期，在6m时除在灰质内见到各种形态的神经细胞外，还可见深染的白质纤维束；Western blotting显示：BDNF蛋白含量测定的结果与免疫组化定位表达的变化基本相吻合，变化曲线与NGF的相似；原位杂交显示BDNFmRNA在3w末4w的神经管上皮即有明显表达，表达模式与蛋白的相似，阳性反应较NGF强；BDNFmRNA含量测定的结果与原位杂交定位表达的变化相吻合；4．免疫组化显示TrkB蛋白在5w时的神经管内界膜、神经上皮和套层呈弱阳性反应，之后在发育中脊髓的表达部位与BDNF蛋白的相似，但阳性反应明显弱于BDNF；蛋白定量显示：TrkB从第6w至4m呈现逐渐上调的趋势，但未见明显上调的时间段，4m后下调，6m后略有上调，总体水平很低。与免疫组化定位表达的变化相吻合；原位杂交显示TrkBmRNA在5w的神经管有表达，表达模式与TrkB蛋白的表达相似。RT-PCR结果显示，早期TrkBmRNA随发育逐渐上调，8w时达到峰值，从9w开始表达下调，类似于BDNF的变化；5．NT-3蛋白的表达很具特征性，阳性表达以细胞突起和纤维最为突出。NT-3在第3、4w的神经管上皮即呈强阳性反应，各期细胞的阳性突起呈放射状，5～8w，神经上皮层及套层大量放射状纤维，8～11w，阳性神经细胞前体也较丰富。阳性反应出现的部位与NGF和BDNF相似；Westernblotting分析显示：NT-3从第6w开始即达一定水平，并且逐渐上升到第9周达峰值(P＜0.05)，之后下降并维持在一定水平，与定位表达的变化吻合；原位杂交显示NT-3mRNA在4w的神经管上皮呈弱阳性反应，晚于蛋白的表达，且阳性弱。表达模式与蛋白的相似，但在细胞突起内的表达不如蛋白的突出；RT-PCR的结果显示，NT-3mRNA的变化与定位的表达变化相吻合；6．免疫组化定位表达显示TrkC蛋白在3w末的神经管内界膜呈弱阳性反应，表达模式与NT-3相似，但在细胞突起内的表达不如NT-3那么突出，但较其它两种受体TrkA和TrkB的明显；Western blotting的测定结果与定位表达的变化相符；TrkCmRNA的定位表达：在4w的神经上皮部分细胞表达，5w起其表达部位与TrkC蛋白的相似，但阳性较弱；RT-PCR结果显示：TrkCmRNA含量的变化与定位表达的相符；7．NT-4蛋白在3w末的神经管上皮呈弱阳性反应，表达模式与NGF、BDNF相似，但6m时，腹角神经元非常明显，中间带、后角各板层均可见阳性神经元。白质的后索、外侧索比前索的阳性胶质细胞多：Western blotting结果显示：NT-4于第6w已存在，之后缓慢升高到第8w后快速增加，第9w达高峰(P＜0.05)，以后又缓慢下降，第5、6m在一定水平保持平稳。NT-4蛋白含量的变化基本与免疫组化显示的形态学变化一致；NT-4mRNA的定位表达于4w的神经管上皮可见，其表达模式与蛋白的相似；RT-PCR的实验结果显示，NT-4mRNA含量的变化基本与原位杂交显示的形态学变化相似；8．在检测时段内，神经管上皮不同细胞周期的室细胞或室管膜上皮细胞始终有部分表达各种因子。结论1．神经营养素家族各因子(NGF、BDNF、NT-3、NT-4)广泛分布于人胚胎脊髓发育各个时期的各种结构中，并且在早期脊髓的表达更强，各因子的表达既有重迭又有差异，提示神经营养素家族在人胚胎脊髓发育的各个阶段特别是胚期脊髓的发育中发挥着重要的作用，但在不同的区域和细胞又各自发挥着不同的作用；2．神经营养素家族各因子的mRNA广泛地存在于各个发育时期神经细胞和胶质细胞中，提示胚胎发育时期，神经管或脊髓的神经细胞和胶质细胞具有自身合成神经营养素的功能；3．神经营养素家族的高亲和受体广泛分布在人胚胎发育的各个时期的神经细胞和胶质细胞，提示人胚胎脊髓发育时期神经营养素家族各因子还可通过自分泌和旁分泌方式发挥其各种生理功能；4．神经营养素家族可能具有诱导脊髓室管膜上皮神经干细胞分裂增殖的能力。
李亚梅, 梁爱斌, 汪俊帮, 方霞, 张炎[9]2016年在《胎鼠不同造血部位的形态学和组织化学研究》文中研究指明目的观察胚胎11.5 d(embryonic 11.5 d,E11.5)不同造血部位的解剖结构和造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)相关基因的转录水平、定位和形态,探讨不同造血部位HSC的起源、迁移、扩增和发育机制。方法运用尼氏(Nissl)染色、苏木精-伊红(htoxylin eosin,H-E)染色和免疫荧光技术(immunofluorescence technique,IF)观察E11.5小鼠胎盘(placenta,PL)、卵黄囊(yolk sac,YS)、主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区、胎肝(fetal liver,FL)和头部(head,Hd)的形态学和组织学变化,以及运用实时定量基因扩增荧光检测系统(real-time quantitative,PCR,detecting system,QPCR)检测HSC相关基因的转录水平。结果 Nissl和H-E染色结果显示E11.5小鼠AGM区背主动脉、PL血管迷路、YS血管、Hd脑血管和FL血窦富含血细胞;CD34、CD45、CD133、c-kit、Sca-1和Runx1在不同造血部位均有表达(P<0.05),其中PL表达水平显着高于其他造血部位(P<0.05);IF结果显示CD34在不同造血部位均有表达,YS血管和PL迷路血管呈强阳性;AGM区背主动脉和泌尿生殖嵴内皮细胞、Hd脑血管周围可见CD45呈弱阳性,而FL则显示CD45为阴性。c-kit和CD133在YS血管和PL迷路血管同为强阳性。结论 HSC产生关键时期,胚鼠PL和YS中HSC发育最旺盛。永久造血起源于小鼠胚内AGM区,而不同造血部位HSC的迁移与血管内皮细胞密切相关,HSC可能通过AGM区血管内皮迁移进入血液循环,首先到达PL的血管迷路,然后定植于FL,扩增或维持HSC。
王建升[10]2009年在《米非司酮对人早孕绒毛中妊娠相关因子的影响》文中提出目的:米非司酮是一种合成类固醇,其结构类似炔诺酮,是孕激素受体的拮抗剂。较早的研究认为,米非司酮使蜕膜发生变性、坏死,胚胎死亡而终止妊娠。随着研究的深入发现米非司酮可直接作用于绒毛滋养层细胞。近年研究表明,着床期的胚胎和子宫内膜除直接受到雌、孕激素的调节外,胚胎和子宫内膜自身还合成和分泌多种着床相关的蛋白因子,如血管内皮生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子、整合素、骨桥蛋白及基质金属蛋白酶等,它们以自分泌或旁分泌方式协调母胎的特殊生理状态。胚泡着床及妊娠成功的建立至少需要经过以下叁个过程:(1)胚泡和细胞外基质的粘附;(2)着床部位细胞外基质的降解;(3)穿透细胞外基质。其中第一和第叁个过程需要基质蛋白的细胞表面受体如整合素和骨桥蛋白等的参与,第二过程则需要能够降解细胞外基质的相应酶类,如基质金属蛋白酶等的参与。任何影响胚胎植入过程的因素,将导致植入的失败。米非司酮作为孕激素受体拮抗剂,不仅影响孕酮的生物学效应及多种蛋白因子,对妊娠及其产物的代谢和形态结构的影响也是多方面的,但是对于其调节机制尚不十分清楚。另外,目前国内外报道的米非司酮对早孕绒毛中骨桥蛋白及基质金属蛋白酶表达的研究结果也不完全一致。本研究采用免疫组织化学法和荧光定量PCR,研究米非司酮对早孕绒毛中孕激素受体、雌激素受体、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响,进一步探讨米非司酮抗早孕机制。材料和方法:将20名要求人工流产的正常妇女随机分为两组,其中10名妇女给予米非司酮150mg,服药后12～24h行负压吸宫术(研究组),另外10名妇女直接行负压吸宫术(对照组)。负压吸宫术后,即刻收集绒毛组织。采用荧光实时定量聚合酶链反应方法检测两组绒毛组织中雌激素受体和孕激素受体的基因表达;采用免疫组织化学法检测两组早孕绒毛组织的骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的蛋白表达。结果:HE染色结果显示,对照组可见正常早孕绒毛组织形态学;研究组为部分绒毛间质水肿,绒毛组织呈小灶性变性、坏死,炎症细胞浸润;少数细胞核固缩、破碎、细胞质不均匀及空泡变性。免疫组织化学结果显示,骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的阳性表达产物为棕黄色颗粒,主要位于细胞膜和(或)细胞质内,也可见于细胞核上。对照组早孕绒毛组织中合体滋养层细胞、细胞滋养层细胞都显现骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的表达。在绒毛组织中相应部位,研究组骨桥蛋白、MMP-2和MMP-9的表达强度明显减弱。荧光实时定量聚合酶链反应结果表明,研究组绒毛孕激素受体mRNA的表达显着高于对照组(P＜0.01);两组绒毛雌激素受体mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:1.正常早孕绒毛组织结构完整,米非司酮作用后结构发生改变,绒毛组织变性坏死。表明米非司酮可直接抑制绒毛滋养细胞增生,促进其变性、坏死,从而达到抗早孕的效果。2.服用米非司酮后,早孕绒毛中孕激素受体mRNA的表达量显着上调,而雌激素受体mRNA的表达量无显着变化。这一结果提示米非司酮通过与孕激素受体结合,竞争性拮抗孕激素活性,干扰了雌激素受体、孕激素受体之间的动态平衡,这可能是绒毛组织变性坏死的主要原因。3.研究组早孕绒毛骨桥蛋白的阳性表达显着低于对照组。这一结果提示米非司酮抑制了早孕绒毛中骨桥蛋白的合成,可能使滋养层细胞和蜕膜细胞的黏附、增殖和迁移能力下降,影响了胚泡着床和胎盘的形成,导致流产。4.研究组早孕绒毛MMP-9和MMP-2的阳性表达显着低于对照组。这一结果提示米非司酮抑制了早孕绒毛MMP-9和MMP-2的合成,使绒毛功能减退,难以维持妊娠,最终流产。
参考文献：
[1]. 小鼠胚胎器官发育的形态学和免疫组织化学研究[D]. 刘小蓉. 第一军医大学. 2004
[2]. 小鼠和人鼻咽发育形态学与免疫组织化学研究[D]. 郑文宏. 南方医科大学. 2013
[3]. 极北鲵消化道组织学及其内分泌细胞的研究[D]. 任春宇. 哈尔滨师范大学. 2012
[4]. 山羊皮肤发育形态学和免疫组织化学研究[D]. 林吉茂. 西北农林科技大学. 2008
[5]. 异育银鲫肠道组织形态学分析及肠道发育的营养调控[D]. 李茜. 南京农业大学. 2007
[6]. 表皮细胞去分化形成表皮干细胞的基础研究[D]. 孙晓艳. 中国人民解放军军医进修学院. 2008
[7]. 肝干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究[D]. 孙晓艳. 第一军医大学. 2004
[8]. 人胚胎脊髓发育过程中NTs家族及其受体的表达及变化[D]. 李力燕. 昆明医学院. 2007
[9]. 胎鼠不同造血部位的形态学和组织化学研究[J]. 李亚梅, 梁爱斌, 汪俊帮, 方霞, 张炎. 同济大学学报(医学版). 2016
[10]. 米非司酮对人早孕绒毛中妊娠相关因子的影响[D]. 王建升. 中国协和医科大学. 2009
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