朱良成[1]2004年在《猪卵母细胞超低温冷冻保存与体外受精的研究》文中研究表明猪卵母细胞由于含有大量的脂滴，冷冻较为困难。通过对猪卵母细胞冷冻保存的研究，探讨建立猪卵母细胞冷冻保存的最佳条件和技术路线，具有重要的理论意义和实用价值。本试验以猪卵母细胞为研究对象，利用屠宰母猪卵巢采集卵母细胞，进行猪卵母细胞超低温冷冻保存和体外受精的研究。在试验中，以台盼蓝染色、FDA染色、体外成熟和体外受精等作为鉴定卵母细胞冻后存活率和发育能力的指标，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞冷冻效果的影响；并用冷冻或未经冷冻的卵母细胞和精子进行体外受精，研究了不同培养系统对猪受精卵体外发育的影响。结果表明： 1．使用程序化冷冻法，叁种冷冻保护剂EG、DMSO、Gly对猪卵母细胞均有冷冻保护作用，极显着高于对照组(冻后存活率33.8％，25.8％，23.5％ vs 2.5％，P＜0.01)；在该叁种冷冻保护剂中，EG的效果最好，其冻后存活率显着高于另外两组(33.8％ vs 25.8％，23.5％，P＜0.05)。 2．采用自制的GMP管冷冻猪卵母细胞，证明所用GMP法是一种冷冻猪卵母细胞的有效方法，与普通麦管法相比，该法能显着提高猪MⅡ期卵母细胞冻后存活率(34.5％ vs 63.3％，P＜0.05)。 3．在玻璃化冷冻中，以EFS40为冷冻液，分别使用麦管和GMP管作冷冻载体，卵母细胞冻后存活率分别为45.0％和65.9％，两组间差异显着(P＜0.05)。 4．用程序化法和玻璃化法冷冻猪GV期卵母细胞，两组的冻后存活率分别为30.0％和59.7％，差异显着(P＜0.05)；冻后经体外培养，分别有2.8％和6.3％的卵母细胞发生卵丘扩散。 5．冷冻MⅡ期卵母细胞用鲜精受精后，仅有4.9％的受精卵发生卵裂，显着低于对照组的49.5％(P＜0.01)；发育至4细胞胚的比例为1.7％，无一能发育至8细胞期。 6．分别用冻精和鲜精与猪未经冷冻的MⅡ期卵母细胞进行体外受精，结果卵裂率分别为34.1％和49.5％(P＜0.05)；桑椹胚发育率分别为3.2％和13.3％(P＜0.05)。 7．TCM199(含15％FCS)、TCM199(含15％FCS)+颗粒细胞单层和NCSU-23叁种培养系统均能支持猪4细胞期之前胚胎的发育，其卵裂率分别为44.7％，41.9％和49.1％(P＞0.05)。TCM199(含15％FCS)不能支持猪胚胎越过4细胞阻滞的发育；TCM199(含15％FCS)+颗粒细胞单层和NCSU-23能使猪胚胎发育至桑椹胚，但两组的8细胞发育率(14.3％和24.2％)和桑椹胚发育率(3.3％和11.7％)均有明显差异(P＜0.05)。表明NCSU-23培养液适用于猪早期胚胎的体外发育。
杨喜[2]2006年在《猪卵母细胞OPS冷冻保存与体外受精的研究》文中研究指明本实验系统研究了猪卵母细胞的体外成熟、冷冻保存、体外受精及早期胚胎发育,着重研究了季节因素、FCS、pFF、胰岛素和17β-E2等对猪卵母细胞体外成熟的影响;研究了不同冷冻保护剂、不同处理方法、不同发育阶段卵母细胞的OPS冷冻效果;并探讨了不同的受精液、不同的Caffeine浓度对体外受精的影响,还对不同的蛋白质添加物、胰岛素、谷氨酰胺对早期胚胎发育的影响进行了研究。结果,(1)春秋季节的猪卵母细胞成熟率高于夏冬季节(P<0.05),卵泡期卵巢采集的猪卵母细胞成熟率和卵裂率均显着高于黄体期,添加10%FCS、10%pFF、20%FCS和10%FCS+10%pFF的卵裂率差异不显着(P>0.05),培养液中添加一定量的胰岛素和17β-E2有助于提高成熟率和卵裂率;(2)用5%PVP+梯度EG作为冷冻保护剂效果最好,GV期(12h)的卵母细胞的冷冻效果好于其它时期,CB处理可提高卵母细胞解冻后的卵裂率,离心不利于解冻的进一步发育;(3)添加5mM Caffeine的mBO的受精效果最好,培养24h后添加FCS可进一步提高胚胎发育能力,添加胰岛素和谷氨酰胺可提高胚胎发育能力。结论,(1)用含有10%FCS的NCSU-23成熟液体外培养猪卵母细胞,培养的前24h在培养液中加入激素,后24h不加激素的成熟效果最好;(2)体外成熟12h的猪卵母细胞(GV期)用5%PVP+EG做为玻璃化冷冻保护剂,5步OPS冷冻法的冷冻效果最好;(3)含5mM Caffeine的mBO受精液的受精效果最好。
戴建军[3]2006年在《猪胚胎体外生产与卵母细胞冷冻保存技术研究》文中认为建立猪卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外培养技术配套，进一步改善其操作程序、提高其效率，是实现猪胚胎体外生产的关键。目前，猪卵母细胞冷冻保存尚未取得突破性进展，冷冻方案尚待优化。系统研究猪胚胎体外生产与卵母细胞冷冻保存技术，有助于完善胚胎体外生产的技术配套，寻求猪种质资源保存的新途径和有效方法；有助于猪胚胎生物技术研究的实用化，丰富发育生物学文库。因此，具有重要的理论意义和实用价值。本研究以屠宰猪卵巢为材料，旨在通过对猪胚胎体外生产过程中关键技术的研究，建立简便、有效的技术体系，为建立猪胚胎体外生产技术平台奠定基础。 1．猪胚胎体外生产的关键技术研究 本试验以屠宰猪卵巢为研究对象，系统比较了采卵方法、卵巢运输温度、血清、激素、猪卵泡液、卵泡大小和卵巢类型等对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。结果表明，切割法所获卵母细胞数及每只卵巢平均采卵数均显着高于抽吸法，但卵母细胞体外成熟率(43.3％)明显低于抽吸法(75.6％，P＜0.05)；抽吸法可获得较高的卵母细胞可用率。屠宰猪卵巢运输温度为37℃和25℃时，可分别获得76.7％和80.2％的卵母细胞体外成熟率，52.2％和52.4％的卵裂率及17.7％和18.1％的桑椹胚发育率；当运输温度降为15℃时，成熟率、卵裂率和桑椹胚发育率均表现下降；若降到10℃时，成熟率、卵裂率和桑椹胚发育率仅为44.2％、22.7％和4.55％，显着低于37℃和25℃组(P＜0.05)。采用抽吸法采集中型卵泡(直径2～5mm)卵母细胞进行体外培养，结果发现，成熟培养液中无血清添加组，卵母细胞的卵丘扩散率和pbl排出率分别为47.4％和47.8％，均显着低于添加血清的两组(P＜0.05)。激素和猪卵泡液(pFF)的添加，对体外成熟和体外受精具有积极作用。在添加激素和pFF的成熟培养液中培养24h后，转入无激素、无pFF培养液中继续培养20h，卵丘扩散率可达85.3％，桑椹胚发育率为17.7％；连续培养对照组的桑椹胚发育率最高，为28.7％。对不同大小卵泡的卵母细胞研究表明，小卵泡卵母细胞发育能力显着低于大、中卵泡卵母细胞(P＜0.05)。卵母细胞无论来自黄体卵巢组，还是无黄体卵巢组，其体外发育能力无明显差别(P＞0.05)。在精子获能液mTBM液中，单独添加肝素的体外受精效果显着优于咖啡因组和混合添加肝素与咖啡因组。本实验表明，NCSU-23用于培养猪体外
肖宇[4]2008年在《玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞与胚胎DNA的影响》文中指出卵母细胞和胚胎冷冻保存是一种有效保护动物遗传资源的方法。利用简便快速的玻璃化冷冻保存技术,可以建立雌性动物基因库、保存珍稀生物资源,为其保护和保存提供了不受时间和地域限制的新途径。本研究以废弃猪卵巢内的卵母细胞为材料。通过玻璃化冷冻技术保存体外成熟培养、体外受精获得的成熟卵细胞和囊胚。使用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法和连接介导PCR(LMPCR)技术检测冷冻前后卵母细胞和囊胚的DNA损伤情况。旨在建立一套完善的猪卵母细胞冷冻保存体系和DNA损伤评估方法。为卵母细胞玻璃化冷冻保存和冷冻损伤等研究提供理论依据和实验材料。通过阶段性试验研究,得出结论如下:1.玻璃化冷冻保护剂对体外成熟猪卵母细胞DNA的影响以EDFS40为冷冻保护剂平衡冷冻前体外成熟猪卵母细胞。采用细胞形态观察和单细胞凝胶电泳(彗星电泳)方法检测玻璃化冷冻保护剂对细胞DNA的损伤情况。结果显示:保护剂处理组,细胞形态正常率和DNA异常率分别为63.36%、42.06%;同无保护剂处理对照组84.51%、12.28%的差异显着(P<0.05)。表明冷冻保护剂对猪卵母细胞DNA有一定影响;以彗星电泳检测和CASP软件分析保护剂处理对体外成熟猪卵母细胞的毒性作用。保护剂处理组TailDNA%与HeadDNA%的比值相对较高,表明DNA损伤较高。而在OTM值比较中,保护剂处理组斜率比对照组更大。说明冷冻保护剂对猪卵母细胞DNA有明显细胞毒性作用。2.玻璃化冷冻保存对猪卵母细胞DNA的影响采用EDFS40为保护剂微管法玻璃化冷冻保存体外成熟猪卵母细胞。设EDFS40处理组为对照,检测玻璃化冷冻保存过程对卵母细胞的细胞毒性及DNA损伤作用。冷冻组进行细胞形态检测及DNA异常率为63.36%和42.06%,而对照组为59.02%和25.76%。说明冷冻保存对细胞形态和DNA均有一定的影响。对处理组细胞进行彗星电泳检测分析,通过CASP软件分析所得数据得出冷冻组比保护剂处理组的OTM值较大,表明总体DNA较保护剂处理有明显损伤。运用连接介导PCR技术,对细胞基因组中定位特定p53基因进行断裂检测。结果显示:冷冻组的基因扩增有明显的条带,与预计的片段大小相符。而对照组无处理卵母细胞扩增却很少片段产生,初步确认为冷冻造成p53基因损伤断裂。3.玻璃化冷冻和保护剂对猪囊胚细胞DNA的毒性试验以冷冻效果较好的EDFS40保护剂玻璃化冻存猪囊胚细胞。采用形态评估和彗星电泳方法检测囊胚的形态变化及DNA的损伤情况。目的在于探讨玻璃化冷冻保护剂对囊胚的化学毒性作用和冷冻过程对其DNA的影响。结果显示:经保护剂处理和冷冻的囊胚形态正常率为56.46%和35.84%,有较多出现皱缩和细胞塌陷现象。冷冻组囊胚存活率为25%与对照组44.44%有较大差异(P<0.05)。彗星电泳检测结果:保护剂处理组囊胚DNA异常率为53.45%,冷冻组DNA异常率为79.14%,差异显着(P<0.05)。CASP软件分析得出:冷冻组、处理组和未处理组的OTM值有明显区别,曲线斜率越大,DNA损伤程度越大。实验表明保护剂处理和冷冻过程对囊胚DNA均有较大的影响。
胡建宏[5]2006年在《猪精液冷冻保存研究》文中研究表明人工授精是一项发挥优秀公畜遗传潜力的重要现代动物生物技术,而精液冷冻的目的正是为了提供人工授精所需精子产品的一种精子库。冷冻以后精子的受精能力是保障哺乳动物高妊娠率的重要因素,与冷冻-解冻后精子质量密切相关。在复杂的冷冻-解冻过程中,精子细胞的生化成分和内部结构可能发生改变,致使目前猪精液冷冻保存的效果不够理想。冷冻-解冻后,精子活力、质膜完整性、顶体完整率以及发育能力远远不如鲜精,利用冷冻精液人工授精后母猪较低的繁殖率及较少的窝产仔数等导致猪冷冻精液不能应用于商品化养猪生产。因此,精子冷冻的首要目标,包括稀释液的应用、糖类的选择以及精液的冷冻-解冻程序等,都需要阻止对精子产生危害的致命冰晶的形成,以提高精子活力、活率,降低冷冻对精子顶体和质膜的损伤。为了保护精子免遭低温打击,卵黄在家畜冷冻精液中普遍应用,且其保护作用归功于低密度脂蛋白。关于卵黄低密度脂蛋白对牛和鱼精子冷冻保护的研究已有报道,但是没有研究评估低密度脂蛋白对猪冷冻精液活力和其它质量指标的影响。葡萄糖和果糖等添加物对哺乳动物冷冻-解冻后精子活率的影响报道较多,海藻糖、蔗糖和乳糖等双糖对小鼠、牛、绵羊和山羊精子冷冻-解冻后精子运动能力和受精能力也有一些报道,但是迄今为止,关于海藻糖对冷冻-解冻后猪精液质量的影响没有系统的研究报道。此外,在冷冻精液的生产中,精子细胞面临许多潜在的危险。精液的稀释、孵育,精子染色,荧光、精液的离心以及冷冻等,可能损伤精子DNA,影响精子的存活能力和受精潜力。然而猪精液不同的处理程序和技术对精子DNA完整性的影响几乎没有研究报道。为了进一步提高冷冻-解冻后猪精液的质量,保护精子抵抗低温打击的能力,开发中草药冷冻保护剂,本研究以蛋黄低密度脂蛋白(LDL)、双糖(海藻糖、蔗糖、乳糖)、中草药添加剂等作为冷冻保护剂,以冷冻解冻后精子的活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率、精卵体外受精的卵裂率作为评定标准,利用碘化丙啶(PI)、罗丹明123、异硫氰酸荧光素连接的花生凝集素(FITC-PNA)、氯四环素(CTC)染色以及低渗膨胀测试(HOST)分别检测冷冻-解冻后精子的活率、染色线粒体活性、顶体完整率、获能处理前获能率、获能潜力以及质膜完整性,同时研究了猪细管冷冻精液的冷冻温度曲线、常温保存液预处理与冷冻基础液之间的配伍效应、冷冻-解冻对精子DNA的损伤以及精子体外受精卵裂率与精液参数(精子活率、活力、线粒体活性、质膜完整性、顶体完整率)之间的相关和回归关系。结果表明:
杨山亭[6]2009年在《猪胚胎玻璃化冷冻及胚胎生产技术的研究》文中研究表明目前,猪胚胎的冷冻保存尚未取得突破性进展,冷冻程序需进一步改善。建立和完善猪胚胎冷冻体系,一方面可以为猪种质资源保存及濒临动物的保护提供新的途径；另一方面为加快繁殖新技术的应用及丰富发育生物学文库,具有重要的理论意义和实用价值。本研究旨在通过体外受精、孤雌激活和超数排卵等技术,建立简便、有效的猪胚胎生产技术体系,同时为优化和完善猪胚胎冷冻体系奠定基础。猪卵母细胞孤雌激活试验表明,激活液中Ca2+浓度为0.10mM,电脉冲强度为1.2kV/cm时卵裂率(80.70%)和囊胚率(11.94%)效果最好；当Ca2+浓度达到0.50mM时,卵裂率(61.40%)和囊胚率(7.84%)都显着下降,退化率也显着增加,其他各组差异显着(P<0.05)。化学激活采用7.5μg/mLCB+10μg/mL CHX+2mM6-DMAP联合处理组卵母细胞激活后卵裂率(92.80%)和囊胚发育率(49.10%)最高,与其他各组差异显着(P<0.05)。以解冻后活力为0.3左右的冷冻精液进行体外受精试验,精子浓度以107／mL为宜；0.25ml细管冷冻精液IVF的卵裂率显着低于鲜精(P<0.05),但是囊胚率差异不显着(P>0.05)；在受精滴中(mTBM)中添加5mM的Caffeine,其卵裂率和囊胚率都有所提高,与对照组差异不显着(P>0.05)。在猪的超数排卵试验中,通过注射PG+PMSG+hCG母猪的同期发情效果最好,12头试验母猪同期发情率为91.7%,平均采集胚胎数为19.2枚,与其他组别差异不显着(P>0.05)。另外,激素剂量大小直接影响超排效果,在PMSG剂量为1000IU, hCG为500IU时超排效果最好,9头母猪同期发情率达到了100%,当PMSG剂量增加时,超排效果不随之提高。在合适的超排周期实施超排技术能达到达理想的效果,在发情周期的第14d、15d进行超排效果最好,其发情率和囊胚回收数均高于其他组别,差异不显着(P>0.05)。本试验系统的比较了不同的冷冻方法、冷冻预处理方案以及冷冻载体对卵母细胞和胚胎冷冻效果的影响。叁种不同的冷冻载体即开放式拉长细管法(Open-pulled straws, OPS)、细管法(Straw)和冷冻环法(Cryo-loop vitrfication, CLV),结果表明,CLV法冷冻卵母细胞和胚胎效果较好。冷冻-解冻胚胎培养24小时后,CLV法存活率达到86.70%,高于OPS法(83.80%)和Straw法(77.60%)；囊胚细胞数(56.3)也高于OPS法和Straw法,叁者之间差异不显着(P>0.05)。卵母冷冻解冻后的卵裂率CLV法(7.22%)与OPS法、Straw法(4.85%、0%)相比差异显着(P<0.05)；形态正常率为(84.35%)及FDA染色存活率为(80.00%)与其他各组差异显着(P<0.05)；经紫杉醇和cB预处理后的卵母细胞其形态正常率分别为(87.94%,84.89%)与对照组无显着差异(P>0.05)；经cB处理或者cB处理+离心极化等操作再进行玻璃化冷冻,其冷冻效果不明显,与对照组之间差异不显着(P>0.05),经去脂操作再进行玻璃化冷冻,其形态正常率和染色存活率都明显低于对照组差异显着(P<0.05)。对胚胎进行透明带薄化处理(0.50%链蛋白酶10 s),虽然对胚胎存活率没有显着影响,但能显着提高囊胚细胞数(60.1)与对照组(46.6)相比差异显着(P<0.05)。
王昭凯[7]2006年在《猪卵母细胞与胚胎冷冻保存研究》文中进行了进一步梳理许多研究论证了猪卵母细胞与胚胎对低温的敏感性与其高脂肪含量相关。猪卵母细胞与胚胎的低效率保存技术不仅会降低猪的遗传多样性，而且在一定程度上阻碍了繁殖技术的应用。 本试验卵母细胞采集于屠宰场废弃卵巢，胚胎采用手术法获得。冷冻后的卵母细胞通过乙酰荧光素染色和体外受精的方法来判断。 1) 研究渗透性与非渗透性的保护剂对卵母细胞的毒性作用，发现渗透性保护剂的毒性大小依次为EG＜GL＜DMSO。非渗透性保护的毒性大小差异不显着。 2) 采用一步法冷冻卵母细胞，比较保护剂为EFS30，EFS40，GFS40，EDFS40得冷冻效果，试验结果表明EFS40的效果显着好于其它组(p＜0.05)。 3) 实验以EFS40为冷冻保护剂，比较不同的玻璃化平衡时间对卵母细胞的影响，结果表明以30s的平衡时间为佳，与1min的平衡时间相比差异不显着(p＞0.05)。 4) 比较不同的冷冻承载工具对卵母细胞的冷冻效果的影响。实验结果表明以GLT法(55.8％)为最好，与OPS(29.5％)，GMP(13.4％)法比较差异极显着(p＜0.01)。 5) 将不同发育阶段的卵母细胞冷冻保存，结果表明MII期的卵母细胞的冷冻效果最好(53.6％)，与培养22h(39.6％)、GV期(22.0％)比较差异显着(p＜0.05)。 6) 比较离心+5ug／mL CB，只添加5ug／mL CB，去脂后的卵母细胞的冷冻效果影响。前两组结果为54.5％、55.6％差异不显着(p＞0.05)，但与后一组(33.3％)比较差异显着(p＜0.05)。 7) 比较冷冻解冻后的卵母细胞的发育能力，直接体外受精没有观察到卵裂，但采用ICSI方法发现有卵裂，并发育到4细胞阶段。与对照组相比差异显着。 8) 通过手术法获得胚胎，冷冻解冻后将45枚胚胎分别移植到两受体母猪，有一头母猪受孕，产下仔猪10头，存活8头。
武彩红[8]2006年在《猪卵母细胞的超低温冷冻保存及影响其冻后发育能力的机理研究》文中研究指明哺乳动物卵母细胞冷冻保存，在动物种质资源保护等方面已日益显示出强大的应用潜力。诚然，关于卵母细胞的冷冻保存，业已形成众多的技术方案，这些方案大多在小鼠、牛和人卵母细胞上应用并获得良好的冷冻效果。迄今为止，猪卵母细胞的冷冻保存尚未取得突破性进展；适用于猪卵母细胞冷冻保存的技术方案仍十分有限。因此，建立有效的猪卵母细胞冷冻保存技术平台依然是当前最为迫切的研究任务。此外，有关猪卵母细胞冷冻耐受性的机理研究，报道仍然偏少。本研究采用OPS(open pulled straw)法对猪未成熟(GⅤ期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞进行玻璃化冷冻保存，研究其冻后存活力和发育能力所受的影响；在优化冷冻程序的基础上，对猪卵母细胞的超微结构和细胞骨架结构进行系统研究，以期加深对影响猪卵母细胞冻后发育能力的机理的认识，为建立适合于猪卵母细胞冷冻保存的技术方案提供参考，为进一步完善猪卵母细胞的冷冻保存技术奠定基础。本研究共包括以下7个部分： 试验一、猪卵母细胞的采集与体外成熟研究 本试验以屠宰场采集的猪卵巢卵母细胞为研究对象，旨在优化猪卵母细胞回收方法及其体外成熟培养体系，为进一步研究提供适用的猪GⅤ期和MⅡ期卵母细胞。以抽吸法采集猪卵巢中直径为2～5mm及直径大于5mm卵泡卵母细胞，再用切割法采集直径小于2mm卵泡卵母细胞。结果表明，切割法所获卵母细胞数及每只卵巢平均采卵数均显着高于抽吸法(分别为1300枚对570枚和31.0枚对13.6枚；P＜0.05)；但切割法所获卵母细胞可用率仅为33.8％，显着低于抽吸法67.5％的可用率(P＜0.05)。用抽吸法采集直径为2～5mm的卵泡卵母细胞，分4组进行体外成熟培养，研究激素和猪卵泡液(pFF)对卵母细胞体外成熟的影响：Ⅰ组(对照组)，成熟培养液为TCM-199(含10％NCS)+pFF+PMSG+hCG+17β-E2+L-半胱氨酸，卵母细胞在其中培养44h；Ⅱ组(无激素组)，成熟培养液为TCM-199(10％NCS)+pFF+L-半胱氨酸，卵母细胞在其中培养44h；Ⅲ组(无卵泡液组)，成熟培养液为TCM-199(10％NCS)+PMSG+hCG+17p-E2+L-半胱氨酸。卵母细胞在其中培养44h；Ⅳ组(基础培养液组)，卵母细胞在成熟培养液(同Ⅰ组)中培养24h后，转入基础培养液TCM199(10％NCS)+L-半胱氨酸组中，继续培养20h。结果表明，卵母细胞在添加激素和pFF的成熟培养液中培养24h后，转入无激素、无pFF的基础培养液中继续培养20h，体外成熟率达78.8％，明显高于另外3组
桑国俊[9]2008年在《牛卵母细胞及体外胚培养技术研究》文中研究说明牛胚胎体外生产技术包括卵母细胞体外成熟、体外受精、体外培养及冷冻保存等环节。本试验对牛卵母细胞及体外胚培养技术进行了研究,比较系统地掌握了牛卵母细胞的操作技术,为该技术的深入研究和应用铺垫了良好基础。1、卵母细胞体外成熟技术(1)COCs级别对卵母细胞成熟的影响。选择A、B、C和D级COCs进行成熟培养。A级成熟率为63.81%,B级为47.81%,C级为2.01%,D级为0.00%,各级成熟率之间差异显着(p<0.01),A、B级远高于C、D级。C级仅有个别发育成熟,D级未见成熟。因此,A、B级COCs是卵母细胞体外培养的主要资源,宜选择A、B级COCs进行成熟培养。(2)卵泡直径对卵母细胞成熟的影响。将卵泡分为3级:大卵泡(φ>8mm)、中卵泡(2mm≤φ≤8mm)和小卵泡(φ<2mm)。COCs成熟率分别为大卵泡组17.07%、中卵泡组61.82%、小卵泡组19.06%,中卵泡组显着高于大卵泡组和小卵泡组(p<0.01),大卵泡组和小卵泡组差异不显着(p>0.05)。卵母细胞的成熟率与采集COCs时的卵泡直径关系密切,在卵母细胞体外培养过程中,宜选择卵巢发育正常的卵泡采集,不宜选择发育过大或过小的边际卵泡。2、牛卵母细胞体外受精技术(1)直接离心法对获能效果和卵母细胞受精率的影响。①二次离心沉淀液:对第一次离心的沉淀定容后继续离心后获得的沉淀进行活力、获能效果和受精率测定。洗涤精子最终活力为0.44;获能效果以10min时最高,为0.41,15min时为0.32,超活化以15min时最好;受精率为40.19%。②二次离心上清液:对第一次离心的上清液定容后继续离心后获得的沉淀进行测定。洗涤精子最终活力为0.56;获能效果以10min时最高,为0.59,15min时较低,为0.585,超活化也以15min时最好;受精率为43.21%。二次离心上清液的各项指标显着高于沉淀液(p<0.01)。从试验结果看,宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法,避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路,而直接对上清液进行离心处理,获得了理想的精子洗涤和获能效果。(2)不同温度对精子获能和卵母细胞受精的影响。将精子分别在20～24℃室温和38.5℃恒温(CO2培养箱)上浮60min、获能10～20min。①室温上浮法:超净工作台上浮60min,精子活力以45min时最高,达到0.68;对上浮45min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.40%。②恒温上浮法:CO2培养箱上浮60min,精子活力30min时最高,达到0.697;对上浮30min的精子获能15min后进行体外受精,平均受精率41.51%。精子获能后的超活化现象与室温法一致。二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显着(p>0.05),恒温上浮法的效果略高于室温组。从可控角度考虑,还以恒温上浮法为宜。(3)精子浓度与受精的关系。使用不同浓度(低1.0×106、中1.5×106和高3.0×106个/ml)精子与卵子共同孵育。中浓度组平均受精率为47.34%,显着高于低浓度组的42.38%(p<0.05)和高浓度组的33.96%(p<0.01);低浓度组的平均受精率显着高于高浓度组平均受精率(p<0.01)。本试验表明精子适宜浓度宜控制在(1.0～1.5)×106个/ml。3、牛体外受精胚胎培养技术(1)卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响。卵丘细胞组、卵丘细胞+bFF组和对照组的桑椹胚率分别为29.07%、34.99%和26.67%;囊胚率分别为8.51%、10.63%和7.24%。卵丘细胞+bFF组的桑囊率显着高于卵丘细胞组和对照组(p<0.01)。本试验通过添加卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养物质,较好地克服了2C发育阻滞。(2)培养液体积对胚胎发育的影响。分别用50μl和500μl培养液培养胚胎。50μl液滴的桑椹胚率为33.14%,囊胚率为9.07%,500μl液滴依次为36.23%和10.23%。大体积培养比微滴培养有优势,桑椹胚和囊胚率均较高(p<0.01)。本项试验中500μl的效果好于50μl。4、卵母细胞冷冻保存技术及解冻培养(1)程序化一步法冷冻时10%GL和10%EG对COCs冷冻效果的影响。COCs在液氮保存1周后解冻成熟培养。EG组成熟率为34.46%,桑椹胚率为11.18%,囊胚率为4.18%;GL依次为33.44%、10.56%和3.86%。EG组的成熟率比GL组高3.05%(p>0.05),桑椹胚率高5.87%(p>0.05),囊胚率高8.29%(p>0.05)。冷冻保护剂GL和EG均可用于COCs的冷冻保存,但EG的效果比较好。(2)玻璃化冷冻时麦管和OPS管对COCs冷冻效果的影响。以麦管和OPS管作为冷冻载体,二步法玻璃化冷冻COCs。对冷冻1周后的COCs解冻培养,麦管法成熟率为29.84%,桑椹胚率为9.34%,囊胚率为3.47%;OPS法依次为31.89%、9.66%和3.80%。OPS法的成熟率比麦管法高6.87%(p>0.05),桑椹胚率高3.43%(p>0.05),囊胚率高9.51%(p>0.05)。OPS管玻璃化冷冻的效果优于麦管法,但无统计差异,而麦管法宜于操作和储存,宜在实际操作中选用麦管法。(3)COCs冷冻方法的比较。COCs的4种处理方法在成熟培养、桑椹胚发育和囊胚发育方面的趋势基本一致,整体效果的优势序列为EG法>GL法>OPS管法>麦管法。玻璃化冷冻效果低于程序化一步法冷冻法。由于玻璃化冷冻的解冻处理程序复杂,建议实际应用时选用麦管程序化一步法冷冻法。5、小结通过牛卵母细胞体外培养技术试验的实施,比较系统地掌握了牛卵母细胞成熟培养、精子获能、体外受精和体外培养的技术环节和操作程序,利用共培养系统突破了2C发育阻滞,在精子获能方面建立了新的洗涤和获能方法。本研究的技术指标在同类研究中属于较高水平,在将后研究中将进一步探索和提高。
张德福, 朱良成, 刘东, 芮荣, 汤琳琳[10]2006年在《猪卵母细胞冷冻保存研究》文中进行了进一步梳理目的本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型,从而有效地保存猪卵母细胞;方法利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞,以台盼蓝染色、二乙酸荧光素(FDA)染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率,以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力,研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。结果(1)程序化法冷冻保存中,9%乙二醇(EG),10%二甲基亚砜(DMSO),10%甘油(Gly)均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用,极显着高于对照组(FDA染色成活率33.8%,25.8%,23.5%vs2.5%,P<0.01),且以9%EG的效果最好,显着高于另外两组(33.8%vs25.8%,23.5%,P<0.05)。(2)玻璃微细管(GMP)法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法,以普通的麦管(Straw)法进行的程序化冷冻为对照组,GMP管法显着提高猪卵母细胞的冷冻成活率(分别为63.3%和34.5%,P<0.05)。(3)在玻璃化冷冻方法中,不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液,Straw和GMP管作冷冻液载体,卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%,二者差异显着(P<0.05)。(4)用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效,但二者差异显着(成活率分别为30.0%和59.7%,P<0.05)。冷冻后继续培养,分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。(5)冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大,用新鲜精液使其受精,仅有4.9%的受精卵分裂,极显着低于对照组的49.5%(P<0.01);发育至4-细胞期的比例为1.7%,但未能发育至8-细胞期以上胚胎。结论选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞,为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。
参考文献：
[1]. 猪卵母细胞超低温冷冻保存与体外受精的研究[D]. 朱良成. 南京农业大学. 2004
[2]. 猪卵母细胞OPS冷冻保存与体外受精的研究[D]. 杨喜. 内蒙古农业大学. 2006
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[4]. 玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞与胚胎DNA的影响[D]. 肖宇. 上海交通大学. 2008
[5]. 猪精液冷冻保存研究[D]. 胡建宏. 西北农林科技大学. 2006
[6]. 猪胚胎玻璃化冷冻及胚胎生产技术的研究[D]. 杨山亭. 南京农业大学. 2009
[7]. 猪卵母细胞与胚胎冷冻保存研究[D]. 王昭凯. 南京农业大学. 2006
[8]. 猪卵母细胞的超低温冷冻保存及影响其冻后发育能力的机理研究[D]. 武彩红. 南京农业大学. 2006
[9]. 牛卵母细胞及体外胚培养技术研究[D]. 桑国俊. 甘肃农业大学. 2008
[10]. 猪卵母细胞冷冻保存研究[J]. 张德福, 朱良成, 刘东, 芮荣, 汤琳琳. 中国农业科学. 2006
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