A型肉毒毒素功能结构域表位抗原免疫保护作用与免疫保护机制研究

论文摘要

肉毒毒素（Botulinum neurotoxins,BoNTs）是肉毒杆菌生长繁殖过程中分泌的一种毒性蛋白,具有很强的神经毒性。根据其抗原性的差异,BoNTs可分成BoNT/A-G 7个类型,其中A、B、E和F型可致人中毒,C、D型仅致动物中毒,G型造成的中毒极少见。在已知的所有类型毒素中,BoNT/A是毒性最强的物质,成年人致死剂量为:注射0.090.15μg,吸入0.700.90μg,以及口服70μg。由于极强的毒性以及制备简单、运输方便等特点,BoNTs在国际上被列为A类生物战剂,更被列为六种最重要的生物战剂之一。BoNTs具有明显的序列同源性,因此它们的结构与功能相似:都是由一个轻链（L,分子量为50kDa）和一个重链（H,分子量为100kDa）组成,二者由二硫键连接。重链的羧基端（Hc,分子量为50kDa）为受体结合区,负责跟神经细胞受体结合,它由受体结合区C端（Hc-C,分子量为25kDa）和受体结合区N端（Hc-N,分子量为25kDa）这两个子域组成;重链的氨基端（HN,分子量为50kDa）为转运区,负责跨膜转运功能;轻链L为催化区,它是BoNTs结构域中研究最多的区域。BoNTs的中毒机制分为四个步骤:与靶细胞受体的识别结合,内化,催化结构域的跨膜转运和毒素活化,最后切割可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感分子附着蛋白受体（Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor Attachment protein receptor,SNARE）导致神经递质释放阻滞引起骨骼肌麻痹,致人呼吸衰竭而亡。疫苗接种是预防肉毒中毒的最有效策略,目前肉毒疫苗的研究主要集中在新型类毒素疫苗、新型重组亚单位疫苗、核酸疫苗等方面,其中最具研究前景的是新型重组亚单位疫苗。最理想的亚单位疫苗应该是能显著引起机体保护性免疫应答的最小抗原片段,从某种意义上讲,靶抗原的选择决定了免疫反应的特异性、保护性和效力。本实验以BoNT/A为对象,对其各功能结构域表位抗原的免疫效力进行研究,并探究其产生免疫保护作用的机制,为BoNT/A重组亚单位疫苗的研发提供基础数据和理论支持。本研究通过基因工程技术制备了BoNT/A各功能结构域抗原片段并连接到pTIG-Trx原核表达载体上,将构建好的质粒转入大肠杆菌系统中诱导表达,并通过Ni-NTA亲和层析法纯化得到了高纯度的重组抗原（如Hc、HN-L等）。免疫效力保护实验证明重组Hc、HN-L抗原免疫两次后能产生很好的免疫保护效力,可以完全抵抗住104LD50BoNT/A的攻击,血清中和效价测定值为6.6IU/ml,达到了高保护性效价水平。当Hc和HN-L抗原联用时,中和效价提升到了8.8IU/ml,表明两者联用可以起到一定的协同效果。通过ELISA方法检测抗体水平结果显示Hc和HN-L抗原免疫后均能诱导特异性水平抗体的产生,体现出了高体液免疫应答水平,表明通过大肠杆菌系统表达并纯化得到的重组Hc、HN-L抗原具有免疫原性。重组Hc-C、Hc-N、HN抗原作为亚单位疫苗经过加强免疫后也产生一定的免疫保护效力,中和效价测定结果达到了机体的保护性水平。而重组L、小片段sHN-L抗原免疫过后没有产生免疫保护效果,中和效价测定均<0.1IU/ml。另外,对免疫性较好的抗原进行单剂量依赖性免疫保护试验研究。结果表明Hc抗原单剂量免疫三周后对103LD50BoNT/A的半数有效剂量ED50约为0.125μg,HN-L抗原单剂量免疫三周后对103LD50BoNT/A的半数有效剂量ED50约为1.215μg,Hc+HN联合抗原单剂量免疫三周后对103LD50BoNT/A的半数有效剂量ED50约为0.285μg,Hc+HN-L联合抗原单剂量免疫三周后对103LD50BoNT/A的半数有效剂量ED50约为0.069μg。该单剂量依赖性实验结果证明Hc仍然是毒素亚单位疫苗最佳的靶抗原,其保护性相当全长毒素的免疫效果,可用于毒素亚单位疫苗研制。中和表位是抗原免疫的核心靶点,为了探究BoNT/A抗原片段的免疫保护机制,本实验从结合位点、空间结构和亲和力三方面进行了重组抗原片段上中和表位的研究。首先制备了BoNT/A的三株特异性中和抗体A1、A2、A3并进行了中和效力的检测,然后利用抗原与抗体在体内或体外均可以发生特异性结合的性质进行抗体与各重组抗原结合能力的测定,其ELISA和Western Blot结合能力鉴定结果表明:A1和A2两个抗体结合Hc和Hc-C抗原,不结合其他抗原,并且在变性或还原条件下均可以结合,表明它们所结合的中和表位位于Hc-C上,并且可能是线型表位;而A3只结合HN-L抗原,不结合sHN-L、HN和L抗原,并且也不与变性或还原的HN-L结合,表明它结合于HN-L的结合区,并且可能是构象表位。同时ELISA方法检测抗体亲和力结果表明抗原的免疫效力跟特定的中和表位相关。以上结果证明,Hc、HN-L抗原结构域上具有明确的中和抗体表位,能够诱导机体产生中和抗体和保护作用。此外,Hc-C+Hc-N和HN+L联合组相比完整Hc和HN-L抗原,没有产生明确的强免疫保护作用,这提示中和抗体表位需要完整的结构分子才能诱导产生中和抗体和保护作用。综上所述,本研究完成了BoNT/A各功能结构域表位抗原的制备与鉴定,并对各重组抗原的免疫保护效力及免疫保护作用机制进行了研究,结果表明BoNT/A各功能结构域表位抗原中,Hc和HN-L抗原片段具有最好的免疫原性和免疫保护性,重要的中和抗体表位主要集中在毒素分子的Hc和HN-L抗原上,其中Hc有两个,HN-L有一个。总之,Hc受体结合区分子具有合适的大小与制备的便利性,能够产生完全的免疫保护作用,具备比HN和HN-L更优的效力,以及与Hc+HN-L全长抗原相当的免疫保护作用,因此可以作为BoNT/A重组亚单位疫苗的理想靶抗原,用于研制重组毒素疫苗替代类毒素疫苗。

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缩略词汇

摘要

ABSTRACT

前言

1 肉毒毒素

2 肉毒毒素疫苗研究进展

3 本实验设计思路及研究内容

第一章 A型肉毒毒素功能结构域表位抗原的制备与鉴定

1 实验材料

1.1 主要试剂和耗材

1.2 主要仪器设备

1.3 溶液配制

1.4 菌株和载体

1.5 引物和片段合成

2 实验方法

2.1 表达载体的构建

2.2 重组抗原的表达及纯化

2.3 SDS-PAGE电泳检测

2.4 Western Blot免疫印迹法检测

3 实验结果

3.1 原核表达载体的鉴定

3.2 重组抗原的制备与鉴定

3.3 Western Blot免疫印迹法鉴定

4 讨论

5 小结

第二章 A型肉毒毒素功能结构域表位抗原免疫保护效力研究

1 实验材料

1.1 主要试剂和耗材

1.2 主要仪器设备

1.3 溶液配制

1.4 毒素与实验动物

2 实验方法

2.1 重组抗原免疫小鼠

2.2 A型肉毒毒素保护性实验

2.3 血清中和效价检测

2.4 血清抗体水平的检测

2.5 重组抗原剂量依赖性免疫

2.6 剂量依赖性免疫组毒素保护性实验

2.7 剂量依赖性免疫组抗体水平检测

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 免疫保护效力和抗体水平测定

3.2 剂量依赖性免疫保护实验和抗体水平测定

4 讨论

5 小结

第三章 A型肉毒毒素功能结构域中和抗原表位免疫保护机制研究

1 实验材料

1.1 主要试剂和耗材

1.2 主要仪器设备

1.3 溶液配制

1.4 抗体和细胞

2 实验方法

2.1 中和抗体的制备

2.2 抗体中和活性检测

2.3 抗原中和表位的检测

2.4 中和表位结构的检测

2.5 抗体亲和力的检测

3 结果

3.1 中和抗体的鉴定与活性测定

3.2 抗原中和表位的测定

3.3 中和表位结构的测定

3.4 抗体亲和力的测定

4 讨论

5 小结

总结

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘富甲

导师: 庞晓斌,余云舟

关键词: 肉毒毒素,结构域,重组抗原,免疫保护,功能表位,中和抗体

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 河南大学

分类号: R392

总页数: 72

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