D-乳酸脱氢酶的筛选及其生产D-丹参素的应用

论文摘要

丹参素（D-DSS）是中草药丹参特有的水溶性酚酸类化合物。大量研究表明,它具有广泛的生理药理学活性,临床上主要应用于扩张冠状动脉,抑制血小板凝集和心肌细胞凋亡,抗血栓形成,抗动脉粥样硬化,抗癌,抗炎,保护肝脏和增强免疫等。目前D-DSS的产量远远无法满足临床的需要,所以寻找高产量,高纯度的D-DSS的制备方法成为本研究的重点。本论文使用酶转化法来制备D-DSS,筛选D-DSS产量较高的D-乳酸脱氢酶（D-LDH）并进行了酶学性质的研究。同时研究了D-LDH和葡萄糖脱氢酶（GDH）共表达来实现辅酶的再生,利用全细胞催化产D-DSS。主要研究结果如下:（1）用实验室保藏的19株乳酸菌来催化3,4-二羟基苯丙酮酸（DPA）产D-DSS,比较它们各自转化生成D-DSS的产量,其中产量最高的菌株是罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri JN516。（2）对L.reuteri JN516的D-LDH进行分析,将预测的四个D-乳酸脱氢酶的基因分别命为d-ldh83871,d-ldh82948,d-ldh82319和d-ldh83931。将这些基因进行引物设计和分子克隆,与载体pColdII相连,然后在E.coli BL21（DE3）中低温诱导表达。发现D-LDH82319还原DPA活性较高。通过预测D-LDH82319的分子量为35 kDa,并且其催化生成的D-DSS的光学纯度达到100%。D-LDH82319的酶学性质:最适温度和pH分别为25°C和8.0;其对丙酮酸的催化活性较高;Ca2+和Ni2+促进其酶活,而Cu2+抑制酶活;当以NADH为辅酶时,D-LDH82319对于DPA有着最大亲和力(Km=0.09 mmol·L-1),同时以NADPH为辅酶时,D-LDH82319对于DPA有着最大亲和力(Km=0.10 mmol·L-1),因此表明D-LDH82319具有辅酶非特异性。（3）将D-LDH82319和来自Bacillus subtilis ATCC 13952的GDH（28 kDa）共表达,构建菌株E.coliBL21（DE3）/pColdⅡ-d-ldh82319-T7-gdh和E.coli BL21（DE3）/pColdII-gdh-T7-d-ldh82319,实现辅酶的再生。比较两种共表达菌株生成D-DSS的产量,结果表明:E.coli BL21（DE3）/pColdⅡ-d-ldh82319-T7-gdh的全细胞转化生成D-DSS产量较高,产量为15.6 g·L-1。（4）优化全细胞催化合成D-DSS的条件,最适转化条件:底物DPA浓度为2 g·L-1,葡萄糖浓度为1.5 g·L-1,温度为25°C,pH 8.0。在此条件下转化4 h,转化率最高可以达到95.93%。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王亚红

导师: 蔡宇杰

关键词: 丹参素,乳酸脱氢酶,罗伊氏乳杆菌,二羟基苯基丙酮酸,非特异性辅酶

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

分类号: Q93-33

总页数: 48

文件大小: 2084K

下载量: 69

相关论文文献

• [1].丹参素冰片酯乳剂中丹参素冰片酯和冰片的含量测定[J]. 中国药业 2012(03)
• [2].羟丙基甲基纤维素对丹参提取物缓释片中丹参素溶出的影响[J]. 中成药 2009(07)
• [3].丹参素防治脑缺血-再灌注损伤的机制及研究进展[J]. 中风与神经疾病杂志 2019(06)
• [4].丹参素对氧化低密度脂蛋白致血管平滑肌细胞增殖的影响和机制[J]. 中国病理生理杂志 2009(10)
• [5].抗生素联合丹参素川芎嗪葡萄糖注射液治疗缺血性结肠炎的临床效果[J]. 现代医学与健康研究电子杂志 2019(22)
• [6].丹参素酯类衍生物的合成及抗心肌缺血活性研究[J]. 海峡药学 2018(02)
• [7].丹参素衍生物的合成[J]. 西北大学学报(自然科学版) 2015(03)
• [8].丹参素改善子痫前期模型小鼠仔代发育的实验评价[J]. 南京中医药大学学报 2011(05)
• [9].丹参素在大鼠体内代谢产物的鉴定分析[J]. 中国中药杂志 2018(19)
• [10].丹参素冰片酯合成的工艺过程[J]. 黑龙江科学 2015(01)
• [11].离子液体辅助提取丹参中丹参素的工艺条件及机理[J]. 化工科技 2018(03)
• [12].丹参素的药理活性与药物动力学研究进展[J]. 中西医结合心血管病电子杂志 2018(11)
• [13].丹参素衍生物药理作用研究进展[J]. 中国药业 2014(11)
• [14].丹参素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用的机制研究[J]. 肝癌电子杂志 2018(02)
• [15].对丹参素药理作用的研究进展[J]. 当代医药论丛 2019(10)
• [16].毛细管气相色谱法测定丹参素冰片酯中有机溶剂残留[J]. 中国药业 2014(23)
• [17].RP-HPLC法测定丹参滴注液中丹参素含量[J]. 中国民族民间医药 2009(07)
• [18].HPLC法测定止痛化癥丸中丹参素的含量[J]. 中国中医药现代远程教育 2011(14)
• [19].干旱、盐胁迫处理对丹参无菌苗中丹参素含量的影响[J]. 中国中药杂志 2008(10)
• [20].丹参素在加温加速条件下的含量测定的教学体会[J]. 中国卫生产业 2017(36)
• [21].全新丹参素衍生物抗心肌细胞凋亡作用研究[J]. 中南药学 2012(06)
• [22].丹参素衍生物的研究进展[J]. 药学实践杂志 2011(02)
• [23].丹参素体外促进胚胎干细胞向心肌分化作用研究[J]. 创伤与急危重病医学 2019(04)
• [24].HPLC法测定情之怡片中丹参素的含量[J]. 食品工业 2019(08)
• [25].高效液相色谱法测定石斛合剂中丹参素的含量[J]. 福建中医药大学学报 2010(06)
• [26].“良关系”化合物丹参素冰片酯抗神经炎症作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志 2019(09)
• [27].丹参提取物浓缩干燥过程对丹参素含量的影响[J]. 时珍国医国药 2019(03)
• [28].丹参素对氧化低密度脂蛋白致血管平滑肌细胞凋亡的影响[J]. 时珍国医国药 2011(12)
• [29].丹参素在体外条件下对口腔鳞癌细胞CAL-27抑制作用的研究[J]. 口腔医学 2019(02)
• [30].丹参素对血管平滑肌细胞钙化和凋亡的抑制作用[J]. 中国医院药学杂志 2019(18)

标签：丹参素论文;  乳酸脱氢酶论文;  罗伊氏乳杆菌论文;  二羟基苯基丙酮酸论文;  非特异性辅酶论文;