何光余[1]2003年在《转基因鸡制备技术的研究》文中认为本研究以人生长激素基因和人激肽释放酶基因作为目的基因，利用胚盘显微注射法和精子介导外源基因转移法制备转基因鸡，其结果如下： 1．胚盘显微注射法关键技术之一是蛋壳恢复共封闭性，为此进行的种蛋部分去壳后8种不同的封口方法对孵化率的影响实验结果表明：①蛋壳膜+封口胶(封口后连续3天注射抗生素)、②蛋壳膜+封口胶、③封口胶+药棉、④蛋壳膜+石蜡、⑤蛋壳膜+蛋壳粉+石蜡⑥蛋壳膜、⑦蛋壳膜+蛋壳粉+蛋清、⑧蛋壳膜+蛋壳粉，8个试验组鸡胚到5胚龄时存活率分别为42.6％、53.1％、42.2％、41.5％、43.2％、33.3％、37.5％、37.5％，组间差异不显着((?)＞0.05)；11胚龄时，⑥、⑦两组均都已夭亡，①、②、③、④、⑤、⑧组存活率分别为31.9％、22.4％、26.7％、26.8％、20.5％、12.5％，六组间差异仍不显着((?)＞0.05)；前5种封口方法中鸡胚的发育在19胚龄前差异不显着((?)＞0.05)，存活率分别为：9.6％、5.1％、6.7％、7.3％、6.8％，此时后3种封口方法，胚胎均已死亡；其中前4组的孵化率分别为：9.6％、5.1％、4.4％、2.4％。比较结果，前5种封口方法优于后3组，其中蛋壳膜+封口胶方法较其它封口方法好。 2．在以人生长激素基因为目的基因进行胚盘转染试验中，一次注射受精卵81枚，孵出小鸡4只，孵化率为4.9％。对孵化后死亡及孵出活鸡进行斑点杂交检测，结果表明：基因整合率约为12.5％(6/48)。在死亡的鸡胚中，1只出扬州大学硕士学位论文现腺胃肿大异常。 3.以人激肤释放酶为目的基因进行胚盘注射239枚受精卵，采用蛋壳膜+封口胶封口，孵出小鸡14只，孵化率为5.9%。对孵化后4一7胚龄的整胚及7胚龄后死亡鸡胚的肝、脑、肾、性腺、脾、心、肺、皮肤和活鸡的血液皮肤进行检测，斑点杂交阳性率为22.2%，对可疑阳性和出雏鸡的组织器官PCR检测，阳性率为3.7%。其中1只15一16胚龄的死胚腺胃有出血点，l只16胚龄的死胚肝脏异常肿大。出壳雏鸡1只脚瘫，不能直立。7只在发育到1.5左右千克食欲减退废绝，消瘦而死，解剖发现胆囊肿大，肝肠部分发绿坏死。这可能与早期试验饲养状况不好有关，而且对试验鸡未进行剖检分析不能排除疾病的可能性。但也从另一方面说明胚盘显微注射法制备转基因鸡，外源基因的随机插入可能导致内源性基因的破坏或失活，也可能激活正常情况下处于关闭状态的基因或在插入位点发生染色体的畸变而引起个体异常。 实验结果表明hGH、Klkl两种基因均可在鸡中获得整合表达，也说明在一定的范围内，不同质粒，不同片段大小的外源基因通过脂质体包埋，利用胚盘显微注射法均可获得转基因鸡，胚盘显微注射法是转基因鸡制备的一条有效途径。 4.在用精子介导法进行鸡的转基因研究中，对鸡精子的采集、稀释、体外培养和基因转染的条件进行了摸索，转染后的精子活力与对照组差别不显着，PCR检测结果证明37℃孵育1小时，精子活力良好，并携带有外源基因。以人激肤释放酶为外源基因通过精子介导法获得的24只鸡，斑点杂交阳性率为79.2%(19/24)，PCR检测获得29.2%(7124)的阳性率，提示精子与DNA一脂质体复合物共孵育，也可用于转基因鸡的研究。
谢德明, 陈良, 龙小曾, 成进波, 刘灵康[2]2018年在《转基因鸡制备技术研究进展》文中研究说明本文综述了转基因鸡的研究及应用,并介绍了3种常用的制备方法,包括外源基因受精卵注射、逆转录病毒介导转基因、利用慢病毒载体实现转基因的介入和导向,以期为转基因技术的应用提供参考。
徐世永[3]2007年在《慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术研究》文中研究表明转基因鸡模型系统在生命科学领域有着广泛的应用，如作为生物反应器在鸡蛋中表达功能蛋白、禽类育种及用于胚胎发育生物学基础研究等。本研究的主要目的是探索并建立基于HIV-1慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术体系，初步生产表达人类药用蛋白——组织纤溶酶原激活剂(tPA)转基因鸡，并建立输卵管特异表达启动子筛选体系，为今后输卵管生物反应器的开发应用及转基因育种作预备。为研究方便，首先以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因构建了基于HIV-1的复制缺陷型慢病毒载体，并生产病毒(病毒滴度10~6个转染单位/ml)。病毒感染不同来源、不同分化特征的细胞，在所有类型细胞中均可检测到EGFP较高水平的表达，其中在Hela、293FT细胞中的转染效率约为10~8转染单位/ml，C127中为5×10~7转染单位/ml，，鸡胚胎成纤维(CEF)约10~6转染单位/ml，病毒在鸡原生殖细胞中转染效率最低为10~2转染单位/ml。病毒的感染可引起细胞表型的不利改变。用该病毒注射鸡囊胚获得了绿色荧光信号可直接活体观察的转基因鸡。试验中分两次共注射204只鸡胚，孵化出30只，孵化率15％，其中16只经点杂交分析及PCR分析有外源基因的整合，转基因效率53％，在其中两个雄性转基因个体的后代中发现了外源基因的整合，表明发生了生殖嵌合现象。在活体中有4只可从体表通过激发荧光而直接观察到绿色荧光信号。荧光信号在不同个体、不同的体表部位表现出不同的表达特征，多呈点状分布，主要集中在喙及鸡冠两侧、鼻、耳、爪等皮肤裸露处，前胸、面部等羽毛稀疏处。进一步解剖分析表明，外源基因在不同组织中的表达强度、表达特性是不一样的，尤以大、小肠中的表达最为强烈为弥散型分布，而在肝脏中发现非均质点状分布。在成年个体皮肤、肝脏、胰脏、小肠及血管的组织切片中也发现了强烈的绿色荧光信号，最为重要的是我们在睾丸中也发现了强烈的荧光信号，绿色荧光集中于睾丸曲细精管管周。同时试验中我们还初步探索了以LM-PCR方法分析外源基因整合位点的可行性。以上结果表明基于HIV-1的慢病毒载体可以较低的费及较低的设备要求用于高效制备转基因家禽。在前者研究基础上，进一步构建了表达人类组织型纤溶酶原激活剂的慢病毒载体，在载体中tPA和绿色荧光蛋白以Asp-Pro蚁酸敏感位点结成融合蛋白。用病毒共注射了34只鸡胚，孵化出7只，孵化率20．6％，其中两只经PCR及点杂交方法检测有外源基因的整合，两只个体均为雄性。由于蛋白融合后可能会影响GFP蛋白的荧光表达，在两只转基因个体的体表均没有发现直接可视的绿色荧光信号，但经免疫荧光分析后在其中一只个体的胰腺中发现了较弱的目的蛋白的表达。用F板检验法，在转基因鸡胰脏及肝脏中检测到tPA重组蛋白有较高的生物酶活性的。家禽作为生物反应器表达药用蛋白最为人关注同时也最能表现其生产应用价值的地方是实现在输卵管中的特异/高效表达。而实现这一目标的关键是筛选合适的启动子。为此我们克隆了SV40大T抗原(TAG)基因全序列，并构建了表达TAG的neo抗性慢病毒载体，生产病毒后，侵染新开产蛋鸡输卵管上皮原代培养细胞，筛选建立了永生化输卵管上皮细胞，经永生化后细胞的增殖能力有所改善。我们以此为基础评价不同启动子的表达效果。共克隆并构建了两种含有不同长度卵清蛋白(OV)启动子的Blasticidin抗性慢病毒载体，启动子分别为OV1345及OV2964，两种启动子除后者多了第一内含子外其余序列均相同。两种病毒感染永生化输卵管上皮细胞后，经筛选稳定整合细胞后，提取DNA及mRNA分别进行定量分析，结果表明从DNA整合效果上看，含OV1345启动子的病毒是含OV2964启动子病毒整合效率的46倍，但mRNA表达量前者却只有后者的14倍，以mRNA表达量与DNA整合拷贝数的比值作为拟单拷贝基因转录数来反映不同启动子的转录效率，可以发现OV2964启动子的转录效率可达OV1345启动子的3倍，说明第一内含子对OV启动子的转录起正向调节作用。虽然所有两个病毒感染的细胞中均没有可发现的绿色荧光信号，但从定量结果上看，永生化输卵管上皮细胞具有部分不同于成纤维细胞的正常输卵管上皮细胞的生理特性。
浮帅古[4]2014年在《卵黄抗体重链恒定区介导外源蛋白在蛋黄中表达的研究》文中研究表明应用转基因鸡作为生物反应器进行功能蛋白的生产具有广阔的应用前景,功能蛋白在蛋中靶向表达是理想的生产方式。本论文通过构建表达载体生产慢病毒,通过显微注射导入鸡胚制备转基因鸡,载体在CMV启动子控制下,外源蛋白与鸡卵黄抗体IgY抗体重链恒定区CH1-4融合,使表达的外源蛋白通过IgY抗体受体介导转位到蛋黄,探索转基因鸡作为生物反应器生产功能蛋白的可行性,为应用转基因鸡生产医用蛋白提供新途径和思路。利用分子生物学手段克隆得到鸡IgY重链恒定区基因,以EGFP为报告基因,选取pLOV.CMV.EGFP载体进行改造,构建真核表达载体,与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,生产慢病毒,利用相对荧光定量PCR分析,获得的慢病毒滴度为7.06×108TU/mL。使用慢病毒感染鸡胚成纤维细胞系DF1,感染效率较高。分别在鸡胚13-14期外周血管和X期胚盘下腔注射1.5μL含有CMV启动子和EGFP报告基因的HIV-1型慢病毒溶液,血管注射组孵化率为84.2%,胚盘组孵化率0。通过荧光显微镜、RT-PCR、Western Blot等方法在血管注射组雏鸡的心脏、肝脏、脑、肾脏、肌胃、胸肌、性腺等组织器官中均检测到了外源蛋白的表达；在性成熟的鸡体内只有心脏和胸肌能够检测外源蛋白表达。饲养至性成熟时,在血管注射组刚开产母鸡鸡蛋蛋黄中通过Western Blot短时间检测到外源蛋白的表达,但未能实现在蛋黄中持续表达。本实验成功构建了含有IgY重链恒定区基因的真核表达载体并生产出慢病毒,分别使用外周血管和胚盘下腔显微操作法注射鸡胚制备转基因鸡,在CMV启动子作用下,雏鸡体内组织器官中广泛检测到了外源蛋白的表达,但是性成熟后外源蛋白的表达只能在心脏和胸肌中检测到,在产蛋母鸡的蛋黄中短时间检测到外源蛋白的表达。综上,我们利用慢病毒载体制备转基因鸡生物反应器的研究工作已经获得了初步进展,仍需要继续研究以解决转基因性腺整合与持续稳定表达等问题。
于敏莉[5]2012年在《维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究》文中研究指明家禽的胚胎发育有独特的规律,通过对家禽原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)的体外研究,可以更深入地了解其胚胎发育过程及影响因素,并可对其基因进行遗传操作,制作各种研究模型,从而为生殖生物学和发育生物学等研究提供了一个优良的动物模型。为了更深层次揭示禽类生殖细胞增殖和分化的细胞内部和外源性调控机理、性腺发育和配子形成的分子机理,本实验以海兰鸡鸡胚为材料,分离了不同时期的PGC,进行体外培养并优化培养模型,研究了维甲酸(RA)对PGC粘附和增殖的作用及其胞内信号传导机制,同时还研究了RA对胚胎期卵巢生殖细胞减数分裂启动过程中的调控作用,探索基于LV-siRNA的慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立Raldh2基因敲除的转基因鸡模型,为进一步研究胚胎早期发育的机理、转基因家禽的制备奠定了基础。1.鸡胚PGC的分离、培养及鉴定在体视显微镜下用玻璃针分离19期3.5d鸡胚生殖嵴部位或28期5.5d鸡胚性腺,胰蛋白酶+EDTA消化分散组织,用KO-DMEM添加7.5%胎牛血清和10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)、10ng/ml干细胞生长因子(SCF)、0.1mMMEM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺(Glu)、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液,通过PGC和体细胞体外共培养的方式建立原代培养模型。然后传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上进行继代培养。同时我们从13-15期鸡胚血液中分离提取PGC,在饲养层上进行原代和传代培养。传至3-5代后,用碱性磷酸酶(AKP)、过碘酸雪夫氏(PAS)化学反应及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫细胞化学鉴定PGC,用PCNA和BrdU掺入法检测细胞的增殖活性。并收集PGC集落,采用RT-PCR方法检测干细胞多能性相关基因(Pou5fl,Sox2和Nanog)的表达。上述结果表明我们建立的PGC-体细胞共培养模型较好的维持了PGC的生物特性及未分化状态,且具有较强的增殖活性。因此,该模型是可用于PGC体外增殖和分化调控的研究。2.RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其机理的研究本实验研究了RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其相关的信号传导途径。结果表明：经过RA(0.1-10μM)处理后,PGC的集落数目和面积呈时间和剂量依赖性增加。同时RA能够促进细胞间的粘附,提高粘附蛋白E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白和β-连锁蛋白的mRNA水平,增强PGC的粘附性,并存在一定的剂量效应关系。流式分析结果显示,PGC经过RA处理4天后,S/G2期(4N)的PGC数量显着增加,说明此部分细胞已经进入有丝分裂期。此外,RA能激活PGC中PKC和Akt活性,促进NF-κB的核转移,提高钙粘蛋白和β-catenin的磷酸化水平,然而这些刺激作用分别被LY294002(P13K抑制剂),KP372-1(Akt抑制剂),SN50(NF-κB抑制剂)和H7(PKC抑制剂)所阻断。RA显着上调PGC中细胞周期蛋白cyclin D1/E, CDK2/6和原癌基因c-fos, c-myc(?)勺表达,但是这种上调作用被H7、LY294002、KP372-1和SN50所抑制：综上所述,在体外培养条件下,RA通过PI3K/Akt/NF-κB信号级联反应及与PKC/β-catenin之间的交联反应促进鸡胚PGC的增殖,揭示RA在调控鸡胚胎生殖细胞发育中起着重要的作用。3.RA对鸡胚生殖细胞减数分裂的调控机理的研究在本实验中,我们结合胚胎期卵巢的体外培养和RNA干扰等手段,探索RA对鸡胚胎期生殖细胞减数分裂的调控及作用机制。SCP3和γH2AX免疫荧光染色结果表明,鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂,比例逐渐增加,到18.5天,进入减数分裂的细胞几乎遍布整个卵巢。减数分裂早期标志基因Strs8mRNA的表达在12.5天开始显着上调,早于减数分裂启动的时间：而减数分裂标志基因Scp3和Dmcl mRNA(?)内表达则在15.5天显着上调,再次验证鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂；RA合成酶基因Raldh2在15.5天显着上调而降解酶Cyp26bl却逐渐下降,表明Raldh2在RA聚集并维持减数分裂中的重要作用；RA受体RARβ则略微升高,表明其在RA启动减数分裂中的介导作用。而在雄性睾丸中,这些基因的表达变化很小,一直保持较低水平。10.5天和12.5天鸡胚卵巢在无血清的体外培养体系中分别培养5天和3天,生殖细胞能白发启动减数分裂：在培养体系中添加RA能明显增加进入减数分裂的细胞比例,显着上调了减数分裂相关基因Stra8,Scp3和Dmcl(?)的mRNA表达水平。Raldh2shRNA干扰后显着抑制了RA诱导减数分裂启动的作用。综上所述,我们的研究表明,RA及其信号通路对减数分裂启动中的重要调控作用,并首次报道了Raldh2基因敲减能够显着抑制生殖细胞进入减数分裂。4.利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型研究生殖细胞的发育本实验采用RNA干涉(RNAi)的方法,成功设计了叁对针对Raldh2基因序列的保守区域的shRNA (short hairpin)分子,并构建质粒干涉载体。转染鸡胚15.5天卵巢生殖细胞后,转染效率达到80%-90%。通过qRT-PCR及SCP3免疫荧光染色检测,结果表明Raldh2-gallus-1224很好的抑制了Raldh2的表达,成功筛选出能高效抑制Raldh2复制的靶位点。针对有效位点构建了携带有能高效抑制Raldh2的shRNA慢病毒载体,将包装后的病毒注射到X期鸡胚胚盘内进行转基因操作,建立Raldh2基因敲减的转基因鸡模型。结果发现Raldh2基因敲减的转基因鸡胚外观与对照组的鸡胚相比无明显差异,卵巢形态大致正常,应用PCR检测GFP在胚体内的表达,进一步证实我们成功制备了转基因鸡模型,且qRT-PCR检测到Raldh2的表达显着下降。本实验为探索基于LV-siRNA慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立基因敲减的转基因鸡模型,为研究卵泡发育的分子机制奠定基础。以上实验结果表明：鸡胚PGC的体外共培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究,经AKP、PAS及c-kit、SSEA-1、3、4和EMA-1免疫细胞化学染色和干细胞多能性相关基因(Pou5fl,Sox2和Nanog)表达的RT-PCR检测等多种方法证实了PGC的原始性。利用此模型我们研究了维甲酸在PGC体外培养中的促增殖和粘附作用及其分子机理：我们还描述了鸡胚卵巢生殖细胞体内减数分裂启动中的形态学和分子变化,通过组织培养和RNA干扰等手段研究了RA对减数分裂启动的调控作用。这些发现将为禽类干细胞系的建立和转基因模型的制备奠定基础,同时也为进一步研究生殖细胞的发育提供理论指导和实验平台。
石铭[6]2013年在《抗禽流感双表达慢病毒载体的构建及转基因鸡制备方法的优化研究》文中提出禽流感是由正黏病毒科A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病,一旦爆发,不仅会给养禽业带来巨大的经济损失,也会对世界公共安全卫生构成威胁。目前,对鸡群进行免疫是当前控制禽流感爆发最常用的措施,但由于禽流感病毒含有多种亚型,且病毒的变异速度很快,所以疫苗免疫很难达到理想的防治效果,因此,通过导入免疫相关基因或针对禽流感病毒的特异性shRNA,制备抗禽流感转基因家禽,使家禽个体本身具有抵抗禽流感病毒的能力,从而有效抑制禽流感病毒的复制和在家禽个体间的传播,具有重大科学意义和应用价值。为成功制备抗禽流感家禽,本课题从抗禽流感转基因载体构建和鸡转基因技术优化等两个方面进行了研究。第一方面,抗禽流感双表达慢病毒载体的构建。从鸭子体内克隆免疫调控基因RIG-I的cDNA,构建了该基因的真核表达载体CS-RfA-EG-RIG:同时,根据禽流感病毒基因的保守序列设计构建了pENTR4-H1-DP1-DP5等6种shRNA表达载体,并利用模拟禽流感病毒复制的荧光素酶报告基因系统,通过培养细胞上的干扰试验,筛选出了效果最好的shRNA表达载体pENTR4-H1-DP1;在此基础上,凭借Gateway LR反应将shRNA表达序列HI-DPI转移至CS-RfA-EG-RIG载体,从而构建成功了表达RIG-I基因和抗禽流感病毒shRNA的双表达载体CS-RfA-EG-DP1-RIG。将该载体导入293T细胞,利用荧光定量PCR检测到了RIG-I mRNA的超表达；与模拟禽流感病毒复制的报告基因系统5种质粒共转染293T细胞,荧光素酶检测结果表明CS-RfA-EG-DP1-RIG载体同时具有抑制禽流感病毒复制的功能。这一研究为抗禽流感转基因鸡的制备提供了重要的材料基础。第二方面,提高鸡转基因效率方法研究。胚盘下腔慢病毒注射法虽然是目前最为有效的鸡转基因方法,但存在着基因导入效率低、难以获得转基因后代的技术瓶颈。为此,本研究设计了旨在提高胚盘细胞慢病毒感染效率的两条技术路线。首先,利用胰酶将胚盘细胞消化分散,同时注射病毒,使大量胚盘细胞能够接触到病毒。实验结果表明：0.25%胰酶注射至鸡胚盘,可使胚盘细胞呈分散状态,且在开始孵化后能够重新聚集,不影响鸡胚正常发育；胰酶处理鸡胚后再注射表达荧光蛋白的重组慢病毒,孵化4天后,胚胎细胞中呈荧光阳性的细胞比率为0.22%,而直接注射慢病毒的鸡胚中荧光阳性细胞占0.29%,表明胰酶处理对提高鸡胚的病毒转染率作用不显着,其原因在于慢病毒接触胰酶后其生物学滴度受到影响,因此,采取保护措施使病毒免受胰酶处理影响将是今后研究的课题。其次,将已注射慢病毒的种蛋在16℃、22℃和28℃条件下放置24小时,再转移到38.5℃温度下进行孵化,孵化到第4天将鸡胚用0.25%胰酶消化成单个细胞,观测了鸡胚中荧光阳性细胞的比率。注射慢病毒后直接放入孵化箱的对照组平均每1000个细胞中仅有1个细胞观察到荧光(0.09%),而16℃、22℃和28℃实验组分别达到2.30%、0.86%和0.55%。结果表明：鸡胚注射慢病毒后16℃下放置24小时使基因转染效率较直接孵化的常规方法提高了20倍,利用这一改进措施可望获得高度嵌合的转基因鸡。本研究制备了能够同时表达RIG-I基因和抗禽流感病毒shRNA的慢病毒载体,并探索了提高鸡胚转基因效率的可行办法,为下一步成功制备抗禽流感转基因鸡奠定坚实的基础。
孙英民[7]2011年在《慢病毒载体制备转基因鸡技术平台的建立》文中指出自1980年世界上第一只转基因小鼠制备成功后,科学家们就开始进行转基因鸡的研究,因为转基因鸡无论在基础理论研究方面还是在生物技术领域都具有独特的优势,因此建立行之有效的转基因鸡制备技术一直是一个研究的热点领域。虽然世界上已有成功获得转基因鸡的先例,但国内还没有成功获得转基因鸡的报道。本研究拟以绿色荧光蛋白基因为报告基因应用慢病毒载体感染法开展转基因鸡制备研究,希望外源基因能够整合到性腺中,并能够稳定的传递给下一代,以在国内率先建立起一个行之有效的转基因鸡制备技术体系。种蛋的质量是成功获得转基因鸡不可忽视是的一个重要因素。为获得优质的种蛋,以保证实验的顺利进行,我们对周围几个鸡场的种蛋进行筛选。通过实验证实,大午集团的种蛋优于其它鸡场的种蛋。对鸡胚操作后再进行培养的方法有两种,为开窗术和代用蛋壳法。在本研究中采用开窗术进行鸡胚的培养。在对刚产出的种蛋进行消毒处理后,室温条件下水平放置过夜,使胚胎漂浮到最上端。用70%酒精擦拭后,用电磨在赤道面上锯一5mm×5mm见方的口后就可以看到胚胎,然后向其中加一定量的稀蛋清,最后用石蜡和封口膜封口。采用变温孵化。孵化结果显示石蜡封口的孵化率高于封口膜封口。为研究显微注射所造成的机械损伤对孵化率的影响。我们开展了向鸡胚胚下腔注射DMEM液体培养基实验。对新鲜种蛋消毒和开口处理后,利用显微注射的方法向胚下腔中注射2～2.5uLDMEM液体培养基。共成功注射25枚种蛋,最后有9只雏鸡出壳,其孵化率为36%。结果显示我们的注射方法满足后续实验的进行。本研究中制备转基因鸡的方法为慢病毒载体法。慢病毒载体法是制备转基因鸡方法中最为成熟的一种方法。所使用的慢病毒载体为叁质粒系统,即由穿梭质粒,包装质粒和包膜质粒构成。在穿梭质粒中用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因。采用逐级稀释法和感染293FT细胞实验进行病毒滴度的测定。其结果显示病毒滴度为1×10~9感染单位/mL(TU/mL)。在进行转基因鸡制备实验中,我们向鸡胚胚下腔内注射2～2.5uL携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体悬液,其滴度为1×10~9U/mL,对其封口后进行孵化。共成功注射110枚种蛋,最后得到了32只原代鸡。在鸡30日龄时,我们从鸡翅静脉采血,利用酚氯仿抽提方法提取鸡血基因组DNA,通过基因组DNA PCR方法扩增EGFP和部分载体序列。其中有4只扩增出同预期大小一致目的片段。更为有意义的是,在所养的16只公鸡性成熟后,采其精液再利用酚氯仿抽提方法提取精液的基因组DNA,通过PCR扩增和对目的片段回收测序方法鉴定,其结果显示有6只公鸡发生了性腺整合,其性腺整合率达到37.5%.总之,本研究建立了利用开窗术培养鸡胚和慢病毒载体制备转基因的方法,为后续开展转基因鸡研究创造了有利条件。
刘同欣[8]2015年在《输卵管特异性表达人防御素4基因转基因鸡的制备》文中进行了进一步梳理抗菌肽是一类具有生物活性的小分子多肽,具有广谱的抗菌活性且不易引起细菌的耐药性,因其独特的抑菌机制,未来可能成为一种新型的抗菌药物。防御素是人体中一类重要的抗菌肽,根据结构可将其分为α和p防御素。人的防御素4(HNP4)是一种由DEFA4基因编码的α类型的防御素,成熟的HNP4由33个氨基酸残基组成,分子量约为3.7 kD。HNP4具有高效的抑菌活性,其抗大肠杆菌的活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的100倍左右,对链球菌和白色念珠菌的抗菌活性是其他α防御素(HNP1～HNP3)的4倍左右,另外HNP4还可以抵抗HIV及HSV等病毒的感染。利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的技术。鸡的输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。但是鸡的生殖系统较特殊,鸡胚的发育在蛋壳内进行,这些特点使得制备转基因鸡较困难。目前利用慢病毒和PGCs制备转基因鸡被认为是最可行的两种方法,但因外源基因的生殖传递效率较低,使得制备转基因鸡的技术仅在少数的发达国家有成功报道。本课题结合输卵管生物反应器的优势,利用慢病毒制备在输卵管中特异表达HNP4的转基因鸡。首先克隆了包含激素依赖性调控元件(SDRE)和负调控元件(NRE)的2.8 kb卵清蛋白启动子(Ova),并在细胞水平上验证了该启动子的生物活性。同时,通过化学合成的方法获得了5’端带有鸡溶菌酶信号肽序列并经过鸡密码子优化的HNP4序列,进而构建了利用ova启动子驱动HNP4基因表达的载体(pWPXL-Ova-HNP4和pWPXL-Ova-HNP4-His),并将其包装成相应的慢病毒。将慢病毒载体注射到自来航鸡胚的胚盘(X期)下腔中以制备转基因鸡,共注射了669个鸡胚,孵化得到了218只小鸡,孵化率为32.6%。将10只G0代生殖嵌合的公鸡与非转基因母鸡交配,在1274只后代中,鉴定得到了15只G1代转基因阳性鸡,生殖传递效率为0.6%～3.4%。Southern blot和Genome Walking结果显示G1代转基因鸡具有6个不同的插入位点,即单拷贝的HNP4分别插入到了鸡的1,2,3,4,6以及24号染色体中。对G1和G2代转基因鸡进行RT-PCR和免疫荧光分析,结果表明HNP4在G1和G2代鸡的输卵管组织中特异表达,而且ELISA检测的结果表明HNP4在G1和G2代转基因杂合体鸡蛋清中的表达量为1.65 μg/mL～10.18 μg/mL,不同插入位点的HNP4基因在转录和翻译水平存在显着差异。综上所述,本论文成功制备了能够在蛋清中表达HNP4的转基因鸡,且外源基因HNP4能够在G1和G2代转基因鸡中稳定表达,这一研究成果为利用输卵管反应器生产药物蛋白奠定良好的基础。
韦光辉[9]2010年在《转牛生长激素基因鸡的研究》文中研究表明生长激素,是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一类单链多肽类激素,它是一种具有广泛生理功能的生长调节素。能影响几乎所有的组织和细胞,其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化,调节蛋白质、糖及脂肪的代谢。与动物生长发育、繁殖等密切相关,目前成为在提高动物生长速度、生长性能等方面研究的热点之一。本研究将牛生长激素基因功能区的基因片段构建到真核表达载体pEGFP-N1,对重组质粒pEGFP-N1-BGH进行脂质体包埋,采用胚盘显微注射法制备转基因鸡,为培育具有生长速度快、适应能力强等特性以及产业化前景广的转基因鸡打下基础。研究结果如下:本研究运用分子生物学技术,提取犊牛脑垂体总RNA,利用设计的一对特异性引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增出BGH基因功能区片段,通过DNA重组技术将该基因片段定向克隆到pEGFP-N1真核表达载体CMV启动子下游,构建pEGFP-N1-BGH表达载体。通过PCR扩增、酶切和测序的方法对重组DNA进行鉴定。结果显示:应用RT-PCR克隆的BGH功能区片段,长度为654bp;成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。且BGH基因和EGFP基因读码框一致。鸡蛋开窗法是鸡胚盘显微注射法的关键技术之一,为此本研究对未转染外源基因的种蛋开口后进行了4种不同的封口方法对孵化率的影响试验。设置四个试验组:①蛋壳膜+封口胶,②蛋壳膜+蛋壳,③蛋壳膜+石蜡,④蛋壳膜。同时把未经任何处理的种蛋设置为对照组。结果表明:4个实验组的鸡胚的孵化率分别为10%,18%,8%,2%。而对照组孵化率为83.3%。蛋壳膜+蛋壳的封口方法处理的孵化率相对最高。采用胚盘纤维注射法进行转染试验,一次注射受精卵200枚,孵出小鸡21只,孵化率为10.5%,对孵化后死亡的5~7胚龄的全胚和7胚龄后的鸡胚的心、肝、脾、肺、肾、脑、皮肤以及活鸡的血液、皮肤进行检测。荧光检测结果显示:荧光检测阳性率为3.3%(5/121),PCR检测结果显示:PCR检测结果阳性率为2.47%(3/121)。试验结果表明:外源基因通过脂质体的包埋,采用胚盘纤维注射法可获得转基因鸡,胚盘显微注射法是制备转基因鸡的一条有效途径。
周振明[10]2004年在《采用转染血液循环期原始生殖细胞方法和鸡—兔异种动物核移植方法制备转基因鸡》文中指出鸡的原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)是鸡各级生殖母细胞和成熟配子共同的祖先，最终发育分化成卵子或者精子。对鸡PGCs进行体外或者体内转染外源基因操作，再通过后代的筛选，就能获得转基因的后代。本论文首先对鸡PGCs的迁移路径进行确定，然后根据PGCs迁移的位置进行转染外源基因，最后通过后代筛选获得了转基因的后代。同时，采用异种动物核移植和嵌合体制备的方法以期获得转基因鸡。为此，本文主要进行了以下研究： 1，鸡PGCs迁移过程中的抗体检测：应用两种单克隆抗体MC-480和2C9对PGCs迁移的路径和规律进行确定。同时利用PGCs含有大量糖原颗粒能够进行PAS反应的特点确认细胞的类型，结果表明生殖新月组织中的PGCs，血液循环期的PGCs和性腺中的PGC都具有免疫组化阳性反应。根据实验的结果可以推论PGCs在迁移的过程中具有抗单克隆抗体MC-480抗原分子和抗2C9单克隆抗体抗原分子。 2，鸡胚发育早期的性别鉴定和血液循环期PGCs含量的差异：在胚胎发育早期(13-17期)应用M-PCR进行胚胎性别的早期鉴定。结果为：18S核糖体基因上256bp的片段在公鸡和母鸡的DNA样品中均有扩增，W染色体上高度重复序列EcoR Ⅰ家族的447bp片段只在母鸡的DNA样品中有扩增。研究表明：在胚胎发育的早期(13和14期)，雌性胚胎血液中的PGCs含量显着高于雄性胚胎。随着胚胎的发育，雌性胚胎和雄性胚胎血液中的PGCs含量差异逐渐消失，17期血液中PGCs的含量没有差异。因此，13期转染血液循环期的PGCs有利于制备转基因的母鸡，14-15期转染内源性的PGCs有利于制备转基因的公鸡。 3，胚胎背主动脉注射对胚胎性腺中PGCs数量的影响：鸡胚发育至14-16期，经背主动脉胚胎微注射DMEM，对雌性胚胎性腺切片PAS染色进行PGCs计数，结果表明正常发育组4枚胚胎PGCs的平均数为64±2.97，机械损伤组5枚胚胎的平均数为51.6±4.23，两者之间差异显着(p＜0.05)。说明背主动脉注射造成胚胎性腺中PGCs的数量下降，但是其对胚胎的活性没有影响。 4，质粒转染血液循环期PGCs制备转基因鸡：鸡胚胎发育至15期，脂质体-质粒DNA复合物进行背主动脉注射，转染血管中循环期的PGCs来制备转基因鸡。根据注射质粒类型的不同分成两组，注射质粒pEGFP-N1组和注射质粒pEOVALG组，两组PCR检测结果表明5日龄、10日龄胚胎和18日龄胚胎的基因组DNA中能够扩增出GFP基因上471bp的目的片段，注射质粒pEOVALG组性成熟的1只母鸡和2只公鸡的血液中检测到外源GFP基因的存在，后代PCR筛选未获得转基因的后代。注射质粒pEGFP-N1组4只成年的母鸡血液中检测到外源GFP基因的存在，G0代母鸡进行后代PCR筛选的结果表明4只鸡将外源基因传递给后代的效率从5％到53.6％。G1的血液样品经PCR扩增后471bp的目的片段中，测序结果表明目的片段与pEGFP-N1中GFP基因序列完全一致。利用质粒pEGFP-N1中绿色荧光蛋白基因上的471bp的片段作为探针，与G1代的基因组DNA，进行ECL法斑点杂交，27只G1斑点杂交的结果呈阳性，转基因种系传递的效率为19.6％(27／138)。G1胚胎孵化36h，将胚胎整体取下，荧光显微镜下蓝光激发，观察到胚胎整体呈绿色。G1胚胎孵育5d，荧光显微镜观察结果表明肾脏呈绿色。因此，转染血液循环期PGCs可以高效获得转基因鸡。 5，鸡—兔异种动物核移植获得重构囊胚：将鸡的胚盘细胞注入到兔MⅡ期去核的卵母细胞中，重新构建的鸡一兔异种动物克隆胚胎能够发育到囊胚阶段。当X期鸡的胚盘细胞注射到卵时，83.51%的重构胚体能够融合，6.27%的融合胚胎能够进一步发育，形成与哺乳动物相似的囊胚腔。PCR鉴定和核型分析的结果表明桑堪胚和囊胚的遗传物质来源于供体鸡细胞。应用线粒体特异性引物扩增的结果表明重构胚体中同时具有供体鸡和受体兔的线粒体;单克隆抗体讹一480检测和单克隆抗体2C9检测呈阳性;本研究结果表明兔的卵母细胞胞质能够将鸡胚盘细胞去分化和进行重新编程，支持重构胚胎的早期发育。
参考文献：
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[2]. 转基因鸡制备技术研究进展[J]. 谢德明, 陈良, 龙小曾, 成进波, 刘灵康. 现代农业科技. 2018
[3]. 慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术研究[D]. 徐世永. 南京农业大学. 2007
[4]. 卵黄抗体重链恒定区介导外源蛋白在蛋黄中表达的研究[D]. 浮帅古. 河南农业大学. 2014
[5]. 维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究[D]. 于敏莉. 浙江大学. 2012
[6]. 抗禽流感双表达慢病毒载体的构建及转基因鸡制备方法的优化研究[D]. 石铭. 浙江师范大学. 2013
[7]. 慢病毒载体制备转基因鸡技术平台的建立[D]. 孙英民. 河北农业大学. 2011
[8]. 输卵管特异性表达人防御素4基因转基因鸡的制备[D]. 刘同欣. 中国农业大学. 2015
[9]. 转牛生长激素基因鸡的研究[D]. 韦光辉. 河南科技大学. 2010
[10]. 采用转染血液循环期原始生殖细胞方法和鸡—兔异种动物核移植方法制备转基因鸡[D]. 周振明. 中国农业大学. 2004