茶花粉超氧化物歧化酶的分离提纯及表征

何晓红^[1]2004年在《茶花粉超氧化物歧化酶的分离提纯及表征》文中进行了进一步梳理超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC 1.15.1.1，简称SOD）是一种金属酶，在生物体内分布极广，是目前为止已知的二千多种酶中研究报道最多的酶。由于金属辅基的不同，它可分为四类，分别为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。SOD是一种重要的氧自由基清除剂，能催化超氧阴离子（O2-. ）的歧化反应，而且它的存在可能与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫性疾病和辐射防护等有关，故有广阔的开发及应用前景。本文综述了SOD的种类、分布、化学结构、理化性质、活性与含量的测定方法。本实验是称取500 g新鲜茶花粉，按1∶2(W/V)加入pH 7.8，25 mmol/L磷酸钾缓冲液(PBK)，加石英砂少许，冰浴中研磨成浆，于-70 ℃冰箱反复冻融叁次；4 ℃，10 000ｒ/min离心20 min，去沉淀和上层脂类物质，中层清液为SOD粗提液。0 ℃缓慢加入固体硫酸铵到粗提液中，至饱和度为35 %。4 ℃放置过夜，4 000ｒ/min离心20 min，收集上清液。在上清液中继续缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为55 %，4 ℃放置过夜；离心弃上清，沉淀用PBK溶解透析72 h获得粗酶液。将粗酶液上到已用PBK平衡好的DEAE-52离子交换柱（3.0×35 cm），用分别含0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L及0.5 mol/L NaCl的PBK进行分段洗脱，收集酶活力峰。透析除盐，冻干后用蒸馏水溶解，上Sephadex G-100分子筛层析柱（1.0×100 cm），用PBK洗脱，收集酶活力峰。将获得酶液冻干后用1.5 mol/L (NH4)2SO4溶解后上已用1.5 mol/L (NH4)2SO4平衡过的Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow疏水层析柱（1.5×15 cm），分别用0.75 mol/L (NH4)2SO4、0.1 mol/L (NH4)2SO4及蒸馏水进行分段洗脱，收集酶活力峰获得纯酶。共获得13943 U的纯酶，酶比活为4034.4 U/mg。将Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow纯化获得的SOD经透析、冻干后，进行等电聚焦电泳。纯化的SOD经等电聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）均显示一条蛋白带，表明纯化的SOD蛋白质是均一的。最后纯化倍数为81.8倍，活性回收率为27.6 ％。采用Folin酚法测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准蛋白。SOD活力测定采用邻苯叁酚自氧化法。酶活力单位定义为：25 ℃，在325 nm波长处，每分钟抑制邻苯叁酚自氧化速率达50 %所需酶量定义为一个酶活力单位。SDS-PAGE用考马斯亮蓝R 250进行染色，活性染色采用0.2 ％氮蓝四唑-0.01 ％核黄素光还原法。Cu/Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感，Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不敏感；而Fe-SOD对氰化物不敏感，对过氧化氢敏感。5 mmol/L的KCN抑制茶花花粉纯化的SOD活力达99 ％，5 mmol/L的H2O2完全抑制该酶的活力，根据不同类型SOD对不同抑制剂的敏感性不同判断其为Cu/Zn-SOD。利用凝胶的分子筛效应把物质按分子大小不同进行分离，采用Sephadex G-100凝胶过滤层析法测得其分子量为70.0 kD。采用的标准蛋白分别为核糖核酸酶A (13,700 Da)、胰凝乳蛋白酶原A (25,000 Da)、卵清蛋白(43,000 Da)、牛血清白蛋白(67,000 Da)、蓝葡聚糖 2000。经SDS-PAGE也测得其分子量为69.5 kD，亚基分子量为34.7 kD，是由相同亚基组成的二聚体。等电聚焦电泳：采用浓度为7 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳，1 %的载体两性电解质（pH梯度为3.5-10）。该酶在等电聚焦电泳中呈现一条酶蛋白带，其等电点为4.1。SOD分子稳定性实验：研究了pH、温度、化学试剂和金属离子对SOD活性的影响。结果表明，该酶的热稳定性比一般酶强，最适温度为25 ℃，最适pH为5.5，在pH 11以上迅速失活。由5 ％的EDTA对酶完全抑制，可判断金属离子在酶的活性中心起到关键作用。1 ％SDS、0.5 ％β巯基乙醇可使酶的亚基的解聚，导致酶活丧失。4 mol/L 尿素对酶的影响不大，与文献报道一致。这些结果进一步确定该酶为Cu/Zn-SOD。称取SOD纯品10 mg，用5.7 mol/L HCl于110℃ 水解24 h，用835-50氨基酸自动分析仪进行测定。同其它来源的SOD进行比较发现该酶具有显着特点：富含Trp、Phe、Tyr。二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）法测得其N-末端氨基酸为Gly。SOD的圆二色谱分析：用JASCO J 810圆二色谱仪进行测定，蛋白浓度为43.2 μg/ml。SOD的α螺旋度用圆二色谱222 nm处的椭圆率值以单值法进行计算，测得该蛋白的α螺旋含量为21.8 ％。用760 CRT型双光束紫外可见分光光度计进行全波长扫描，发现该酶的特征吸收峰在274 nm处。大多数SOD因不含有Trp，其特征吸收峰一般在258 nm左右，而花粉SOD紫外特征吸收峰红移至274 nm，推测可能与花粉SOD的Trp含量相关。而由于酸水解后蛋白质的Trp完全被破坏，因此Trp的含量进行单独测定。发现花粉SOD含有大量的Trp，而其它生物的SOD几乎不含Trp。由于花粉SOD与其它生物的SOD在Trp数量上的巨大差异，使得花粉SOD的荧光光谱成为其特征光谱。荧光光谱用770 CRT荧光分光光度计测定，激发波长为295 nm，激发波长狭峰宽度为2 nm，发射波长狭峰宽度为5 nm，测定波长范围为320-375 nm。用N-溴代琥珀亚胺（NBS）对SOD分子中的色氨酸残基进行了化学修饰，发现每个SOD分子有21个Trp残基，其中7个位于分子表面。Trp的发射荧光光谱的最大荧光强度在335 nm，NBS修饰花粉SOD后其修饰酶的荧光强度?

何晓红^[2]2007年在《茶花粉超氧化物歧化酶的分离提纯、表征及功能基团研究》文中提出从具有抗衰老特性的新鲜茶花粉中分离到超氧化物歧化酶(SOD)纯品，为SOD家族增添了新成员。本文对该SOD的分子量、所属类型、等电点、氨基酸组成、米氏常数、分子稳定性等方面进行了研究，发现该酶与其他SOD相比较具有一些共性，另又有自己的特性。首先，其分子量为69.5 kD的Cu／Zn-SOD尚未见报道；其次该蛋白富含Trp、Phe、Tyr，导致其吸收光谱红移至274nm；再则温度稳定性较一般SOD差，与其分子结构有关。它的这些研究结果对于揭示花粉抗衰老作用的机理在分子水平上提供了理论依据。本文还研究了该酶的N-末端，二级结构，并通过化学修饰法对其结构和功能进行了表征。结果发现该酶的α-螺旋较一般SOD高，His、Arg、Lys和羧基为茶花粉SOD的必需功能基团，Met、部分二硫键对保护酶的催化功能和维持酶的分子构象是必需的。这些研究结果为该蛋白的结构和功能提供新的信息。

参考文献：

[1]. 茶花粉超氧化物歧化酶的分离提纯及表征[D]. 何晓红. 吉林大学. 2004

[2]. 茶花粉超氧化物歧化酶的分离提纯、表征及功能基团研究[D]. 何晓红. 吉林大学. 2007

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