郑小坚[1]2003年在《猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因融合表达载体的构建及初步表达》文中指出猪瘟病毒(CSFV)囊膜糖蛋白E2是CSFV的主要保护性抗原，可诱导产生中和抗体和保护性免疫。本研究将CSFV F114株的E_2基因克隆进GST融合原核表达载体pGEX-4T-1的EcoRI和BamHI位点，获得重组原核表达载体pGEX-4T-E_2。以大肠杆菌BL21为宿主菌进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示，在约63kD处有一特异性条带，其分子量与由目的基因所推导的蛋白质分子量相符，推测为E_2与GST融合表达基因产物。将E_2基因克隆进杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californiamultiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)转移载体pAcSecG2T的EcoRI和BamHI位点，获得了带有核型多角体病毒囊膜蛋白gp67信号肽序列与GST-E_2融合表达杆状病毒重组转移载体pAcSecG2T-E_2。在脂质体的介导下，pAcSecG2T-E_2载体与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6共转染家蚕培养细胞Bm-N，空斑筛选分离纯化重组病毒(Bm-BacPAK6-E_2)。PCR检测表明所分离的重组病毒含有目的片段E_2基因。SDS-PAGE检测表明，在感染重组病毒后，无论是家蚕细胞，还是家蚕幼虫、蛹的血淋巴中都可以检测到一条分子量约为63kD的特异性条带，推测为外源基因的表达产物。本研究在原核细胞与家蚕杆状病毒表达系统中均成功地融合表达了CSFV F114E_2基因，为进一步纯化表达的E_2抗原蛋白和CSFV诊断试剂的开发应用奠定了基础，为研制CSFV新型亚单位疫苗进行了有益的探索。
苏小运[2]2003年在《猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋白的初步应用》文中提出本文利用不同大肠杆菌表达系统(所用表达载体分别为：pThioHisB和pET-32a(+))表达了猪瘟兔化弱毒编码E2蛋白A／D抗原区的基因，并对其表达特性进行了比较。选取含pET-E2HA重组质粒的BL21(DE3)，即BL21E2HA大量表达重组蛋白，通过盐酸胍溶解，通过His Bind柱纯化了重组蛋白，定量并以其为包被抗原建立了间接ELISA方法。利用此方法测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平；比较了此方法和间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平的灵敏度。主要实验内容包括： 1．构建了两株重组质粒：pTH-E2和pET-E2，所用表达系统分别为pThioHisB和pET-32a(+)，优化了表达条件并比较了两种质粒的表达特性，发现pET系统在表达此段基因时产量明显优于pThioHisB系统； 2．选择pET-E2进行后继工作：将3个串联的HA(人血凝素表位)基因插入到pET-E2重组质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间，得到pET-E2HA重组质粒，含有此质粒的BL21(DE3)命名为BL21E2HA，并将其成功的表达； 3．利用BL21E2HA大量表达重组蛋白，将细菌裂解，超声波破碎、离心分离包涵体，盐酸胍溶解后过His Bind柱，纯化了重组蛋白； 4．利用BSA制备标准曲线，并对处于不可溶状态的纯化后重组蛋白进行了定量。在此基础上，用其作包被抗原建立了间接ELISA方法；利用此间接ELISA方法，测定了约150份囊素与猪瘟兔化弱毒疫苗共同免疫猪血清的猪瘟抗体水平，发现经囊素共同免疫后，猪瘟抗体水平有明显提高，这从另一方面证明，该方法具有一定的实用价值，可以进行猪瘟抗体水平的测定； 5．比较了间接ELISA方法和现有的间接血凝试剂盒测定猪瘟抗体水平时的灵敏度，发现该方法明显优于后者。 6．构建了一个用以检测在细胞培养上猪瘟病毒粒子存在的重组质粒。
韩国全[3]2009年在《含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用》文中研究说明为适应以减毒胞内寄生菌为运载体的兽用基因疫苗研究发展趋势,研究构建含有减毒胞内寄生菌自身内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,以增强基因疫苗诱导有效保护性免疫。基于以上考虑,本课题研究旨在研制含猪霍乱沙门菌内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗通用表达载体,既能够在运载体原核细胞中可调控表达携带抗原基因,又能够在真核细胞中启动表达携带抗原基因,以期与S.C500合用开发适于粘膜免疫的猪群重组活菌疫苗。为此,本研究首先扩增出猪霍乱沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,然后分析其启动活性,进一步构建新型双功能表达载体pCB-neo、pCC-neo,系统研究表达载体的启动活性特点,检验S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo基础构建的基因疫苗的可行性。本课题研主要研究内容包括:Ⅰ.猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析为获得沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,利用PCR技术从猪霍乱沙门菌疫苗株S.C500基因组DNA中扩增出启动子PnirB、PpagC基因区域片段,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组质粒pUCX-PnirB、pUCX-PpagC。序列分析结果显示启动子PnirB、PpagC与其它沙门菌相关序列核苷酸同源性较高,分别为96%～100%、93%～99%,其中与霍乱沙门菌SC-B67核苷酸同源性分别高达100%、99%,说明两启动子基因区域高度保守。生物信息学网络软件NNPP分析结果显示,PnirB启动子基因区域序列有3个较强的启动子Promotor序列,PpagC启动子基因序列有12个较强的启动子Promotor序列,说明试验所扩增的两个基因启动子区域片段具有启动基因表达的基本元件。Ⅱ.沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究为考察沙门菌启动子的启动表达能力及特点,运用基因工程技术构建携带有沙门菌内源性启动子PnirB、Ppagc的单一启动子表达载体pPB、pPC,进一步构建其报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP,并转化到S.C500中进行相应的诱导性表达。通过表达菌液荧光观察、菌细胞表达荧光检测、SDS-PAGE检测,确证EGFP的获得成功表达,证实克隆获得的启动子PnirB、PpagC区域基因片段在S.C500中具有启动活性。Ⅲ.新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建及表达活性研究为研制含沙门菌内源启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,利用PCR技术亚克隆启动子必需区域基因片段PnirB(CB)(190bp)、PpagC(CC)(490bp),并设计添加SD-Kozak杂合序列,替换pCI-neo启动子Pcmv下游的Chimeric intron基因区域,构建双功能疫苗表达载体pCB-neo、pCC-neo。进一步构建报告基因载体pCB-EGFP、pCC-EGFP。实现EGFP在S.C500中表达,证实PnirB(CB)、PpagC(CC)可以在S.C500中驱动外源基因的表达;实现EGFP在Vero细胞中表达,证实原载体中启动子Pcmv可以在Vero中驱动外源基因的表达,说明下游新插入的启动子不影响其启动活性:实现EGFP在小鼠体外培养巨噬细胞中表达,进一步证实S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo为表达载体构建的新型基因疫苗的可行性。Ⅳ.内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究为获得内江猪白细胞介素15基因序列片段,利用RT-PCR技术从经由Con A刺激的内江猪PMBC扩增了pIL-15基因,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组克隆质粒pUCX-njpIL-15。构建原核表达载体pMAL-pmIL-15,实现pIL-15在大肠杆菌中高效表达。MTT法试验显示融合产物MBP-pmIL-15经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖。构建真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD(PRV)联合肌注免疫BALB/c雌性小鼠试验显示,pCI-pIL15能够促进小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞数量增殖,加强基因疫苗pCI-gD(PRV)特异性中和抗体的产生:试验证实内江猪IL-15具有免疫佐剂作用。Ⅴ.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的分子克隆与原核表达研究为获CSFV-E2基因片段,利用RT-PCR技术从PK-15细胞增殖的CSFV四川分离株中成功分子克隆E2基因,含有编码E2蛋白完整基因序列,共1119 bp,编码373 aa。构建原核表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe),转化到宿主菌E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS进行表达研究,SDS-PAGE电泳检测及Western blot分析结果显示,试验成功表达的mE2(pe)、E2(pe)均具有一定的生物学免疫反应活性。CSFV-E2主要抗原位点区域(mE2)的成功原核表达,为进一步研究新型猪瘟病毒基因疫苗奠定理论基础。Ⅵ.猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究运用分子生物学实验技术将内江猪IL-15成熟肽基因与CSFV-E2主要抗原位点区域基因有机连接,构建融合双基因的克隆重组质粒pUCX-ME2-IL-15。构建真核表达载体pEGFP-ME2-IL-15,转染到Vero细胞中,荧光检测证实表达出增强型绿色荧光蛋白融合蛋白,证实试验构建的目的融合双基因ME2-IL-15可以在真核Vero细胞中获得表达,为进一步研究融合双基因ME2-IL-15奠定理论基础。构建融合双功能重组表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照真核重组表达载体pCI-ME2-IL-15,分别将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15转化到S.C500,SDS-PAGE电泳及Western-blott检测显示融合双基因ME2-IL-15在S.C500中成功表达,证实PnirB(CB)、PpagC(CC)可以在S.C500中驱动融合双基因ME2-IL-15的表达:将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15转染到哺乳动物Vero细胞中,mRNA转录、间接免疫荧光及夹心ELISA检测结果证实Pcmv可以在Vero中驱动外源基因ME2-IL-15的表达。为进一步研究S.C500运载双基因融合表达基因疫苗奠定试验基础。Ⅶ.融合双基因疫苗在S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力影响的研究为了考察融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力的影响,试验对构建的重组工程活菌苗进行系统研究。结果显示,双功能表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照pCI-ME2-IL-15存在与否不影响运载菌S.C500的生物学特性,对其生化鉴定特性亦不影响,除Amp抗性外,重组菌与运载菌的药敏性一致;基因疫苗表达载体所插入的融合双基因ME2-IL-15增加其在运载菌S.C500体内的稳定性;基因疫苗的存在使运载菌S.C500对ST细胞的粘附能力、侵袭能力及其在ST细胞体内的增殖能力均有一定程度的下降,对运载菌本身的免疫效应有一定影响;口服免疫28日龄BALB/c雌性小鼠具有一定的稳定性和免疫安全性,可以有效的将基因疫苗运载至免疫小鼠机体细胞;为研究S.C500运载基因疫苗的免疫应答奠定前提。Ⅷ.融合双基因疫苗重组S.C500活菌苗口服接种家兔的免疫应答初步研究为检测家兔血清中S.C500抗体水平,建立猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法,确立抗原最佳包被浓度为0.305μg/mL,血清最适稀释度为1:40,试验测定血清样品的D_(492 nm)值,判定标准通过标准阴性血清按照P/N比值公式进行判断,P/N≥2.1为阳性,1.5＜P/N≤2.1为可疑,1.5＜P/N为阴性;可以间接反应抗体水平的高低。家兔血清CSFV抗体检测结果显示对照A组(口服PBS缓冲液对照)无CSFV抗体,B组(口服S.C500/pCB-ME2-IL-15)、C组(口服S.C500/pCC-ME2-IL-15)、D组(口服S.C500/pCI-ME2-IL-15)、E组(口服S.C500/pCI-ME2)首免后14天即已产生CSFV抗体,第二、叁次均呈上升趋势,B、C组免疫效果优于D、E组,B、C组之间相比C组免疫效果稍好,D、E组之间相比D组免疫效果稍好,试验研制的双功能疫苗通用表达载体pCB-neo、pCC-neo具有一定优势;S.C500抗体检测结果显示,试验构建的四个重组工程菌组经灌服均产生了较高的抗体水平,对照灌服PBS缓冲液组未能检测到抗S.C500特异性抗体的存在。免疫家兔T淋巴细胞增殖检测分析显示,对照A组家兔叁次T淋巴细胞增殖率均低于15%,之间差异亦不大;B、C、D、E四个口服免疫组T淋巴细胞增殖率均高于18%以上,末次免疫后14d,B组增殖率有小幅度下降,C、D、E叁组增殖率均有不同程度的增强提高。于末次免疫后14d,用4头份猪瘟兔化弱毒脾淋苗肌肉注射进行攻毒,以热反应为判定标准,保护率依次为0%、40%、60%、40%、25%,说明S.C500为运载体的猪瘟基因疫苗能够诱导家兔产生一定抗CSFV的保护性特异抗体,其中试验研制的基因疫苗通用表达pCC-neo携带的抗原基因保护率较高,具有一定优势。采用4×10~(10) CFU/只剂量的猪伤寒沙门菌野毒株口服接种攻毒试验,结果表明试验所构建的四个重组工程菌均能够诱导家兔产生一定水平的抗猪伤寒沙门菌野毒株的保护性特异抗体。
刘瑞峰[4]2008年在《猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表达研究及其单克隆抗体的制备》文中认为猪瘟(classical swine fever;CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus;CSFV)引起的猪的一种高度接触性、急性传染病,以发热和出血为主要特征。CSFV囊膜糖蛋白E2含有A、B、C、D四个抗原结构域,是其最主要的保护性抗原,它能够诱导机体产生中和抗体,并保护猪抵抗强毒的攻击。E2最易变异,是CSFV叁种糖蛋白中保守性最低的蛋白,常用于基因工程疫苗和鉴别诊断的靶目标,一直都是CSFV研究的热点。本研究中分别采用原核表达系统和杆状病毒表达系统对E2蛋白进行了表达,并制备了3株抗CSFV E2蛋白的单克隆抗体,为猪瘟病原快速诊断方法的建立奠定了基础。1.CSFV E2蛋白在原核和杆状病毒系统中的表达研究我们首先分析CSFV E2蛋白的特性,选择用原核表达系统表达E2基因的不同抗原表位区。根据E2基因序列,设计并合成2对引物,分别用于扩增E2基因ABCD抗原区和AD抗原区。将扩增得到的不同E2基因的片段克隆至pMD18-T载体中,获得pT-E2/ABCD和pT-E2/AD重组质粒。经核苷酸序列测定,E2基因ABCD抗原区和AD抗原区分别长645bp和300bp,编码215个氨基酸和100个氨基酸。将得到的不同抗原区基因片段克隆至pGEX-KG表达载体中获得了重组表达载体pKGE2ABCD和pKGE2AD,与载体GST蛋白形成融合表达蛋白。经鉴定后,转化大肠杆菌BL21-condonplus-RIL感受态细胞,IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达蛋白为融合蛋白,分子量分别约为50kDa和36kDa,表达产物主要以包涵体的形式存在;Western blot检测表明,表达产物能与CSFV阳性血清发生特异性反应,具有良好的生物学活性。杆状病毒表达系统常用于外源病毒蛋白的表达,表达的蛋白能够保持良好的抗原性。在本研究中,我们选择杆状病毒Bac to Bac表达系统。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pT-E2,回收E2片段,克隆至pFastBac-HT载体中构建了pFastBac-E2;转化DH10Bac感受态细胞并在菌体中发生转座,构建了重组杆状病毒穿梭表达载体Bacmid-E2,经PCR鉴定证实E2基因成功整合到了杆状病毒基因组。最后转染Bacmid-E2到SF-9细胞,获得重组杆状病毒,连续扩大病毒3代后用于蛋白表达。间接免疫荧光结果显示感染重组杆状病毒的sf9昆虫细胞可以发荧光,但反应不强,目的蛋白表达量太低,不能用于后续研究。2.猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备将上述原核表达的蛋白纯化后,免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA法进行筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,经过3次融合共获得3株能稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4H5、1C7和4H4。其中4H5和1C7株为针对E2 ABCD表位单克隆抗体,4H4为针对E2 AD表位单克隆抗体。细胞上清和腹水的效价分别为0.4×10~3、0.8×10~3、0.4×10~3和0.2×10~6、0.5×10~5、0.4×10~6,抗体类型为IgG2a、IgG2b和IgG1。间接免疫荧光试验显示3株单克隆抗体都可以和CSFV发生特异性结合,其中4H5和4H4和病毒的反应强于1C7。Western blot检测结果表明,4H5和4H4均可以和CSFV发生反应。
郑小坚, 缪竞诚, 曹广力, 朱江, 顾全丰[5]2005年在《人工饲料育家蚕/杆状病毒表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因》文中提出以重组病毒Bm-BacPAK6-E2接种全龄人工饲料育及5龄桑叶育家蚕皓月×菁松幼虫、蛹,观察重组病毒的感染发病情况,调查病蚕、蛹的采血量并进行SDS-PAGE分析.结果表明,全龄人工饲料育家蚕接种重组病毒的成功率、采血量等指标均与5龄桑叶育相近,SDS-PAGE蛋白质电泳在家蚕幼虫、蛹血淋巴中均检测到1条与目的蛋白理论分子量(63 kD)相符的特异性蛋白条带,初步认为是重组病毒Bm-BacPAK6-E2的融合表达产物.
李素[6]2007年在《猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备》文中进行了进一步梳理CSFV是黄病毒科瘟病毒属成员,基因组编码4个结构蛋白(C、E0、E1、E2)以及至少7个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。其中E2蛋白为重要的免疫保护性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。许多诊断方法以及标记疫苗的研究大都是围绕E2开展的。E2蛋白的828-842抗原表位(氨基酸序列为QTAVSPTTLRTEVVK)是中和抗原表位,该表位在CSFV高度保守,而同属的BVDV和BDV却不存在这一表位。本实验克隆了CSFV石门株E2基因和E2的抗原表位的4个重复(4P),分别插入pGEX-6P-1、pMAL-P2X表达载体中,构建了4个原核重组表达质粒,诱导后4个重组表达质粒均得到表达。将表达蛋白的上清MBP-4P、GST-4P、MBP-E2,以及复性和变性后的包涵体GST-E2应用亲和层析的方法进行了纯化,纯化后的蛋白经ELISA和Western-blotting检测具有反应性,能与猪瘟病毒阳性血清发生反应。MBP-4P、GST-4P不与兔抗BVDV E2血清发生反应,因此,可以作为一个潜在的鉴别CSFV的抗原。应用表达的融合蛋白MBP-E2、MBP-4P以及实验室制备的昆虫细胞sf9杆状病毒表达系统表达的真核E2蛋白联合免疫家兔,制备了较高滴度的多克隆血清。ELISA、Western-blotting,IFA试验证明所制备的多克隆血清具有良好的反应性和特异性。本研究为建立猪瘟病毒组合抗原的抗体检测方法和猪瘟鉴别诊断以及大量表达CSFV E2蛋白研究其结构和功能打下基础。
孙永科[7]2007年在《表达猪瘟病毒石门株E0/E2基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究》文中进行了进一步梳理猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病,死亡率极高,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界动物卫生组织(OIE)列为家畜A类传染病,我国也将其列为一类动物疫病。多年的实践经验证明,疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。20世纪60年代,我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在猪瘟病毒防控中起到了决定性作用,有效的控制了猪瘟在我国大规模的流行。但目前猪瘟仍在我国各大养猪地区呈非典型性和地方性流行,说明兔化弱毒疫苗已不能完全控制猪瘟的发生和流行。因此,研制新型疫苗已成必然趋势。本文构建了表达CSFV Shimen株E0/E2基因的重组腺病毒pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2,并对这3种重组腺病毒疫苗的免疫效果进行了研究,为研制猪瘟病毒活载体疫苗奠定了坚实的基础。1.表达CSFV E0 /E2基因的重组腺病毒pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2的构建及鉴定。首先用PCR方法分别从pMD-18T-E0和pMD-18T-E2质粒中扩增出E0基因和E2基因,分别将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建出重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-E0和pAdTrack-E2。将E0基因和E2基因在载体pET-32a中串联,用Kpn I和Not I双酶切得到E0-E2串联基因片段,将其定向克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中得到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-E0-E2。用Pme I内切酶分别对pAdTrack-E0、pAdTrack-E2和pAdTrack-E0-E2质粒酶切线性化,回收后转化含有腺病毒骨架载体pAdEasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,穿梭载体和骨架载体发生同源重组,分别得到含有E0基因、E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒骨架载体pAdEasy-E0、pAdEasy-E2和pAdEasy-E0-E2。用Pac I内切酶分别酶切pAdEasy-E0、pAdEasy-E2和pAdEasy-E0-E2,琼脂糖凝胶电泳分别回收后通过脂质体介导法将这3种骨架载体转染HEK293细胞,获得了含有目的基因的重组腺病毒pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2。用同样的方法制备对照空载腺病毒pAd-CMV。该重组病毒能在293细胞上产生典型的细胞病变。PCR和Western blot检测证实,这3种重组腺病毒能稳定携带并表达E0、E2和E0-E2蛋白。体外连续传代试验表明,本试验构建的重组腺病毒具有良好的遗传稳定性。2.以小鼠为动物模型评价以上3种重组腺病毒的免疫效力。将12只Balb/c小鼠随机分为3组(每组4只),分别腹腔途径注射经过扩增和纯化的pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2重组腺病毒,接种剂量为1×108 pfu/只,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后每周采血,用猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒检测抗体,结果表明,通过2次免疫后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2重组腺病毒均能诱导小鼠产生针对CSFV的特异性抗体,CSFV抗体的滴度最高分别达到1∶10 240、1∶20 480和1∶10 240,这为重组腺病毒疫苗本动物免疫保护性试验研究奠定了良好的基础。3.重组腺病毒对猪的保护性试验。用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品化猪2次(间隔20 d),免疫剂量均为1.2×109 pfu。同时设非重组腺病毒接种组和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组的保护率分别为50 %、75 %和75 %,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的保护率为60 %, pAd-CMV免疫组和空白对照全部死亡;在攻毒前,重组腺病毒免疫组抗体水平普遍较低,商品化疫苗免疫组能100 %检测到抗体,而非重组腺病毒和空白对照没有检测到抗体;攻毒后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组中分别有75 %、50 %和50 %猪体温超过40℃,常规苗试验组80 %体温超过40℃,而对照组所有试验猪体温均超过40℃。临床症状的检测证明该重组腺病毒疫苗能提供一定的保护效果。上述结果,表明仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离,含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。
万超[8]2009年在《抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究》文中认为猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的、猪的一种高度致死性传染病,在世界许多国家和地区广泛流行,在国际兽医局制定的《国际动物卫生法典》中,猪瘟被列入A类16种法定传染病之一。我国也作为Ⅰ类动物疫病加以重点控制。自50年代以来,我国自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(“C”株)的广泛应用,在控制猪瘟的爆发流行中发挥了重要作用。然而,猪瘟兔化弱毒疫苗五十多年的长期使用,并未能有效控制猪瘟的发生和传播。近年来,我国猪瘟发生呈明显上升态势,并出现诸如散发流行、慢性猪瘟、持续感染和妊娠母猪带毒综合征等新特点。病毒逃避机体的免疫清除和在猪体内局部的持续存留；疫苗制品质量问题；运输和保存不当导致疫苗效力降低或失效；以及疫苗株毒力的回复突变等是其主要原因。因此,在欧美一些国家已明确禁止使用猪瘟弱毒活疫苗接种。我国是养猪大国,猪瘟的发生和流行,是制约农村养猪业发展的瓶颈。为满足对猪瘟预防、控制和最终根除的需要,研制新一代抗猪瘟疫苗制品以替代传统猪瘟兔化弱毒疫苗,势在必行。本研究在对猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和Erns保护性抗原区域结构分析的基础上,利用RT-PCR技术,以猪瘟病毒石门(Shimen)株基因组RNA为模板,扩增E2和Erns抗原编码区序列,与组织纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽cDNA序列融合,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和ptPAs/△E2,以及使用E2信号肽构建pE2s/△E2/△Erns和pE2s/E2。转染PK15细胞,检测目的基因的表达。用所构建的重组质粒免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周,设pcDNA3.1(+)及PBS阴性对照,第叁次免疫2周后采血,分离血清。分别以原核表达并纯化的E2或Erns蛋白为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以纯化的E2或Erns蛋白为刺激原,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-y分泌情况。结果表明,除pcDNA3.1(+)和PBS对照组外,各重组质粒免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,与对照组相比差异显着(p<0.05)。融合tPA信号肽DNA疫苗免疫组的血清OD492nm值与E2信号肽DNA疫苗免疫组相比差异显着(P<0.05)。猪瘟病毒Shimen株或E2或Ems蛋白刺激后,嵌合E2和Erns基因DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-y和T细胞增殖效果高于单价DNA疫苗组(p<0.05),含有tPA信号肽组高于E2自然信号肽组,融合E2和Erns的ptPAs/△E2/△Erns和pE2s/△E2/△Erns组要优于只含有E2的单基因组。以上结果表明,在诱导免疫应答方面嵌合DNA疫苗要优于单价DNA疫苗,tPA信号肽组优于E2信号肽组。在小鼠实验的基础上,选取诱导免疫效果较好的ptPAs/△E2/△Erns免疫CSFV血清抗体阴性猪,pE2s/E2和pcDNA3.1(+)同时免疫作为对照,免疫3次,每次间隔2周,第叁次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFV Shimen强毒株经肌肉注射途径攻击。观察猪体临床症状,记录猪体体温。并分别在攻毒后第0、4、8、12天后采血分离血清,以及采集鼻拭子和频死猪组织样品。中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测猪瘟病毒在组织样品和血清样品中复制情况等。结果表明,嵌合DNA疫苗免疫后产生的血清中和抗体水平、白细胞数量明显高于非融合DNA疫苗,pcDNA3.1(+)对照组攻毒后实验猪全部死亡,pE2s/E2免疫组部分猪死亡,而ptPAs/△E2/△Erns免疫组全部猪存活,说明具有tPA信号肽的嵌合DNA疫苗ptPAs/△E2/△Erns具有针对猪瘟病毒完全的免疫保护效果,而E2信号肽单基因DNA疫苗pE2s/E2只具有针对猪瘟病毒部分的免疫保护。在此研究基础上,以p干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)作为分子佐剂和重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2同时免疫BALB/c雌性小鼠,免疫3次,每次间隔2周。第叁次免疫2周后采血分离血清,分别以原核表达E2或Erns为包被抗原,间接ELISA方法检测血清抗体水平；以猪瘟病毒Shimen株或刀豆蛋白A(ConcanavalinA, ConA)为刺激原,Elispot法检测IFN-γ分泌情况。结果表明,重组质粒ptPAs/△E2/△Erns或pE2s/E2与TRIF同时免疫后小鼠血清抗体水平持续上升,但与非佐剂组相比差异不显着(P>0.05)。猪瘟病毒Shimen株刺激后,TRIF和DNA疫苗共免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ数量明显高于非佐剂DNA疫苗组(p<0.05)。以上结果表明,TRIF共免疫可显着增强DNA疫苗诱导细胞免疫水平。以重组质粒ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF免疫CSFV血清抗体阴性猪,免疫3次,每次间隔2周,第叁次免疫2周后,以105TCID50剂量的CSFVShimen强毒株经肌肉注射途径攻击。分别于攻毒后第0、4、8、12天采血分离血清,中和试验检测血清中和抗体水平,间接ELISA检测血清抗体IgG水平,RT-PCR检测组织样品中CSFV分布、计算白细胞数量,观察猪体临床症状并记录猪体体温变化情况等。结果表明,ptPAs/△E2/△Erns和TRIF、pE2s/E2和TRIF共免疫DNA疫苗猪强毒攻毒后,白细胞数量明显高于非佐剂DNA疫苗,血清中和抗体水平与非佐剂组无明显差异,但DNA疫苗共免疫TRIF佐剂组猪只全部存活,说明TRIF能提高DNA疫苗的免疫效果,并诱导具有针对CSFV强毒株攻击的完全免疫保护。综上所述,本文首次构建了由CSFV主要抗原E2和Erns编码基因融合组成的抗猪瘟嵌合DNA疫苗,并对其在机体内诱导免疫效力进行了研究。在此基础上,研究了细胞通路信号分子TRIF共免疫对DNA疫苗免疫保护效果的影响。初步证实了抗猪瘟嵌合DNA疫苗可以诱导猪体增强的抵抗CSFV强毒株致死攻击的免疫保护,TRIF可显着提高DNA疫苗的细胞免疫应答和抗病毒作用,这些工作为新型抗猪瘟DNA疫苗的研制奠定了坚实的基础。
王海震[9]2005年在《猪瘟血清抗体检测试剂盒的研制与抗猪瘟病毒基因工程疫苗的研究》文中提出利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪瘟病毒石门株(CSFV Shimen strain)囊膜糖蛋白E2全基因,再以E2基因为模板扩增其中适于在E.coli中表达且抗原性较好的基因片段(E2蛋白A/D抗原区基因序列),将扩增的两片段依次插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建成重组质粒pET-E2和pET-2E2,将两质粒转化受体菌BL21(DE3),对转化重组菌用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行了优化,使目的蛋白得到高效表达。 应用His-bind树脂层析柱纯化重组2E2蛋白,纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定其纯化效果,并用Western-blot检验其特异性。在此基础上,利用重组2E2蛋白作包被抗原,优化反应条件后,建立了检测抗猪瘟病毒血清抗体的重组2E2蛋白—ELISA方法,应用该方法和间接血凝检测试剂盒对收集的120份血清进行检测,结果显示,间接ELISA方法与间接血凝检测方法相比具有更好的表现力。 本研究以猪IgG基因为模板,设计了一对引物,并应用PCR方法扩增出其中重链恒定区部分基因序列。将其克隆入pET-2E2中,构建成pET-2E2-scIgG重组质粒并对其进行诱导表达。取经纯化过的E2,2E2和2E2-scIgG重组蛋白分别免疫小白鼠,结果表明,叁种蛋白均可刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,2E2-scIgG蛋白的免疫效果明显优于另两种蛋白,并且在所选的抗原区域可能存在一个或多个T细胞表位。
韩雪清[10]2002年在《猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究》文中研究指明针对频繁出现的弱毒疫苗免疫失败现象和免疫猪群持续带毒等猪瘟(CSF)防制中的重大问题，本项研究从病毒的分子水平入手，试图从病毒分子变异水平以及当前流行毒的分子差异程度澄清原因，并针对CSF的持续感染研制出高效安全的基因工程标记疫苗和诊断试剂，为彻底消灭CSF提供科学依据和技术支撑。主要研究内容包括： 1．猪瘟病毒主要免疫原E2基因的序列分析：利用反转录PCR(RT-PCR)及套式PCR(nPCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株(C株)兔脾组织毒保护性抗原E2(gp55)基因，成功地将其克隆并测定核苷酸序列，与国内外已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因序列比较的结果是：C-株兔脾毒与C-株细胞(SK6)毒、C-株疫苗(犊牛睾丸细胞，CSFV-C)毒CSFV-SM株(石门)毒、Bresia株(荷兰)毒、Alfort株(德国)毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87％、98.34％、94.58％、91.00％、80.78％；氨基酸同源性分别为98.95％、97.37％、94.22％、91.60％、89.23％。对C-株兔脾毒与C-株细胞毒、经典强毒E2上的A、B、C叁个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较，其结果为：C-株兔脾毒与C-株疫苗细胞毒的差异很小甚至没有差异。 2．猪瘟病毒分子流行病学分析：利用RT-PCR及nPCR扩增并测定了我国近期(1997～2001年)12个省的51株流行野毒株的E2基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：C-株兔组织毒、C—株细胞毒和中国50～60年代流行的石门强毒株同属于组群1(Group 1)；近期猪瘟流行毒株均属于组群2(Group 2)的两个不同的亚组群(Subgroup2.1和2.2)，表明我国目前流行毒株至少有2个亚组群。流行毒株与疫苗毒株有较大的差异(E2全基因核苷酸序列同源性82.2％～84.3％)，表明猪瘟流行毒株已远离疫苗毒株的方向演变，明确了我国CSF流行趋势及我国CSFV在世界SCFV大系谱中的位置，并为基因工程疫苗的研究提供了基因储备。 3．猪瘟病毒E2基因的真核表达：分别将CSFV两个代表株的E2基因克隆入毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中，酶切线型化后电穿孔导入P.Pastotis进行整合，经G418筛选得到25个高拷贝转化子，经DNA斑点试验和DNA测序证明外源基因E2稳定地整合到P.Pastoris染色体中。经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE和Western blot结果证明了P.Pastoris培养上清液中含有正确糖基化的E2蛋白，表达量约250mg/L。重组P.Pastoris经连续培养8代仍可分泌特异性蛋白。免疫活性研究证明P.Pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生1：128～1：256猪瘟病毒的抗体。有望用于基因工程亚单位疫苗的研制。 4．猪瘟病毒E2基因的密码子改造优化：低利用率密码子的数量和分布是影响外源基因有效表达的参数之一，优化密码子序列能够提高外源基因的表达。利用PCR基础上的定点突变方法对猪瘟病毒E2基因的24个密码子进行优化。优化后的E2基因转化P.Pastoris菌，甲醇诱导表达。诱导培养上清的SDS-PAGE和Western blot分析显示，E2蛋白在P.Pastoris中得到了高效的表达，表达量约1.08g／L。这表明对E2基因上低利用密码子的改造是成功的， 猪瘟病毒EZ基因遗传变异及体外表达研究为进一步大规模生产打下了基础。5．毕赤酵母高效表达的培养条件探索：用PPastoris系统表达外源基因，对于不同的外源蛋白，表达量千差万别。除外源基因序列本身的内在特性起着很重要的作用外，表达条件对表达量高低的影响也极其显着。分别在不同时间、不同诱导型、不同pH、不同诱导剂量方面进行了较系统的对比：经不同时间表达，表明72小时蛋白可达峰值；采用抑制／诱导方式会提高表达量；表达EZ蛋白pH最佳值在7．5—8刀；最佳甲醇诱导量是2％～3％；得到了一套较完善的在PPastoris中表达CSFV EZ基因的条件，以供在规模化发酵罐中表达EZ基因蛋白生产亚单位疫茵。6．猪瘟病毒EZ基因的原核表达：PCR扩增出当前猪瘟流行野毒株，中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒EZ基因的主要抗原区，将其克隆到原核大肠杆菌表达载体PPROEX－HTb中诱导表达，经 SDS－PAGE检测表明，重组质粒能表达EZ基因主要区蛋白，Western blot检测表明，诱导表达蛋白与猪瘟阳性血清发生特异性反应，表达量为35％和38％，可用于基因工程诊断抗原。7．猪瘟病毒EZ基因的乳腺特异表达载体构建：将在乳腺细胞中特异分泌的信号肽序列连接到EZ基因，PCR得到了目的片段，再将pGFPCI载体上的Kana基因切下与在乳腺细胞中特异表达的P22载体连接，使其带有筛选标记，然后将带有信号肽的EZ插入到P22中，试图构建山羊乳腺上皮细胞的特异性表达载体。探索了构建的含目的基因的乳腺特异性表达载体调控成分的有效性，也为在体外培养的乳腺细胞中定位重组目的基因一体细胞克隆一动物乳腺生物反应器工作的开展作准备工作。
参考文献：
[1]. 猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因融合表达载体的构建及初步表达[D]. 郑小坚. 苏州大学. 2003
[2]. 猪瘟兔化弱毒编码E2囊膜糖蛋白A/D抗原区基因的原核表达和重组蛋白的初步应用[D]. 苏小运. 南京农业大学. 2003
[3]. 含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用[D]. 韩国全. 四川农业大学. 2009
[4]. 猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表达研究及其单克隆抗体的制备[D]. 刘瑞峰. 华中农业大学. 2008
[5]. 人工饲料育家蚕/杆状病毒表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因[J]. 郑小坚, 缪竞诚, 曹广力, 朱江, 顾全丰. 苏州大学学报(自然科学版). 2005
[6]. 猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备[D]. 李素. 吉林大学. 2007
[7]. 表达猪瘟病毒石门株E0/E2基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究[D]. 孙永科. 西北农林科技大学. 2007
[8]. 抗猪瘟嵌合DNA疫苗及TRIF的DNA疫苗佐剂效应研究[D]. 万超. 武汉大学. 2009
[9]. 猪瘟血清抗体检测试剂盒的研制与抗猪瘟病毒基因工程疫苗的研究[D]. 王海震. 南京农业大学. 2005
[10]. 猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究[D]. 韩雪清. 西北农林科技大学. 2002
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