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敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

2020-12-02阅读(759)

敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究

论文摘要

利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA（sgRNA）表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒（AIV）感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。

论文目录

  • 1 材料和方法
  •   1.1 材料
  •   1.2 方法
  •     1.2.1 sgRNA的设计和寡核苷酸链合成
  •     1.2.2 sgRNA表达载体的构建
  •     1.2.3 RIG-I基因敲除MDCK制备及筛选
  •     1.2.4 Western blot检测
  •     1.2.5 遗传稳定性与细胞增殖速度分析
  •     1.2.6 MAVS、IRF3、IFN-β、Mx1、IL-6 mRNA转录水平的荧光定量PCR
  •     1.2.7 病毒基因拷贝数的荧光定量PCR检测
  •     1.2.8 TCID50测定
  •   1.3 统计与分析
  • 2 结果
  •   2.1 pUC19-sgRNA表达载体构建
  •   2.2 Cas9和pUC19-sgRNA双质粒共转染MDCK细胞
  •   2.3 MDCK细胞RIG-I基因敲除细胞克隆株的筛选
  •   2.4 Western blot检测敲除细胞中RIG-I蛋白表达
  •   2.5 RIG-I基因敲除细胞系遗传稳定性及增殖速度分析
  •   2.6 MAVS、IRF3、IL-6、IFN-β和Mx1 mRNA表达水平
  •   2.7 RIG-I基因敲除促进流感病毒在MDCK细胞内的增殖
  •     2.7.1 H9N2基因拷贝数
  •     2.7.2 细胞培养上清病毒TCID50滴度测定
  • 3 讨论

    • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 曾为俊,许曼,王辉,鲁国涛,邵玉乐,陈洪岩,刘建华,孟庆文

    关键词: 细胞系,基因敲除,亚型流感病毒

    来源: 中国家禽 2019年11期

    年度: 2019

    分类: 农业科技,基础科学

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 新疆农业大学动物医学学院,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

    基金: 兽医生物技术国家重点实验室开放基金课题(SLLVBF201511),转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08006-001B)

    分类号: S852.65

    DOI: 10.16372/j.issn.1004-6364.2019.11.003

    页码: 12-17

    总页数: 6

    文件大小: 2895K

    下载量: 164

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