导读:本文包含了人脐血基质细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基质,细胞,血源,人参,实验组,白介素,白血。
人脐血基质细胞论文文献综述
刘颖,易龙,王亚平[1]（2018）在《Akt-FoxO3a通路在人参皂苷Rg1抑制t-BHP诱导的人脐血源基质细胞凋亡中的作用研究》一文中研究指出目的探讨人参皂苷Rg1对t-BHP诱导氧化损伤的人脐血源基质细胞(hUCB-DSCs)活力、增殖与凋亡的影响,以及Akt-FoxO3a信号通路在Rg1发挥抗凋亡效应中的作用。方法t-BHP诱导hUCB-DSCs构建氧化损伤模型,CCK-8法、流式细胞技术、Western blot等方法检测细胞活力、增殖、凋亡率以及凋亡调节蛋白(Bim、Bax和Bcl-2)的表达。采用PI3K抑制剂LY294002预处理细胞,Western blot法检测Akt和FoxO3a磷酸化水平、FoxO3a在胞核/质表达水平的改变。结果 Rg1浓度依赖的抑制t-BHP诱导的hUCB-DSCs活力下降,并促进细胞增殖;Rg1还通过降低促凋亡蛋白Bim和Bax的表达和提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来发挥抗凋亡作用。分子机制方面,Rg1磷酸化Akt-FoxO3a通路,促使FoxO3a由胞核向胞质转位并失活,导致对下游靶分子Bim的表达下调,而采用PI3K抑制剂LY294002能抑制这一作用。结论 Rg1对于t-BHP诱导氧化损伤的hUCB-DSCs具有促存活和抑凋亡的保护效应,该作用可能与Akt-FoxO3a信号通路密切相关。(本文来源于《第十叁届中国西部营养与健康高峰论坛论文集》期刊2018-10-26）
刘颖[2]（2017）在《人参皂苷Rg1调控FoxO3a相关信号通路抑制人脐血源基质细胞氧化应激损伤的研究》一文中研究指出造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是支持和调节造血干细胞(haemopoietic stem cells,HSCs)生长发育的内环境,其结构和功能的完整是维系正常造血功能的重要因素。基质细胞作为HIM的核心组分,不仅通过形成HSCs生长发育的“龛”、分泌造血因子和细胞外基质等方式支持和调控HSCs自我更新与分化,还与多种血液系统疾病的发生、发展和预后密切相关。本课题组长期从事人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,h UCBDSCs)及脐血造血微环境的研究。我们的前期体外研究证实h UCBDSCs具有造血基质细胞的基本生物学特征,能有效支持脐血CD34+细胞数量扩增;动物实验也表明,h UCBDSCs与造血细胞联合移植于辐照后裸鼠体内具有促进造血重建、修复受损微环境和减轻移植物抗宿主病(GVHD,graft-versus-host disease)的多重效应。然而随着研究的深入,我们发现h UCBDSCs存在移植后存活状况差和植入效率较低等问题,分析主要原因可能是在体外培养和体内输注过程中会面临营养缺乏、炎症反应和氧化应激等多种不良因素刺激。这些因素导致胞内自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量增加,细胞结构破坏和功能失调,进而造成细胞衰老、死亡或凋亡。线粒体是细胞内ROS的主要来源,也是最先被攻击的细胞器。线粒体ROS(mitochondrial ROS,mt ROS)的稳态调节是维系线粒体和细胞正常功能的关键所在。线粒体氧化应激,即mt ROS的产生与抗氧化防御之间的不平衡,将导致线粒体功能障碍及一系列相关疾病。为确保h UCBDSCs活力和移植疗效,研究如何提高细胞内源性抗氧化保护功能和维持mt ROS稳态调节的有效途径具有重要的理论价值和应用前景意义。人参是中医临床“补气要药”,已有数千年的临床用药历史。现代医学研究认为,人参皂苷是人参中主要的药理学活性成分,有多达几十种皂苷,人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,G-Rg1)是其中最重要的单体皂苷成分之一。本课题组和其他学者的研究证实,人参皂苷Rg1在抗肿瘤、抗炎症、抗衰老、抗糖尿病、抗神经原退化和促干/祖细胞增殖等方面有广泛药理学作用。近年来研究还发现,人参皂苷Rg1具有拮抗氧化致衰剂对多种器官和细胞的氧化损伤与促细胞凋亡作用,提示人参皂苷Rg1是人参中重要的抗氧化皂苷。课题组既往研究证明,人参皂苷Rg1不仅能促进骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)增殖分化与造血生长因子分泌,还能通过增强其在D-半乳糖诱导的应激条件下的抗氧化和抗炎能力以延缓细胞衰老。然而,人参皂苷Rg1是否对于氧化应激诱导的h UCBDSCs损伤与凋亡发挥一定的保护作用以及可能的分子机制尚未见相关报道。目的:在本研究中,我们体外分离、培养和扩增h UCBDSCs,并采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)损伤h UCBDSCs构建氧化应激损伤细胞模型,研究人参皂苷Rg1拮抗h UCBDSCs氧化损伤、促进细胞存活、抑制凋亡以及维持线粒体ROS稳态的重要作用,深入探索转录调控因子叉头框蛋白O3a(Fokhead box O3a,Fox O3a)介导的相关信号通路在人参皂苷Rg1发挥这些效应中的作用。旨在为阐释人参皂苷Rg1抗氧化效应的现代分子生物学机制提供新的理论依据;为提高h UCBDSCs临床移植治疗效果提供新的辅助手段。方法:1.体外分离、培养和扩增h UCBDSCs,采用t-BHP处理细胞构建氧化应激损伤体外模型。分别以不同浓度人参皂苷Rg1处理损伤后的h UCBDSCs,CCK-8法检测人参皂苷Rg1对h UCBDSCs细胞活力、细胞增殖的影响,在倒置相差显微镜下观察成纤维细胞集落形成单位(colony-forming unit of fibroblast,CFU-F)的形成。以试剂盒分别检测氧化应激相关指标,包括丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力。2.采用不同浓度人参皂苷Rg1分别处理t-BHP诱导的h UCBDSCs,流式细胞术检测细胞凋亡率,阐明人参皂苷Rg1对细胞凋亡的影响。Western blot法检测人参皂苷Rg1对t-BHP诱导的h UCBDSCs凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bim、Bax和Bcl-2)表达水平的影响。Western blot法检测Akt-Fox O3a信号通路在人参皂苷Rg1下调Bim蛋白表达水平中的作用,Western blot法检测人参皂苷Rg1对Fox O3a在h UCBDSCs中胞核/质转位的调节作用。3.采用不同浓度人参皂苷Rg1处理t-BHP诱导的h UCBDSCs,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)分别检测人参皂苷Rg1对总ROS和mt ROS生成的影响,利用LSCM检测人参皂苷Rg1对t-BHP诱导的h UCBDSCs线粒体膜电位(MMP,mitochondrial membrane potential)的影响。以试剂盒检测人参皂苷Rg1对锰超氧化物岐化酶(Mn-SOD)和过氧化氢酶(Catalase)活力的影响。采用CCK-8法、LSCM和相应试剂盒检测等方法明确Sirt1在人参皂苷Rg1阻抑线粒体氧化损伤中的作用,Western blot法检测AMPK-Sirt1信号通路在人参皂苷Rg1上调Fox O3a去乙酰化水平中的作用。结果:1.成功构建t-BHP诱导h UCBDSCs的氧化应激损伤体外模型研究发现,不同浓度t-BHP损伤h UCBDSCs后,细胞存活率随t-BHP浓度的增加而逐渐降低。在t-BHP浓度(80μM)处理细胞6 h时,细胞存活率降至(52±3.10)%,即IC50约为80μM。根据上述实验结果,以80μM剂量t-BHP处理细胞6 h的方法构建t-BHP诱导h UCBDSCs的氧化应激损伤体外模型。2.人参皂苷Rg1抑制t-BHP诱导的h UCBDSCs损伤和凋亡(1)在本研究涉及的浓度范围内,人参皂苷Rg1能浓度依赖的抑制t-BHP诱导h UCBDSCs的活力下降,当人参皂苷Rg1浓度为0.1、1、10和50μM时作用最为显着。人参皂苷Rg1(50μM)还对t-BHP诱导的细胞增殖下降和CFU-F形成减少具有明显的恢复作用,且对于正常h UCBDSCs也具有一定促增殖作用。(2)t-BHP损伤h UCBDSCs后MDA含量和LDH酶活性显着上升,而SOD酶活性明显降低。不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理均能显着降低MDA和LDH水平;当浓度为10μM和50μM时人参皂苷Rg1还能明显提高SOD的酶活性。(3)t-BHP损伤h UCBDSCs后凋亡率较正常组显着增加,而不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理均能够有效抑制t-BHP诱导的h UCBDSCs凋亡。人参皂苷Rg1(50μM)还能显着抑制促凋亡蛋白酶Caspase-3的活化、降低促凋亡蛋白Bim和Bax的表达及提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。3.Akt-Fox O3a-Bim信号通路在人参皂苷Rg1抑制凋亡中的作用人参皂苷Rg1(50μM)能激活Akt和Fox O3a磷酸化,促进Fox O3a由胞核向胞质转位,这一改变抑制了Fox O3a对下游凋亡诱导基因Bim的表达调控,进而下调了促凋亡蛋白Bim和Bax的表达,并上调了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。而人参皂苷Rg1作用能被PI3K抑制剂LY29004所抑制,提示Akt-Fox O3-Bim信号通路在人参皂苷Rg1阻抑t-BHP诱导h UCBDSCs的凋亡中发挥重要作用。4.人参皂苷Rg1减轻t-BHP诱导的线粒体氧化损伤(1)激光扫描共聚焦显微镜检测发现,t-BHP损伤h UCBDSCs后DCFH-DA荧光强度较正常对照组明显升高,提示胞内总ROS水平上升。不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理细胞后总ROS水平随着人参皂苷Rg1浓度增加而逐渐下降,表明人参皂苷Rg1能抑制t-BHP诱导的胞内活性氧水平提升。(2)激光扫描共聚焦显微镜检测发现,t-BHP损伤h UCBDSCs后Mito SOX Red红色荧光变强,线粒体O2·-水平明显升高。人参皂苷Rg1浓度依赖的抑制t-BHP诱导的线粒体O2·-增加,当其浓度为10μM和50μM时,O2·-水平显着低于t-BHP单处理组,提示人参皂苷Rg1具有降低线粒体活性氧水平的作用。(3)激光扫描共聚焦显微镜观察JC-1探针标记的h UCBDSCs,并采用红/绿色荧光强度的比值代表线粒体膜电位(Δψm)。结果表明,与正常对照组比较,t-BHP处理细胞后Δψm明显降低。不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理细胞后Δψm随人参皂苷Rg1浓度增加而逐渐增加,提示人参皂苷Rg1能抑制t-BHP诱导的h UCBDSCs线粒体膜电位丢失。(4)t-BHP损伤h UCBDSCs后导致Mn-SOD和Catalase的酶活力下降,而人参皂苷Rg1处理能浓度依赖的提高这两种线粒体抗氧化酶的活力。当人参皂苷Rg1浓度为10μM和50μM时,Mn-SOD酶活力水平显着高于t-BHP单处理组;人参皂苷Rg1浓度为1、10和50μM时,Catalase酶活力较t-BHP单处理组有显着提高。结果提示人参皂苷Rg1可通过提高Mn-SOD和Catalase酶活力发挥线粒体抗氧化作用。5.AMPK-Sirt1-Fox O3a信号通路在人参皂苷Rg1调控线粒体活性氧水平中的作用(1)人参皂苷Rg1(50μM)能显着提高t-BHP诱导的h UCBDSCs细胞Sirt1的表达水平,且对于正常细胞Sirt1的表达也有促进作用。使用Sirt1的si RNA干扰后,人参皂苷Rg1对线粒体O2·-生成的抑制作用被明显减弱,Mn-SOD和Catalase酶活性降低,细胞活力也随之下降,提示Sirt1活化对于人参皂苷Rg1发挥线粒体抗氧化作用是必要的。(2)t-BHP损伤h UCBDSCs后磷酸化的AMPK、Sirt1表达及去乙酰化的Fox O3a表达水平均明显降低。与t-BHP处理组比较,人参皂苷Rg1(50μM)能显着促进AMPK磷酸化激活和上调Sirt1表达水平,进而提高Fox O3a去乙酰化水平。分别利用AMPK si RNA和Sirt1 si RNA干扰处理后,人参皂苷Rg1这一系列效应被抑制,表明人参皂苷Rg1能够通过激活AMPK-Sirt1信号通路促进Fox O3a去乙酰化,进而上调Fox O3a介导的Mn-SOD和Catalase两种酶的表达,发挥线粒体活性氧清除作用。结论:1.人参皂甙Rg1能够促进t-BHP诱导h UCBDSCs的存活、提高增殖能力,并通过调控Akt-Fox O3a-Bim信号通路在抑制细胞凋亡过程中发挥重要作用。2.人参皂苷Rg1通过清除过多mt ROS来保护h UCBDSCs免受t-BHP诱导的线粒体氧化损伤,而这一效应主要受到AMPK-Sirt1-Fox O3a信号通路的调控。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2017-05-01）
张诚,郝磊,张曦,高蕾,高力[3]（2014）在《人脐血源基质细胞的免疫调控》一文中研究指出目的探讨人脐血源基质细胞(hUCBDSC)的免疫调节作用。方法采用hUCBDSC与小鼠脾脏细胞共培养,检测淋巴细胞的增殖,细胞亚群、粘附分子和细胞因子的表达变化。构建小鼠HLA半相合骨髓造血干细胞移植GVHD模型,观察h UCBDSC在调节GVHD作用及相关机制。结果 h UCBDSCs具有促进混合淋巴细胞培养体系中的淋巴细胞增殖的作用并明显增加混合淋巴细胞培养体系中淋巴细胞S期和G2/M期的比例(P<0.05);h UCBDSCs促进CD49b NK细胞、降低CD3 T细胞和粘附分子CD49d(VLA-4)的表达;h UCBDSCs促进IL-4、降低IFN-γ表达;进一步研究发现,h UCBDSC不引起小鼠T细胞的增殖,相反以剂量依赖性方式抑制PHA或DC刺激的T细胞增殖;h UCBDSC阻止T细胞从G1期进入S期,CD4+Treg的产生,Th1/Th2的比例下。h UCBDSCs明显降低小鼠的死亡率,延长其生存期;组织病理学评分及GVHD临床积分均显示联合h UCBDSCs移植组小鼠GVHD发生程度明显低于单纯BMT组(P<0.05);联合h UCBDSCs移植明显促进受体小鼠外周血中IL-4表达,抑制IFN-γ表达(P<0.05);联合h UCBDSCs移植增加受体小鼠脾脏CD49b NK细胞、降低CD3 T细胞及粘附分子CD49d的表达(P<0.05);联合h UCBDSCs移植明显降低GVHD靶器官粘附分子CD49d(VLA-4)的表达(P<0.05)。UCBDSC输注组受鼠脾脏CD4+Treg比例增高、Th1/Th2亚群比值降低、DC表面免疫分子的表达降(P<0.05)。h UCBDSCs主要在骨髓、免疫器官脾脏及皮肤、肝脏及小肠等GVHD主要靶器官中持续表达。结论 h UCBDSCs移植后主要迁移到骨髓、脾脏及GVHD的主要靶器官;h UCBDSCs具有减轻GVHD的作用;h UCBDSCs通过刺激NK细胞、抑制T细胞增殖,增强IL-4、降低IFN-γ细胞因子的表达及降低粘附分子CD49d(VLA-4)的表达、增高CD4+Treg比例、降低Th1/Th2亚群比值及DC表面免疫分子的表达减轻GVHD。(本文来源于《第四届全国血液肿瘤学术大会暨第七届全国淋巴肿瘤诊治进展研讨会论文汇编》期刊2014-10-23）
刘珊珊,张诚,陈幸华,龚奕,张曦[4]（2014）在《人脐血源基质细胞对HLA半相合外周血造血干细胞移植小鼠GVHD的调节作用》一文中研究指出目的探讨人脐血源基质细胞(h UCBDSC)对小鼠HLA半相合外周血造血干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响及其可能机制。方法构建小鼠HLA半相合外周血造血干细胞移植GVHD模型,观察联合h UCBDSC移植组和单纯移植组小鼠的生存率,临床表现,绘制KaplanMeier生存曲线;移植后7、14、21、28 d对小鼠皮肤、肝脏和小肠进行病理检测并行GVHD评分;流式细胞术分析移植后7、14、21、28 d小鼠脾脏中NK细胞的比例,Th1/Th2细胞比值。结果和对照组相比,实验组的GVHD临床表现明显减轻(P<0.05);Kaplan-Meier生存曲线显示实验组的生存率明显高于对照组(P<0.05);病理切片HE染色结果显示实验组的病理GVHD评分显着低于对照组(P<0.05);流式细胞术检测联合h UCBDSCs移植实验组NK细胞的阳性率显着高于对照组(P<0.05),Th1/Th2细胞比值显着低于对照组(P<0.05)。结论 h UCBDSC可能通过提高NK细胞的比例、减低Th1/Th2比值减轻HLA半相合外周血造血干细胞移植小鼠GVHD临床表现和病理变化,提高小鼠生存率。(本文来源于《第四届全国血液肿瘤学术大会暨第七届全国淋巴肿瘤诊治进展研讨会论文汇编》期刊2014-10-23）
陈果,王买红,杨世杰,陈幸华,张曦[5]（2014）在《人脐血源基质细胞对白血病及淋巴细胞的作用研究》一文中研究指出目的探讨人脐血源基质细胞(h UCBDSC)对白血病淋巴细胞影响以及其可能机制的研究。方法将h UCBDSC与淋巴细胞及白血病细胞共培养,构建小鼠外周血造血干细胞移植模型;测定体外共培养白血病细胞和淋巴细胞的凋亡、增值、周期以及淋巴细胞比例,测定联合h UCBDSC移植组和单纯移植组小鼠的淋巴细胞的比例,观察联合h UCBDSC移植组和单纯移植组小鼠的生存率,临床表现,绘制Kaplan-Meier生存曲线。结果 1和对照组相比,与h UCBDSC共培养后白血病细胞株SUP-B15与Jurkat细胞凋亡率升高(P<0.05),增值减慢(P<0.05);2和对照组相比,与h UCBDSC共培养后人淋巴细胞增值加快,CD4+细胞比例增加。3和对照组相比,移植实验组的CD4+细胞比例增加。小鼠生存周期延长,Kaplan-Meier生存曲线显示实验组的生存率明显高于对照组(P<0.05)。结论 h UCBDSC可能通过促进淋巴细胞的增值,增强机体免疫功能,从而抑制白血病细胞的生长,促进白血病的缓解,提高小鼠生存率。(本文来源于《第四届全国血液肿瘤学术大会暨第七届全国淋巴肿瘤诊治进展研讨会论文汇编》期刊2014-10-23）
高力,张诚,张曦,高蕾,郝磊[6]（2014）在《人脐血源基质细胞抑制骨髓瘤细胞增殖和凋亡》一文中研究指出目的前期我们分离和培养了人脐血源基质细胞并发现其能抑制骨髓瘤KM3细胞的增殖并诱导其凋亡。为研究人脐血源基质细胞抑制骨髓瘤的机制,我们将KM3细胞与人脐血源基质细胞共培养。方法 KM3单独培养,KM3与骨髓瘤骨髓基质细胞共培养(KM3/MM-BMSCs),KM3与人脐血源基质细胞共培养(KM3/h UCBDSCs)。在不同培养条件下,ELISA法检测IL-6和s IL-6R。激光共聚焦检测KM3细胞的m IL-6R,ICAM-1,Bcl-2和Bcl-XL的表达及NF-κB的定位。流式细胞仪检测m IL-6R和ICAM-1,Westernblot法检测Bcl-2,Bcl-XL和IκB的表达。实时定量PCR检测IL-6R,ICAM-1,Bcl-2和Bcl-XL的m RNA水平。EMSA法检测NF-κB活性。结果人脐血源基质细胞抑制KM3细胞s IL-6R和m IL-6R的表达,而且IL-6R m RNA的水平也减低。人脐血源基质细胞抑制NF-κB p65在细胞核的转位及活性,并下调NF-κB调节蛋白的表达。结论人脐血源基质细胞通过下调IL-6R的表达和抑制NF-κB活性从而抑制了KM3的增殖并诱导其凋亡。(本文来源于《第四届全国血液肿瘤学术大会暨第七届全国淋巴肿瘤诊治进展研讨会论文汇编》期刊2014-10-23）
王买红[7]（2014）在《Cx43修饰的人脐血源基质细胞对人外周血淋巴细胞调节作用的体外研究》一文中研究指出目的：我们关于人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived cells，hUCBDSCs）的前期研究表明，hUCBDSC具有免疫调控作用，不仅在抑制异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）上发挥重要作用，亦能参与诱导免疫耐受[1][2][3]。但其具体机制及其在免疫系统中如何发挥调控作用有待进一步研究。连接蛋白（connexin，Cx）及其介导的缝隙连接细胞间通讯(gap junctionintercellular communication,GJIC)亦在骨髓基质调控淋巴细胞发育中发挥重要作用，如影响淋巴细胞的抗体分泌，细胞因子产生，白细胞的迁移等。Cx43广泛表达于骨髓、胸腺、脾脏以及其他淋巴组织，是参与造血调控的必要条件[4][5][6][7][8][9][10]。本室前期研究亦表明，骨髓基质细胞（human bone marrow stromal cells, BMSCs）主要表达Cx43，通过增强骨髓基质细胞Cx43的表达能够对白血病细胞产生阻抑作用[11]。因此，我们在前期课题研究的基础上提出设想，增强hUCBDSCs的Cx43表达是否可以通过调节淋巴细胞功能而增强免疫调控功能呢？本实验通过观察转染Ad-GFP或转染Ad-Cx43-GFP的hUCBDSCs与外周血淋巴细胞共培养，观察其对人外周血淋巴细胞（lymphocyte）增殖、周期、凋亡，及其细胞因子分泌、CD4+CD25+T细胞比例的影响，从改善造血微环境GJIC功能角度这一新的角度探讨其对免疫细胞的调节作用。研究内容和方法：1.采集健康产妇足月妊娠顺产的脐带血，使用本室前期构建的稳定扩增体系培养hUCBDSCs。（6%明胶沉淀脐血红细胞，Percoll密度梯度离心分离，改良Dexter基质细胞培养体系）。采用ficoll密度梯度离心法从粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulating factor，G-CSF）动员后的外周血单个核细胞中分离出淋巴细胞，用倒置显微镜观察hUCBDSCs、淋巴细胞生长状况。2. Ad-Cx43-GFP转染hUCBDSCs48小时后，免疫荧光、RT-PCR及Western Blot检测转染前后hUCBDSCs细胞Cx43蛋白及mRNA的表达情况，荧光淬灭法观察转染后GJIC功能改变。3.体外将转染Ad-Cx43-GFP或未转染的hUCBDSCs与血细胞分离机采集的外周血单个核细胞并用Ficoll密度梯度离心法分离出的淋巴细胞进行共培养，共培养48h后，采用CCK-8检测Cx43修饰的hUCBDSCs对淋巴细胞增殖作用的影响；采用流式细胞仪检测淋巴细胞周期、凋亡。4.流式细胞术分选CD4+T、CD8+T细胞，将转染Ad-Cx4-GFP的hUCBDSCs分别与淋巴细胞及分选后的CD4+T、CD+8细胞共培养72小时后，收集共培养中上清液，ELISA法检测IL-4和IFN-γ分泌水平。5.共培养72小时后，收集悬浮淋巴细胞，加入荧光抗体CD4-PE，CD25-Alex Flour647染色，流式检测CD4+CD25+Treg细胞比例。研究结果：1.体外成功培养hUCBDSCs。普通倒置显微镜下观察原代培养的hUCBDSCs呈多形性，有圆形，纺锤形甚至成不规则形。培养24天左右传代。传代后细胞形态较均一，多为纺锤形。2.重组腺病毒载体Ad-Cx43-GFP能够成功转染hUCBDSCs，用滴度为100MOI的腺病毒载体转染hUCBDSCs后24h即可见到免疫荧光，转染48h后的转染效率为85±3.2%(1ul/孔)。转染Ad-Cx43-GFP的Cx43mRNA及蛋白的表达较未转染组及转染Ad-GFP组明显增强；转染后的GJIC功能亦较未转染组或转染Ad-GFP组增强。3.转染CX43后的hUCBDSCs呈现双向调控外周血淋巴细胞的增殖作用，其促进或抑制增殖作用与hUCBDSCs与淋巴细胞共培养比例有关。4.当hUCBDSCs与淋巴细胞以1:8共培养时，在PHA刺激下能够促进S+G2/M期细胞比例，而当hUCBDSCs与淋巴细胞以1：4共培养时，能够促进淋巴细胞的凋亡。5.共培养后，Cx43修饰的hUCBDSCs能增加淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞比例。转染Cx43组HUCBDSCs分泌IL-4较转染Ad-GFP组增加，而IFN-γ分泌受到抑制。结论：1. Ad-Cx43-GFP能够成功转染hUCBDSCs并增强GJIC功能，成功构建了体外hUCBDSCs与淋巴细胞共培养体系；2.转染Cx43后的hUCBDSCs对淋巴细胞的增殖呈现双向调控作用，与hUCBSCs与淋巴细胞共培养比例有关；3. Cx43转染的hUCBDSCs通过增加IL-4,抑制IFN-γ分泌，增加共培养中淋巴细胞CD4+CD25+T细胞数量参与免疫调控。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2014-05-01）
刘珊珊[8]（2014）在《人脐血基质细胞对小鼠单倍体相合外周血干细胞移植GVHD调节作用》一文中研究指出研究背景：异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT）是恶性及非恶性造血功能紊乱、某些免疫缺陷性疾病、自身免疫性、遗传代谢性疾病等的有效治疗手段[1]。过去的20年里，Allo-HSCT的临床应用发生了巨大变化，由原先的比较单一的人白细胞抗原（humanleucocyte antigen，HLA）相合的同胞间的清髓移植转向一个更为复杂的领域，尤其在HLA半相合移植方面取得了重要进展，这一全新的移植方式有效解决了既往供者来源紧缺、配型困难问题，使得90%以上的患者可以在父母、子女、兄弟姐妹等亲缘关系中找到合适供者[2]。近来，针对HLA半相合造血干细胞移植方式提出了很多新的策略[3]。经处理或者不经处理的骨髓（bone marrow，BM）联合或者不联合外周血干细胞（peripheral bloodstem cell，PBSCs），成为临床上最常见的干细胞来源[3][4]。然而，骨髓采集物中含有大量红细胞，当供受者血型不合时，进行移植之前需要去除骨髓中的红细胞或者血浆。此外，骨髓采集为有创操作，采集过程中需要实施麻醉，增加了供者的痛苦和风险。PBSCs采集方便，有效避免了上述骨髓移植带来的问题。外周血来源的移植物不仅具有丰富的CD34+细胞可大大提高植入率，且采集物比较干净，受红细胞影响小。然而，外周血中含有丰富的成熟T细胞，约为骨髓的5-10倍，大大增加了移植后GVHD的发生[5]。我们实验室前期工作中发现一种来源于人脐血的基质细胞，称为人脐血源基质细胞（hUCBDSCs），hUCBDSCs可以在多种因子特定组合下实现体外的增殖扩增[6]。同时，hUCBDSCs表面高表达HLA-I分子，HLA-II类分子及其他共刺激分子表达较少，具有较低的免疫原性[7]。体外实验发现其具有抑制异种T细胞增殖的功能，动物实验证实hUCBDSCs具有减低小鼠MHC半相合骨髓造血干细胞移植后GVHD的能力[8][9]。本研究旨在探讨hUCBDSCs对于小鼠MHC半相合PBSCT后GVHD的调节作用。一．研究内容及方法1.参照科室常规方法，使用6%明胶联合1.077g/LPercoll分离hUCBDSCs，特定的细胞因子组合下进行细胞体外培养扩增[8]；2.雌性C57BL/6×BALB/c F1受鼠接受7.0Gy60Coγ射线照射后，经尾静脉输注雄性供鼠C57BL/6来源的外周血单个核细胞（MNC）(1×106/只)、脾脏细胞(1×107/只)，构建小鼠MHC半相合外周血干细胞移植后GVHD模型；3.将体外培养扩增的hUCBDSCs（1×106/只）经尾静脉输注到已构建的MHC半相合外周血造血干细胞移植GVHD模型上，从小鼠生存率、临床表现、靶器官（肝脏、小肠、皮肤）病理解剖评定各组小鼠GVHD发生情况；4.流式细胞仪检测移植后不同时间点（1周、2周、3周、4周）各组小鼠脾脏NK细胞比例，以及移植后3周小鼠脾脏Th1、Th2细胞比例，初步探索hUCBDSCs调节MHC半相合外周血造血干细胞移植后GVHD的作用机制。二．主要研究结果1.按照科室既往的方法，成功实现hUCBDSCs的体外培养扩增。2.通过小鼠生存率、临床表现、靶器官病理表现及嵌合率的检测证明MHC半相合外周血造血干细胞移植GVHD模型构建成功。3. hUCBDSCs可显着延长移植后实验组小鼠生存时间，降低死亡率（P<0.05）；hUCBDSCs可显着降低移植后多个时相点实验组小鼠临床表现及靶器官组织病理GVHD评分（P<0.05），提示联合hUCBDSCs输注可有效减轻小鼠MHC半相合PBSCT后GVHD反应.4. hUCBDSCs可显着增加移植后实验组小鼠脾脏NK细胞、Th2细胞比例（P<0.05），减低移植后Th1细胞比例（P<0.05）。叁．主要结论1. hUCBDSC可显着减轻小鼠MHC半相合PBSCT后GVHD；2. hUCBDSCs可能通过增加移植后小鼠脾脏NK细胞、Th2细胞比例同时减低Th1细胞比例来减轻小鼠MHC半相合PBSCT后GVHD。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2014-05-01）
陈果[9]（2014）在《Cx43修饰人脐血源基质细胞对SUP-B15细胞体外调节作用的研究》一文中研究指出造血微环境(hemopoietic microenvironment；HME)是孕育和调控造血干/祖细胞生长发育的“土壤”，骨髓基质细胞是其主要功能成分。白血病细胞的生长同样依赖造血微环境的调控和支撑；骨髓基质细胞(bone marrow stroma cells, BMSCs)对白血病细胞所产生的支持和“庇护”作用是白血病残留、耐药进而难治的重要因素。已有多项研究表明，白血病微小残留病(Minimal residual Disease/leukemia，MRD/MRL)是导致白血病临床难以治愈、易复发的重要原因，而异常的造血微环境为残留白血病细胞的生存提供了条件，因此，探索造血微环境对急性白血病的调节作用，从新的角度寻求清除白血病的新方法和新靶点具有重要意义。造血微环境主要由骨髓基质细胞、细胞外基质和细胞因子构成，骨髓基质细胞是其主要成分。目前，有关造血微环境对白血病细胞的调控作用，国内外的研究多侧重在白血病骨髓基质细胞粘附、分泌等功能变化对白血病细胞的影响方面,而对白血病骨髓基质间隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)功能方面研究甚少。研究表明：正常造血的调控依赖于骨髓基质细胞间信号分子的传递，其中，间隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)被认为是骨髓基质参与造血调控的必要条件。在人类造血组织中参与骨髓基质细胞GJIC功能调控的主要为连接蛋白43(connexin43, Cx43)。我们既往的研究发现：急性白血病患者骨髓基质细胞GJIC功能降低，上调骨髓基质细胞Cx43表达可增强GJIC功能，在体外共培养体系中能够促进白血病细胞株Jurkat细胞的凋亡，抑制其增殖。我们前期的研究工作还发现：人脐血源基质细胞(human Umbilical Cord Blood-derived Stem Cells，hUCBDSCs)具有优于骨髓基质细胞的造血损伤修复作用，同时在体外试验中发现其具有抑制白血病细胞增殖的作用，具有良好的临床应用前景。那么，在我们前期工作的基础上将GJIC功能和人脐血源基质细胞结合起来是否对白血病细胞具有更强的调节抑制作用呢？这是我们本课题设想的起因。Ph+急性淋巴细胞白血病(Ph+Acute Lymphocytical Leukemia，Ph+ALL)临床疗效差，即使治疗后完全缓解，仍有较高的短期内复发率。那么，能否从造血微环境角度探索治疗此类白血病的新方法呢？鉴于此，本课题在前期研究基础上，分离培养hUCBDSCs，用Cx43基因的重组腺病毒转染hUCBDSCs形成饲养层与Ph+ALL细胞株SUP-B15共培养，通过上调其Cx43的表达增强GJIC功能，在体外条件下观察hUCBDSCs对SUP-B15细胞的调节作用。1.研究内容及方法：建立hUCBDCSCs与SUP-B15细胞株体外共培养模型沿用本科室改良的方法从健康产妇脐带血中分离培养hUCBDSCs。SUP-B15培养方法参照细胞株购买说明。倒置显微镜及扫描电镜对细胞接触共培养进行形态学观察。摸索适宜的共培养条件。Cx43重组腺病毒(Ad-Cx43-GFP)转染hUCBDSCs用PCR法检测目的基因RNA的表达，用免疫荧光法检测Cx43蛋白的表达。荧光漂白再恢复技术(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP)检测hUCBDSCs转染前后GJIC功能。观察Cx43基因转染前后hUCBDSCs对SUP-B15细胞的调节作用实验分4组：1) SUP-B15组：单独培养的SUP-B15组；2) hUCBDSCs/SUP-B15组：人脐血源基质细胞与SUP-B15共培养组；3) Ad-hUCBDSCs/SUP-B15组：Ad-GFP转染的hUCBDSCs与SUP-B15细胞共培养组；4) Ad-Cx43-hUCBDSCs/SUP-B15组： Ad-Cx43-GFP转染的hUCBDSCs与SUP-B15细胞共培养组。CCK-8法检测共培养后的SUP-B15细胞生长曲线，对比各组间SUP-B15细胞增殖率。流式细胞技术检测共培养后SUP-B15细胞凋亡率及细胞周期，从而探讨Cx43基因表达水平上调、GJIC功能增强的hUCBDSCs在体外共培养条件下对SUP-B15细胞的增殖产生的影响。2.实验结果：2.1以含20%胎牛血清的IMDM培养基为培养液可实现两种细胞的体外接触共培养，扫描电镜见两者间相互粘附，有伪足形成。共培养第3天，光镜下可见悬浮细胞明显的成团聚集趋势，折光度较单独培养组稍差；2.2采用重组腺病毒Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP成功转染hUCBDSCs：转染后24h可以观察到绿色荧光表达，48h荧光表达达峰值，转染效率约为(89.20±3.12)％和(88.62±3.25)％；半定量RT-PCR法、Western blot法及免疫荧光法结果均显示：Ad-Cx43-GFP转染后hUCBDSCs的Cx43mRNA表达相对量、Cx43蛋白表达量均高于空载病毒转染组，Quantity One软件收集整理Western blot结果，经SPSS13.0分析，差异有统计学意义(P<0.05)；GJIC功能结果显示：Ad-Cx43-GFP组荧光淬灭后40s时可恢复至接近淬灭前，而对照组荧光无法恢复。2.3Cx43基因修饰的hUCBDSCs对SUP-B15细胞增殖、凋亡的影响2.3.1CCK-8细胞增殖检测：Cx43表达水平的上调抑制SUP-B15细胞增殖，共培养72h后转染Cx43组SUP-B15细胞的增殖明显受抑制，相对增殖率为28%，明显低于SUP-B15单独培养组(53.6%)及空载病毒转染组(71.9%)，差异有统计学意义(p<0.05)。2.3.2流式细胞凋亡检测：转染Cx43的人脐血源基质细胞组SUP-B15细胞凋亡率(5.51±0.51％)明显高于未转染组(2.26±1.41%)和阴性对照组(2.97±1.58％)，差异有统计学意义(P<0.05)。2.3.3流式细胞周期检测： Cx43腺病毒转染组G0/G1期细胞比例约为66.43%，较单独培养组(81.54%)明显降低，但与未转染组的结果64.02%相近；Cx43转染组S期细胞比例为19.42%，与未转染组的19.36%相近。细胞周期检测数据经SPSS13.0软件处理结果差异无统计学意义。3.结论3.1成功建立人脐血源基质细胞及SUP-B15细胞株体外共培养模型；3.2Cx43基因的腺病毒可以成功转染hUCBDSCs，转染后Cx43表达水平上调，GJIC功能增强；3.3将Cx43基因修饰的hUCBDSCs与SUP-B15细胞接触共培养后：Cx43表达水平上调的hUCBDSCs抑制SUP-B15细胞增殖、促进其凋亡。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2014-04-01）
胡蕾[10]（2014）在《人脐血源基质细胞对造血损伤模型小鼠体内造血调控作用的研究》一文中研究指出目的：本课题采用密度梯度离心收集获得人脐血单个核细胞（mononuclear cells, MNCs），经过传代培养得到人脐血源基质细胞（humanumbilical cord blood-derived stromal cells, hUCBDSCs）、人脐血源间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCBDMSCs）；观察两类细胞形态结构、生长增殖特点，流式细胞仪技术测得两类细胞的表面抗原；经DiI标记后分别输注入造血功能损伤模型小鼠模型体内，动态检测小鼠静脉血红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白浓度，了解外周血血象恢复情况；动态检测两类细胞对骨髓造血微环境的修复情况，深入比较人脐血源基质细胞与其间充质干细胞恢复造血的能力，达到确立在临床可使用人脐血源基质细胞即可恢复造血这一理论体系提供了动物实验依据，解决了临床上因使用促造血生长因子带来的副作用及产生昂贵费用这一实际问题；也给长期探索早期造血恢复方法的血液学工作者带来了新的思路。方法：1.细胞分离与培养：采用密度梯度离心收集获得脐血单个核细胞，用DMEM/F-12、MSCM培养体系分别进行单个核细胞的体外培养，得到纯度较高的hUCBDSCs及hUCBDMSCs，倒置显微镜下动态观察两类细胞生长增殖情况及形态特点，利用流式细胞技术检测两类细胞表面抗原；2.DiI标记两类细胞进行示踪；3.建立小鼠造血损伤模型：X射线辐照BALB/c小鼠（总剂量5Gy，吸收率100cGy/min，时间5min，距离100cm）；4.实验分组：将造型损伤模型小鼠随机分为3组：hUCBDSCs组、hUCBDMSCs组、对照组；5.分别经小鼠尾静脉移植注入hUCBDSCs（1.0×106/只）、hUCBDMSCs（1.0×106/只）、生理盐水（0.2ml），动态记录叁组小鼠的精神状态、饮食情况等一般生理状态及生存状况，计算各组生存率；分别于3d、7d、14d取静脉血检测红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白，了解外周血血象恢复情况；3d、7d、14d分别进行骨髓涂片观察两类细胞在小鼠骨髓归巢情况、骨髓活检了解两类细胞对骨髓造血微环境损伤的修复作用；6.统计学分析：应用SPSS22.0统计分析软件对所获得的数据进行处理，计量数据以均数±标准差(ˉx±s)表示，各组间采用单因素方差分析，两组间数据比较应用t检验，检验水准α设定为0.05，P<0.05差异有统计学意义；计数资料采用率描述。结果：1.采用密度梯度离心可获得单个核细胞，经体外传代培养得到纯度较高的hUCBDMSCs及hUCBDSCs；MSCM培养体系培养原代细胞，24h后细胞呈不规则形、类圆形，分布均匀，胞体小，透明；48h后细胞贴壁，数量增多，部分细胞开始向两极伸展；7-12d细胞以梭形为主，集落样分布，细胞内颗粒少，透明，细胞间界限清楚；14-16d可铺满瓶底；传代后细胞形态一致，生长增殖较原代快，经1-2d潜伏期后进入对数生长期，呈均匀细长梭形，6-7d后进入平台期。F-12培养体系培养原代细胞，24h后细胞呈类圆形、不规则形，分布均匀，胞质透明；48h后细胞数量增多，贴壁生长；7-12d细胞集落样分布，形态多样，以类圆形、扁形为主，细胞间界限清楚，胞质透明，颗粒少；传代后细胞生长较原代快，经1-2d潜伏期后进入对数生长期，呈圆形或扁形，6d后进入平台期。两类细胞生长曲线变化趋势一致：传代后1-2d细胞处于潜伏期，生长增殖缓慢；48h后细胞指数增长，增殖、活力旺盛，进入对数生长期；6-7d后细胞生长增殖明显减缓，由对数生长期进入平台期。hUCBDSCs对数生长期前期增殖速度较hUCBDMSCs缓慢，后期增长速度快于hUCBDMSCs。2.流式细胞术检测细胞表面抗原的表达，hUCBDMSCs表达CD29、CD44、CD106、STRO-1，不表达CD34、CD45；hUCBDSCs表达CD44、CD45、Lm、Fn，不表达CD29、STRO-1，两类细胞表面抗原的表达与大量研究结果一致，证实DMEM/F-12培养体系可培养出hUCBDSCs，MSCM培养体系可培养出hUCBDMSCs。3.模型的建立：非致死剂量辐照BALB/c小鼠（剂量5Gy，能量6MeV，距离100cm，吸收率100cGy/min，时间5min），可造成小鼠急性造血功能损伤。4.DiI标记第叁代hUCBDMSCs、hUCBDSCs，两类细胞在激光共聚焦显微镜下显橙红色荧光；形态与普通倒置相差显微镜一致；两类细胞标记率均为100%。5.血象的恢复情况：动态监测血常规，结果显示移植后3d，叁组小鼠白细胞、血小板、红细胞计数及血红蛋白浓度均无显着差异(P>0.05)；移植后第7d，hUCBDSCs组及hUCBDMSCs组白细胞、血小板、红细胞、血红蛋白恢复情况均显着高于对照组(P<0.05)，且hUCBDSCs组白细胞、血小板、红细胞均显着高于hUCBDMSCs组(P<0.05)，血红蛋白无浓度明显差异(P>0.05)。移植后14d，hUCBDSCs组及hUCBDMSCs组白细胞、血小板、红细胞、血红蛋白恢复均显着高于对照组(P<0.05)，且hUCBDSCs组白细胞、血小板计数及血红蛋白浓度显着高于hUCBDMSCs组(P<0.05)，红细胞计数无明显差异(P>0.05)。6.两类细胞的归巢：动态监测骨髓示踪细胞，结果显示两类细胞均可在移植后期稳定定植于骨髓，且hUCBDSCs组较hUCBDMSCs组先归巢于骨髓(P<0.05)。7.骨髓病理切片：移植后3d叁组小鼠骨髓均出现造血功能抑制，有核细胞增生不良，非造血细胞比例增加；移植后7d叁组小鼠造血功较前均有恢复，有核细胞成簇分布，hUCBDSCs组、hUCBDMSCs组骨髓增生均优于对照组，且hUCBDSCs组优于hUCBDMSCs组；移植后14d对照组骨髓造血功能恢复情况较前无明显改变，hUCBDSCs组与hUCBDMSCs组造血功能明显恢复，有核细胞增生活跃，人脐血源基质细胞组可见大量巨核细胞。提示脐血干细胞移植可作为修复放/化疗后造血微环境损伤的一种安全有效方法，具有潜在的临床应用前景。结论：1.利用密度梯度离心，体外培养可获得高纯度的hUCBDMSCs及hUCBDSCs。2.hUCBDSCs、hUCBDMSCs移植入小鼠体内后，可明显促进白细胞、血小板、红细胞恢复，且hUCBDSCs恢复血象作用更强，骨髓抑制程度更轻。3.hUCBDSCs、hUCBDMSCs移植入造血损伤模型小鼠体内后，均可稳定定植于骨髓，且hUCBDSCs较hUCBDMSCs先归巢于骨髓；两类细胞对骨髓造血功能恢复均有明显促进作用，且hUCBDSCs优于hUCBDMSCs。(本文来源于《泸州医学院》期刊2014-04-01）
人脐血基质细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是支持和调节造血干细胞(haemopoietic stem cells,HSCs)生长发育的内环境,其结构和功能的完整是维系正常造血功能的重要因素。基质细胞作为HIM的核心组分,不仅通过形成HSCs生长发育的“龛”、分泌造血因子和细胞外基质等方式支持和调控HSCs自我更新与分化,还与多种血液系统疾病的发生、发展和预后密切相关。本课题组长期从事人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells,h UCBDSCs)及脐血造血微环境的研究。我们的前期体外研究证实h UCBDSCs具有造血基质细胞的基本生物学特征,能有效支持脐血CD34+细胞数量扩增;动物实验也表明,h UCBDSCs与造血细胞联合移植于辐照后裸鼠体内具有促进造血重建、修复受损微环境和减轻移植物抗宿主病(GVHD,graft-versus-host disease)的多重效应。然而随着研究的深入,我们发现h UCBDSCs存在移植后存活状况差和植入效率较低等问题,分析主要原因可能是在体外培养和体内输注过程中会面临营养缺乏、炎症反应和氧化应激等多种不良因素刺激。这些因素导致胞内自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量增加,细胞结构破坏和功能失调,进而造成细胞衰老、死亡或凋亡。线粒体是细胞内ROS的主要来源,也是最先被攻击的细胞器。线粒体ROS(mitochondrial ROS,mt ROS)的稳态调节是维系线粒体和细胞正常功能的关键所在。线粒体氧化应激,即mt ROS的产生与抗氧化防御之间的不平衡,将导致线粒体功能障碍及一系列相关疾病。为确保h UCBDSCs活力和移植疗效,研究如何提高细胞内源性抗氧化保护功能和维持mt ROS稳态调节的有效途径具有重要的理论价值和应用前景意义。人参是中医临床“补气要药”,已有数千年的临床用药历史。现代医学研究认为,人参皂苷是人参中主要的药理学活性成分,有多达几十种皂苷,人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,G-Rg1)是其中最重要的单体皂苷成分之一。本课题组和其他学者的研究证实,人参皂苷Rg1在抗肿瘤、抗炎症、抗衰老、抗糖尿病、抗神经原退化和促干/祖细胞增殖等方面有广泛药理学作用。近年来研究还发现,人参皂苷Rg1具有拮抗氧化致衰剂对多种器官和细胞的氧化损伤与促细胞凋亡作用,提示人参皂苷Rg1是人参中重要的抗氧化皂苷。课题组既往研究证明,人参皂苷Rg1不仅能促进骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)增殖分化与造血生长因子分泌,还能通过增强其在D-半乳糖诱导的应激条件下的抗氧化和抗炎能力以延缓细胞衰老。然而,人参皂苷Rg1是否对于氧化应激诱导的h UCBDSCs损伤与凋亡发挥一定的保护作用以及可能的分子机制尚未见相关报道。目的:在本研究中,我们体外分离、培养和扩增h UCBDSCs,并采用叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)损伤h UCBDSCs构建氧化应激损伤细胞模型,研究人参皂苷Rg1拮抗h UCBDSCs氧化损伤、促进细胞存活、抑制凋亡以及维持线粒体ROS稳态的重要作用,深入探索转录调控因子叉头框蛋白O3a(Fokhead box O3a,Fox O3a)介导的相关信号通路在人参皂苷Rg1发挥这些效应中的作用。旨在为阐释人参皂苷Rg1抗氧化效应的现代分子生物学机制提供新的理论依据;为提高h UCBDSCs临床移植治疗效果提供新的辅助手段。方法:1.体外分离、培养和扩增h UCBDSCs,采用t-BHP处理细胞构建氧化应激损伤体外模型。分别以不同浓度人参皂苷Rg1处理损伤后的h UCBDSCs,CCK-8法检测人参皂苷Rg1对h UCBDSCs细胞活力、细胞增殖的影响,在倒置相差显微镜下观察成纤维细胞集落形成单位(colony-forming unit of fibroblast,CFU-F)的形成。以试剂盒分别检测氧化应激相关指标,包括丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力。2.采用不同浓度人参皂苷Rg1分别处理t-BHP诱导的h UCBDSCs,流式细胞术检测细胞凋亡率,阐明人参皂苷Rg1对细胞凋亡的影响。Western blot法检测人参皂苷Rg1对t-BHP诱导的h UCBDSCs凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bim、Bax和Bcl-2)表达水平的影响。Western blot法检测Akt-Fox O3a信号通路在人参皂苷Rg1下调Bim蛋白表达水平中的作用,Western blot法检测人参皂苷Rg1对Fox O3a在h UCBDSCs中胞核/质转位的调节作用。3.采用不同浓度人参皂苷Rg1处理t-BHP诱导的h UCBDSCs,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)分别检测人参皂苷Rg1对总ROS和mt ROS生成的影响,利用LSCM检测人参皂苷Rg1对t-BHP诱导的h UCBDSCs线粒体膜电位(MMP,mitochondrial membrane potential)的影响。以试剂盒检测人参皂苷Rg1对锰超氧化物岐化酶(Mn-SOD)和过氧化氢酶(Catalase)活力的影响。采用CCK-8法、LSCM和相应试剂盒检测等方法明确Sirt1在人参皂苷Rg1阻抑线粒体氧化损伤中的作用,Western blot法检测AMPK-Sirt1信号通路在人参皂苷Rg1上调Fox O3a去乙酰化水平中的作用。结果:1.成功构建t-BHP诱导h UCBDSCs的氧化应激损伤体外模型研究发现,不同浓度t-BHP损伤h UCBDSCs后,细胞存活率随t-BHP浓度的增加而逐渐降低。在t-BHP浓度(80μM)处理细胞6 h时,细胞存活率降至(52±3.10)%,即IC50约为80μM。根据上述实验结果,以80μM剂量t-BHP处理细胞6 h的方法构建t-BHP诱导h UCBDSCs的氧化应激损伤体外模型。2.人参皂苷Rg1抑制t-BHP诱导的h UCBDSCs损伤和凋亡(1)在本研究涉及的浓度范围内,人参皂苷Rg1能浓度依赖的抑制t-BHP诱导h UCBDSCs的活力下降,当人参皂苷Rg1浓度为0.1、1、10和50μM时作用最为显着。人参皂苷Rg1(50μM)还对t-BHP诱导的细胞增殖下降和CFU-F形成减少具有明显的恢复作用,且对于正常h UCBDSCs也具有一定促增殖作用。(2)t-BHP损伤h UCBDSCs后MDA含量和LDH酶活性显着上升,而SOD酶活性明显降低。不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理均能显着降低MDA和LDH水平;当浓度为10μM和50μM时人参皂苷Rg1还能明显提高SOD的酶活性。(3)t-BHP损伤h UCBDSCs后凋亡率较正常组显着增加,而不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理均能够有效抑制t-BHP诱导的h UCBDSCs凋亡。人参皂苷Rg1(50μM)还能显着抑制促凋亡蛋白酶Caspase-3的活化、降低促凋亡蛋白Bim和Bax的表达及提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。3.Akt-Fox O3a-Bim信号通路在人参皂苷Rg1抑制凋亡中的作用人参皂苷Rg1(50μM)能激活Akt和Fox O3a磷酸化,促进Fox O3a由胞核向胞质转位,这一改变抑制了Fox O3a对下游凋亡诱导基因Bim的表达调控,进而下调了促凋亡蛋白Bim和Bax的表达,并上调了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。而人参皂苷Rg1作用能被PI3K抑制剂LY29004所抑制,提示Akt-Fox O3-Bim信号通路在人参皂苷Rg1阻抑t-BHP诱导h UCBDSCs的凋亡中发挥重要作用。4.人参皂苷Rg1减轻t-BHP诱导的线粒体氧化损伤(1)激光扫描共聚焦显微镜检测发现,t-BHP损伤h UCBDSCs后DCFH-DA荧光强度较正常对照组明显升高,提示胞内总ROS水平上升。不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理细胞后总ROS水平随着人参皂苷Rg1浓度增加而逐渐下降,表明人参皂苷Rg1能抑制t-BHP诱导的胞内活性氧水平提升。(2)激光扫描共聚焦显微镜检测发现,t-BHP损伤h UCBDSCs后Mito SOX Red红色荧光变强,线粒体O2·-水平明显升高。人参皂苷Rg1浓度依赖的抑制t-BHP诱导的线粒体O2·-增加,当其浓度为10μM和50μM时,O2·-水平显着低于t-BHP单处理组,提示人参皂苷Rg1具有降低线粒体活性氧水平的作用。(3)激光扫描共聚焦显微镜观察JC-1探针标记的h UCBDSCs,并采用红/绿色荧光强度的比值代表线粒体膜电位(Δψm)。结果表明,与正常对照组比较,t-BHP处理细胞后Δψm明显降低。不同浓度(1、10和50μM)人参皂苷Rg1处理细胞后Δψm随人参皂苷Rg1浓度增加而逐渐增加,提示人参皂苷Rg1能抑制t-BHP诱导的h UCBDSCs线粒体膜电位丢失。(4)t-BHP损伤h UCBDSCs后导致Mn-SOD和Catalase的酶活力下降,而人参皂苷Rg1处理能浓度依赖的提高这两种线粒体抗氧化酶的活力。当人参皂苷Rg1浓度为10μM和50μM时,Mn-SOD酶活力水平显着高于t-BHP单处理组;人参皂苷Rg1浓度为1、10和50μM时,Catalase酶活力较t-BHP单处理组有显着提高。结果提示人参皂苷Rg1可通过提高Mn-SOD和Catalase酶活力发挥线粒体抗氧化作用。5.AMPK-Sirt1-Fox O3a信号通路在人参皂苷Rg1调控线粒体活性氧水平中的作用(1)人参皂苷Rg1(50μM)能显着提高t-BHP诱导的h UCBDSCs细胞Sirt1的表达水平,且对于正常细胞Sirt1的表达也有促进作用。使用Sirt1的si RNA干扰后,人参皂苷Rg1对线粒体O2·-生成的抑制作用被明显减弱,Mn-SOD和Catalase酶活性降低,细胞活力也随之下降,提示Sirt1活化对于人参皂苷Rg1发挥线粒体抗氧化作用是必要的。(2)t-BHP损伤h UCBDSCs后磷酸化的AMPK、Sirt1表达及去乙酰化的Fox O3a表达水平均明显降低。与t-BHP处理组比较,人参皂苷Rg1(50μM)能显着促进AMPK磷酸化激活和上调Sirt1表达水平,进而提高Fox O3a去乙酰化水平。分别利用AMPK si RNA和Sirt1 si RNA干扰处理后,人参皂苷Rg1这一系列效应被抑制,表明人参皂苷Rg1能够通过激活AMPK-Sirt1信号通路促进Fox O3a去乙酰化,进而上调Fox O3a介导的Mn-SOD和Catalase两种酶的表达,发挥线粒体活性氧清除作用。结论:1.人参皂甙Rg1能够促进t-BHP诱导h UCBDSCs的存活、提高增殖能力,并通过调控Akt-Fox O3a-Bim信号通路在抑制细胞凋亡过程中发挥重要作用。2.人参皂苷Rg1通过清除过多mt ROS来保护h UCBDSCs免受t-BHP诱导的线粒体氧化损伤,而这一效应主要受到AMPK-Sirt1-Fox O3a信号通路的调控。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
人脐血基质细胞论文参考文献
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