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猪流行性腹泻病毒N蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

2020-12-02阅读(885)

猪流行性腹泻病毒N蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

论文摘要

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是一种急性接触性肠道传染病,以引起哺乳仔猪腹泻、呕吐、脱水为主要特征,一周龄内哺乳仔猪感染该病后死亡率可达100%,给世界养猪业带来巨大的经济损失。目前尚未有有效的疫苗和药物。PED病原为猪流行性腹泻病毒（Porcie Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）。PEDV的N基因编码的N蛋白是一种多功能的病毒蛋白,但缺乏与其相互作用蛋白的研究报道。为进一步了解N蛋白的生物学功能,探究N蛋白在PEDV复制过程中发挥的作用,本研究对N蛋白的相互作用蛋白质组学进行研究,获得与N蛋白相互作用的细胞蛋白,为下一步筛选抑制PEDV感染的药物靶标提供理论依据。为获得N蛋白相互作用的细胞蛋白,首先以PEDV PEDV LJX01/2014毒株的cDNA为模板,扩增PEDV N目的片段,将目的片段与pEGFP-C1真核表达载体进行连接,成功构建pEGFP-N重组质粒。将重组质粒转染293T细胞后,利用Pull-down实验特异性沉淀pEGFP-N蛋白及其相互作用的细胞蛋白并进行质谱分析,质谱结果表明,125种细胞蛋白可能与N蛋白相互作用。为了对质谱分析结果进行验证,根据不同的与对照相比获得的不同的变化比值筛选4种细胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1,用Western blot、免疫共沉淀和共定位研究进行鉴定。Western blot结果表明在293T和Vero E6细胞中,用N蛋白作为诱饵进行pull-down实验,结果表明N蛋白与细胞蛋白DHX9、NCL、KAP1和TCEA1均有相互作用;同时在293T和Vero E6细胞中分别用抗DHX9、NCL、KAP1和TCEA1抗体进行免疫共沉淀,结果表明4种细胞蛋白均能与N相互作用。用共聚焦显微镜观察这4种细胞蛋白与N蛋白的共定位现象,结果表明在感染PEDV的Vero E6和pEGFP-N转染的293T细胞种,均发现NCL与pEGFP-N存在共定位,而与其他3各蛋白没有共定位。本研究成功获得PEDV N蛋白的相互作用蛋白质组学,为进一步研究PEDV的致病机制奠定基础。

论文目录

  • 符号及缩略词
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  •   1.1 猪流行性腹泻研究概况
  •     1.1.1 猪流行性腹泻流行病学及发展历史
  •     1.1.2 猪流行性腹泻的临床症状
  •     1.1.3 猪流行性腹泻的病理变化
  •     1.1.4 猪流行性腹泻病毒的致病机理
  •   1.2 猪流行性腹泻病毒的分子生物学特征及结构蛋白功能
  •     1.2.1 猪流行性腹泻病毒病毒学分类地位
  •     1.2.2 猪流行性腹泻病毒非结构蛋白
  •     1.2.3 猪流行性腹泻病毒结构蛋白
  •       1.2.3.1 S蛋白的功能
  •       1.2.3.2 M蛋白的功能
  •       1.2.3.3 E蛋白的功能
  •       1.2.3.4 N蛋白的功能
  •   1.3 猪流行性腹泻的实验室诊断技术
  •   1.4 猪流行性腹泻的免疫防治措施
  •   1.5 互作蛋白的研究方法和应用
  •     1.5.1 免疫共沉淀
  •     1.5.2 Pull-down
  •     1.5.3 双分子荧光互补
  •     1.5.4 荧光共振能量转移
  •     1.5.5 噬菌体展示技术
  •     1.5.6 串联亲和纯化
  •   1.6 研究目的和意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 细胞、毒株及载体
  •     2.1.2 质粒
  •     2.1.3 主要试剂
  •     2.1.4 主要仪器及设备
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 主要试剂的配制
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 目的基因的获取
  •     2.3.2 pEGFP-N重组质粒的构建
  •     2.3.3 重组质粒pEGFP-N转染293T细胞
  •     2.3.4 Pull-down沉淀与N互作的细胞蛋白及质谱分析
  •     2.3.5 验证质谱分析结果
  • 3 实验结果
  •   3.1 重组质粒pEGFP-N的成功构建
  •     3.1.1 PEDV N基因的PCR扩增结果
  •     3.1.2 酶切鉴定重组质粒
  •     3.1.3 测序结果的分析
  •     3.1.4 重组的pEGFP-N质粒转染293T细胞后的鉴定
  •   3.2 Pull-down沉淀与pEGEP-N互作的细胞蛋白及质谱分析
  •     3.2.1 Western blot验证Pull-down产物中pEGEP-N的存在
  •     3.2.2 质谱分析结果
  •   3.3 验证质谱分析结果
  •     3.3.1 Western blot验证质谱分析结果
  •     3.3.2 免疫共沉淀验证质谱分析结果
  •     3.3.3 PEDV感染细胞中免疫共沉淀验证质谱分析结果
  •     3.3.4 共定位验证质谱分析结果
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表论文情况

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 谭敏

    导师: 肖一红

    关键词: 猪流行性腹泻病毒,核衣壳蛋白,蛋白质组学,相互作用

    来源: 山东农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 山东农业大学

    基金: 家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金资助(SKLVEB2015KFKT0015)

    分类号: S852.651

    总页数: 62

    文件大小: 3356K

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