论文摘要
【背景】神经干细胞具有稳定的自我更新能力,可以通过对称分裂或者非对称分裂方式增殖分化产生各种类型的神经细胞,例如星形胶质细胞,少突胶质细胞,神经元等。在胚胎时期,神经上皮细胞作为最原始的神经干细胞可以通过对称性分裂的方式进行自我数目的扩增。随着大脑皮层发育的不断完善,神经上皮细胞逐渐转化成为放射状胶质细胞,放射状胶质细胞同样具有神经干细胞的特性。在这一阶段,放射状胶质细胞主要通过非对称分裂完成自我更新的过程,产生一个新生的放射状胶质细胞和一个神经元细胞,新生的神经元可以沿着放射状胶质细胞的纤维往表层进行迁移。出生后的哺乳动物脑室及脑室下区、海马齿状回颗粒下层等区域中同样存在GFAP+SOX2+的神经干细胞。此外,由胚胎期放射状胶质细胞转化而来的室管膜细胞也可以表达神经干细胞特有的标志物CD133、Nestin等,因此室管膜细胞也被认为是成体神经干细胞的一种。当脑缺血等损伤应激发生时,室管膜细胞同样可以被激活进入增殖状态,增殖分化产生DCX+的神经前体细胞参与损伤修复。哺乳动物的Tweety家族基因主要包括Ttyh1、Ttyh2和Ttyh3三个家族成员。研究发现,Tweety家族基因参与多种生理功能的调节过程,例如细胞分裂、细胞粘附、钙离子调节等。已经有研究证实Tweety家族基因与多种疾病的发生发展存在相关关系,其中Ttyh1被发现高表达于癫痫模型的海马齿状回细胞中,此外有研究证实Ttyh1参与调控神经胶质瘤细胞的生长和侵袭的过程;Ttyh2在结肠癌和肾癌中呈现高表达的状态,可能参与调节肿瘤的侵袭转移过程;Ttyh3主要参与脑、脊髓以及肌肉等易兴奋组织的钙动态调节过程。通过原位杂交试验和免疫荧光染色定位发现,Ttyh1特异性表达于中枢神经系统,尤其是神经干细胞分布的脑室及脑室下区,在其他组织中呈现低表达的状态。因此Ttyh1很可能参与了神经干细胞增殖分化等相关表型的调控过程。钙离子作为细胞内信号转导的重要的第二信使,在哺乳动物神经系统的发育过程中起到了重要作用。研究发现,在钙离子相关信号通路中内质网钙库操纵的钙离子内流参与调控神经干细胞的增殖分化等一系列的过程。内质网钙库操纵的钙离子内流是通过内质网的钙离子感受器STIM1和胞膜的选择性钙离子通道Orai1相互作用进而调节细胞钙离子水平的变化。当内质网钙离子浓度较高时,钙离子可以结合到STIM1蛋白的手性结构域中,使得STIM1蛋白进入失活的状态;当内质网中钙离子浓度降低时,会导致钙离子从STIM1蛋白的手性结构域中解离出来,并导致STIM1从单体形成三聚体,并激活细胞膜上的Orai1等钙离子通道促进钙离子的内流从而引起细胞内钙离子水平的整体变化。文献报道称,在小鼠的神经前体细胞中通过干预内质网钙库操纵的钙离子内流导致神经前体细胞增殖能力的降低。另外有研究发现,在人的神经前体细胞中敲低内质网上的钙离子感受器STIM1的表达,通过影响细胞的钙离子内流可以有效抑制神经前体细胞的增殖,并且同时促进神经前体干细胞的分化。Ttyh1氯离子通道蛋白的C端含有丰富的天冬氨酸D,因为其含有丰富的负电荷,因此可以与钙离子结合。我们的前期实验结果也证实Ttyh1特异性定位在细胞内质网上,提示Ttyh1可能是内质网钙库的调节分子之一,参与调节内质网钙离子浓度并进一步影响细胞钙离子水平变化。同时有研究发现,Ttyh1对干细胞的特性的影响并不是通过氯离子通道起作用,其中起到关键作用的蛋白位点正是423-433号富含天冬氨酸残基可以结合钙离子的位点。因此,我们推测Ttyh1可能通过调节细胞内钙离子水平的变化参与调控神经干细胞特性。【目的】利用Ttyh1的特异性抗体对其组织分布以及细胞分布情况进行准确定位;在体外干涉Ttyh1的表达探究其在神经干细胞增殖分化等过程中发挥的主要功能;在动物体内研究Ttyh1敲除以后小鼠神经干细胞龛的变化;最后通过转录组测序技术对Ttyh1基因的作用机制进行初步探究。【方法】1.利用课题组前期构建的Ttyh1抗体进行免疫荧光染色,以及和其他干细胞标志物分子进行共定位染色,明确其分布情况。2.构建Ttyh1的si-RNA,在体外神经干细胞中敲低Ttyh1的表达,观察神经干细胞表型变化。3.通过CRISPR-Cas9技术构建Ttyh1基因敲除小鼠,并观察其神经干细胞龛中神经干细胞增殖分化情况的变化。4.对E14.5天Ttyh1敲除小鼠来源的神经干细胞进行转录组测序,初步探究Ttyh1基因的可能作用机制。【结果】1.免疫荧光染色结果显示,无论是在胚胎期小鼠还是在出生后的小鼠脑组织中,Ttyh1均高表达于干细胞所在的脑室及脑室下区。共定位染色结果发现,成年小鼠脑组织中,Ttyh1主要表达分布在CD133+的静息态神经干细胞中,而不表达在Ki67+的增殖态神经干细胞中。2.在体外培养的神经干细胞中敲低Ttyh1以后,神经干细胞的克隆形成能力一过性的增强,但最终会导致神经干细胞的干性降低。同时研究结果发现Ttyh1敲低会导致神经干细胞朝O4+少突胶质细胞以及MAP2+的神经元前体细胞方向分化增多。3.通过对Ttyh1敲除小鼠进行长程BrdU标记发现,Ttyh1敲除会导致在胚胎期脑室及脑室下区的BrdU+的神经干细胞迁移能力的降低,滞留在脑室及脑室下区的BrdU+神经干细胞随之增多。此外,对Ttyh1敲除小鼠神经干细胞龛中不同亚型神经干细胞进行免疫荧光染色分析发现Ttyh1敲除会引起出生后小鼠的大脑神经发生作用一过性增强,但最终导致小鼠神经干细胞龛中GFAP+SOX2+神经干细胞以及S100β+的室管膜细胞的提前耗竭。4.通过对E14.5天的Ttyh1敲除小鼠来源的神经干细胞进行转录组测序分析发现,Ttyh1敲除导致STIM1,Orai1等内质网钙库操纵的钙离子内流相关分子的变化,提示Ttyh1可能通过调控神经干细胞的细胞内钙离子水平的变化,从而进一步影响神经干细胞的表型。5.通过GSI阻断实验发现,阻断Notch信号通路以后神经干细胞的Ttyh1的表达量明显下调;NICD过表达实验结果证实Notch信号通路激活可以促进Ttyh1的表达,此外,报告基因实验结果也证实Notch信号通路对Ttyh1具有正向调控作用。【结论】1.无论是在胚胎期小鼠还是出生后小鼠,Ttyh1主要分布在脑室及脑室下区的神经干细胞中。在出生后小鼠脑组织中,Ttyh1主要表达分布在CD133+的静息态神经干细胞中,而不表达在Ki67+的增殖态神经干细胞中。2.Ttyh1参与调控神经干细胞的增殖分化过程,Ttyh1敲除以后会导致静息态或者缓慢增殖态的的神经干细胞激活转化成为有丝分裂活跃的增殖态的神经干细胞,导致神经干细胞干性出现一过性的增强;在小鼠体内导致小鼠脑神经发生作用一过性增强,但最终会导致神经干细胞龛中神经干细胞的提前耗竭。3.Ttyh1作为内质网钙库的一种调节分子,可以通过参与调节内质网钙库操纵的钙离子内流调控神经干细胞的细胞内钙离子水平的变化,从而进一步影响神经干细胞的表型。4.神经干细胞中Ttyh1的表达受Notch信号通路的正向调控,阻断Notch信号通路以后,神经干细胞中Ttyh1的表达会出现明显下调。Notch信号可以通过调节Ttyh1的表达参与神经干细胞的调控。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 吴海宁
导师: 韩骅,郑敏化
关键词: 神经干细胞,干性,钙离子信号通路
来源: 中国人民解放军空军军医大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 中国人民解放军空军军医大学
基金: 国家自然科学基金(31000485)
分类号: R329.2
DOI: 10.27002/d.cnki.gsjyu.2019.000054
总页数: 119
文件大小: 3293K
下载量: 40